测绘在细胞膜分子扩散，多目标跟踪（MTT）
2012年5月27日
多目标跟踪是一个自制的算法跟踪单独标记分子在活细胞的细胞膜。有效地检测，估计和跟踪在高密度的分子随着时间的推移，提供一个用户友好，全面的工具来研究纳米膜动力学。
Hi.In 本视频中，我们展示了一个完整的单量子跟踪实验。一种专用算法完全是与 ISIS 图像专家合作构思的。在本视频中，我们将使用表皮生长因子受体作为模型来描述该技术的方法。
表皮生长因子受体是一种跨膜蛋白。该受体将使用单克隆抗体进行标记，该抗体被还原以仅保留 A a B 片段。A a B 片段被生物素化，之后，与量子点的链霉亲和素相连，壁系统将精确识别 EGF 受体。
我们的目标是提供细胞表面受体动力学的全面视图。事实上，分子轨迹可以通过限制在纳米域内而偏离 brot 扩散。例如，这可能是与信号伴侣或分子支架等潜在相互作用的特征。
我们的目标是通过在细胞上映射这些事件来详尽地描述这些事件，这需要在高 SPECT 时间分辨率和高标记密度下工作。因此，我们将这种方法命名为多目标跟踪。实验的第一步是样品的制备。
我们研究的是不含抗生素的活细胞。这里我们使用 cost 7 个细胞，它们内源性地表达 EGF 受体。分离细胞后，我们需要精确确认，以便在实验室的 h well 中拥有相同数量的细胞。
精确的细胞数量对于提高每个细胞量子点数量的可预测性非常重要。将细胞分配到 H 中后，您需要在 37 度和 7% 的 CO2 下孵育 labate 24 小时。下一步是制备与抗体偶联的量子点。量子点是小的荧光纳米颗粒。
这些颗粒在这里引起了人们的极大兴趣，因为与传统的荧光探针和信号相比，它们非常明亮和稳定。鼻子比例对于这种类型的实验非常重要。在这种情况下，我们使用完全培养基来饱和量子点周围的条带状结构并防止聚集。
之后，我们将 bioTE 兴奋蛋白或目标抗体中的量子点以 1：1 的比例计算，以便在统计上获得更多的单价量子点。在这个实验中，我们使用了针对实验室中从单克隆抗体产生的 EGF 受体的 a b 片段，这些片段以生物素为靶点。在大约 15 分钟的孵育过程中，您可以使用摇床以每分钟 1， 200 转和 2 5 度的速度保持对照处于聚集和均匀性。
混合物准备好后，您可以将其添加到细胞中。非常轻柔地从孔中取出培养基，以防止细胞在实验室技术人员上脱落，并添加实验所需量的混合物。在这种情况下，我们将在每孔中添加 100 μL 的混合物。
添加混合物后，您可以将细胞孵育 15 分钟。在这种情况下，在 37 度和 7% 的 CO2 下。孵育后，您可能会发现培养基上悬浮着大量频繁的双点。
这些量子点应在成像前去除。因为我们带来的噪音。这就是为什么我们需要洗每辆车，在这种情况下要洗几次，洗五次才能洗自己。
使用具有非自发荧光的成像介质。这里我们使用 HBSS 缓冲区和 aps。现在您的细胞已准备就绪。
是时候进行收购设置了。该装置由四个主要部分组成，一个倒置显微镜、一个具有眼睛灵敏度的相机、一个强大的汞灯和一个将细胞保持在 37 度的培养箱。汞灯的光穿过光纤和滤光片轮，然后照射样品。
样本的流感 eSense 由左侧的 E-M-C-C-D 摄像头过滤和收集。我们目前使用 1.3 和 1.49 数值孔径油商的物镜。这个实验的中心步骤是本身的采集。
一旦细胞聚焦，我们就会查看具有强标记的代表性细胞。在量子点中，我们首先在透射白光下获取单个图像，该图像可以进一步用于检查 LA 足部的细胞面和特殊极限。然后，我们通常以 36 毫秒的速率采集视频，这是全帧中允许的最快速率。
我们使用电子倍增 CCD 来达到单分子灵敏度，并且具有至少 20 分贝以上的足够信北比。通常在 25 分贝左右，我们通常会获得 300 帧。要评估给定的数据集，您只需提供包含视频文件的目录的通行证。
然后键入命令，文本在 MetLab 中重新连接，或者命令 MTT 23 I，首先显示图形界面列表。使用的所有参数都将开始全自动分析。在每一帧上执行核心 MTT 分析，调用三个主要任务，首先检测每个像素是否存在目标量子债务。
然后，对于每个检测目标的相关参数，例如其像素位置、信号强度等。上次重新连接新目标。每个像素的跟踪已经在前一帧的基础上构建。
考虑到一个局部子区域，我们比较了两个假设存在，要么只有噪声，要么是一个信号。借助点扩散功能，ModuLite 具有 hin 峰值。我们使用阈值来确保足够低的误报，对于每个检测到的目标，每帧的 perus 检测少于一个。
接下来，我们执行最小二乘幽灵营养脚，以估计检测到的 Goshen 的位置、宽度和高度。这显著提供了染料的 spic 单元位置，通常约为 10 到 20 纳米，对于典型的信噪比，高密度峰通常可能过于封闭，而强峰可能会阻碍最弱的峰处理。我们将从初始图像运行中检测到的峰放气。
同样，对残差的检测通常会重新偏斜 10% 的峰。达到几乎详尽的检测对于准确重新连接非常有益。然后，新目标集与此瞳孔的先前跟踪集匹配。
为了尽可能将每条跟踪分配给目标并处理可能的闪烁，我们使用从检测步骤获得的所有可用统计信息。因此，目标不仅分配给最近的跟踪。在冲突的情况下，当轨迹可能交叉时，这意味着各自的相关研究区域重叠，我们将考虑轨迹和目标的强度、速度、宽度和闪烁的统计值。
这将提供统计上最佳的重新连接分数。该策略允许尽可能避免，将重新连接偏向最近的邻居，即最慢的运动。接下来，我们使用一个函数来评估轨迹内可能的瞬态限制。
该函数与 Sexton Simpson 及其合作者建立的局部扩散成反比。应用阈值允许定义受限或不受限的发作。通过迭代这些整体轨迹，我们最终可以根据瞬态限制、减速证据来绘制膜动力学，这可以表示出来。
或者，使用此约束指数的二进制或离散值，默认情况下，MTT 将自动执行这些任务，为每个视频保存 eski 文件中每个峰的行参数，以及用于进一步高级调查。典型结果，例如每个单元的轨迹图和感兴趣参数、峰强度、信噪比、局部缺陷值的直方图，因此这方面也可以很容易地适应任何专门的研究。本视频现在将总结 MTT 获得的典型结果。
