从细胞提取物中分离和鉴定核糖核蛋白复合物中mRNA、microRNA及蛋白质组分的RIP-Chip方法

摘要

通过RIP-Chip分离和鉴定RNA相关复合物的逐步实验方案。

摘要

由于高通量测序和高效微阵列分析技术的发展，全基因组基因表达分析已成为一种简便且易于获取的数据收集形式。然而，在许多研究和疾病模型中，靶基因mRNA的稳态水平并不总是与蛋白质的稳态水平直接相关。转录后基因调控很可能是导致两者差异的原因。RNA结合蛋白（RBP）通过与靶mRNA结合形成核糖核蛋白（RNP）复合物，从而调控mRNA的定位、稳定性和翻译，实现转录后调控。从细胞提取物中鉴定RNP复合物内此前未知的从头合成mRNA靶标，对于理解RBP的作用机制、功能及其对蛋白质表达的影响至关重要。本实验方案介绍了一种称为RNP免疫沉淀-微阵列（RIP-Chip）的方法，可在不同实验条件下鉴定与核糖核蛋白复合物特异性结合的mRNA，并为研究人员提供进一步优化实验的可选方案。借助这一重要的实验工具，研究人员能够深入探索转录后基因调控的复杂机制以及其他核糖核蛋白相互作用。

方案

实验准备

开始实验前，确保所有试剂、容器和器皿均无RNase污染至关重要。将玻璃器皿用RNase抑制剂（RNaseZAP，Ambion）处理，随后用经DEPC处理的水冲洗。确保所有试剂均已确认为无RNase。

1. 制备mRNP裂解液

1. 培养并收获处于指数生长期的组织细胞，为每次RNA免疫沉淀（RIP）实验制备2-5 mg的总蛋白。
   1. 通常两个P150培养皿即足够。
   2. 针对每个待研究的RNA结合蛋白（RBP），必须优化细胞总数和蛋白量，以最大化目标mRNA与RBP之间的相互作用。
   3. 用于qRT-PCR分析的RIP可能需要较少的细胞裂解物（约400 μg总蛋白），因其检测方法具有扩增特性，尤其适用于HuR、AUF1、TIAR等高丰度RBP。
2. 在4 °C条件下，以200 × g离心8-10分钟收集细胞，随后用预冷的PBS洗涤三次。
3. 最后一次洗涤后，轻轻弹击离心管底部，将细胞沉淀重悬于等体积的预配多聚核糖体裂解缓冲液（PLB）中，其中含有RNase和蛋白酶抑制剂。
   1. 建议准确测量细胞沉淀的体积。
4. 轻柔吹打混合液（切勿涡旋），以分散细胞团块，并将裂解物置于冰上孵育5分钟。
5. 在4 °C条件下，以13,000 × g离心20分钟，去除裂解物中的不溶性碎片。
6. 立即转移澄清的上清液至预冷的微量离心管中。
7. 保持在冰上，并储存于-80 °C。
   1. 立即冷冻可确保细胞充分裂解，并防止非特异性结合。样品解冻后应立即进行RIP实验，且操作过程中始终保持样品在冰上，以避免RNA降解。
   2. 该裂解物可在-80 °C下保存长达六个月。避免反复冻融，以免导致蛋白和/或mRNA降解。
8. 使用标准Bradford蛋白定量法测定裂解物中的蛋白浓度。

2. 用抗体包被蛋白A琼脂糖珠并洗涤

1. 预先在含有5% BSA的NT2缓冲液中（3-4倍体积）于4 °C下孵育蛋白A Sepharose（PAS）珠过夜。4 °C保存。
   1. 添加 0.1% 叠氮化钠后，可在 4 °C 下长期保存数月。
   2. 应根据目标RBP抗体的同种型选择相应的Protein Sepharose磁珠。Protein A、Protein G及Protein A/G对不同同种型的抗体具有特异性，且结合亲和力各异。本实验根据HuR蛋白抗体的同种型特异性及亲和力，选用Protein A Sepharose磁珠。
2. 使用前去除多余的NT2缓冲液，使磁珠与缓冲液的最终比例为1:1。
3. 使用无RNA酶的1.5 ml微量离心管，取100 μl PAS悬液，并为每个单独的免疫沉淀反应加入30 μg抗体（即，特异性RBP和同型对照）。
4. 向抗体-磁珠混合物中加入 100–200 μl NT2 缓冲液。
   1. 添加0.1%叠氮化钠后，混合物可在4 °C下保存数周。
   2. 应平行使用同型匹配的抗体或同一物种的正常全血清作为抗体对照，以排除背景RNA的干扰。
5. 向珠子混合物中加入适量抗体，4 °C 条件下翻转孵育过夜。
   1. 针对所研究的特定蛋白质优化抗体滴度（通常使用 1、5、10 或 30 μg 