工作的大部分在于阐述算法，这可能需要适应专门的研究，例如痛苦的运动或交互模式。但是运行 MTT 非常简单。用户只需优化 Space 和 Time limit 等少数参数即可。
在阐述 MTT 时，我们的目标是完全重新考虑用于每项任务的分析选项。我们沿着两个具有挑战性的轴线优化流程。首先，处理高密度以在表面获得最佳特殊信息，其次，处理弱 SNR，这通常允许在低消除和高速限制下工作，可以解释为潜在交互的特征。
例如，膜受体可能与膜下细胞骨架或前脂质结构域相互作用。此类事件可以通过空间和时间的限制变化来研究。动态措施可以与 FRA F、C 或货运等互补方法进行比较。
开源代码可用于学术研究。如果 S fr 为，可以从我们团队页面上的 CML dot univ 网页下载，该网页提供了下载链接。也欢迎有兴趣的行业与我们联系。
我们要特别感谢我们团队的成员和公共设施的支持和富有成效的讨论。该项目得到了 CNRS 在 c MAA University Pac Region National de La 的资助，Foundation Medical 得到了联盟控制者的支持。感谢观看。
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概述
本文介绍了一种用于追踪活细胞等离子膜内单独标记分子的新型算法。该方法以表皮生长因子受体作为模型，为研究纳米尺度膜动力学提供了一种全面的工具。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 表皮生长因子受体是一种跨膜蛋白。
- 追踪分子动力学对于理解细胞过程至关重要。
- 高密度分子的检测和追踪提高了实验的准确性。
- 与图像分析专家的合作改进了算法开发。
研究目的
- 开发一种用户友好的分子追踪算法。
- 研究膜蛋白的纳米尺度动力学。
- 利用表皮生长因子受体作为该技术的模型。
使用的方法
- 开发专用的追踪算法。
- 用单克隆抗体标记表皮生长因子受体。
- 对抗体片段进行生物素化以便于量子点连接。
- 利用先进的成像技术进行数据收集。
主要结果
- 该算法成功实时追踪标记分子。
- 高密度检测允许对膜动力学进行详细分析。
- 该方法提供了对跨膜蛋白行为的洞察。
- 与专家的合作提高了研究结果的可靠性。
结论
- 开发的算法对于追踪膜蛋白是有效的。
- 这种技术可以推进对细胞动力学的理解。
- 未来的应用可能包括各种跨膜蛋白。
常见问题
Executive Industry Relevance
Mapping molecular diffusion in the plasma membrane enables precise characterization of receptor dynamics, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. By providing high-density, single-molecule tracking data, Multiple-Target Tracing (MTT) enhances predictive confidence in understanding protein interactions and confinement events critical for signaling pathway analysis. This approach addresses a key discovery-stage challenge: obtaining quantitative, spatially resolved insights into membrane organization that inform lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping receptor localization, mobility, and confinement patterns at nanometer scale.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of receptor interactions with signaling partners or scaffolds.
- Predictive Value: Generates quantitative descriptors such as diffusion coefficients and confinement indices to assess target behavior under physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline receptor dynamics in live cells.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through high-density detection and algorithmic trace reconnection.
- Scalability: Facilitates platform reuse across membrane protein targets due to MTT’s applicability at any scale, from molecules to cells.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase membrane dynamics to preclinical validation by enabling comparison of receptor behavior across model systems.
- Mechanistic De-risking: Identifies confinement variations that may reflect underlying interactions with cytoskeleton or lipid domains, reducing ambiguity in target mechanism.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides dynamic measures that complement complementary approaches like FRAP or FCS for informed go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
MTT fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, offering a reusable capability for studying membrane protein dynamics across multiple projects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying receptor confinement, slowdown, and interaction signatures in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through high spatiotemporal resolution and quantitative outputs like peak intensity and signal-to-noise ratio.
- Analytics: Provides statistical outputs including local diffusion values and confinement indices that enable cross-condition comparison and trajectory classification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing dynamic measures to be compared with orthogonal techniques for target validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a standardized tracking algorithm applicable to diverse transmembrane proteins, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct nanoscale observation of receptor dynamics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated peak detection, estimation, and reconnection with deflation to handle high-density labeling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by supplying quantitative, replication-ready data that reduce late-stage biological risk in target advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by delivering dynamic membrane phenotype data that inform target selection and resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule videomicroscopy and image analysis for optimal setup and parameter tuning.
- Depends on instrumentation capable of high-speed, low-noise acquisition, including EM-CCD cameras and mercury lamp illumination.
- Necessitates cross-team standardization of labeling protocols, quantum dot conjugation, and imaging conditions for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying MTT to different model systems or membrane protein targets beyond EGFR.
- Includes practical limitations such as the need for high labeling density and manageable signal-to-noise ratios to ensure accurate peak detection and trace reconnection.
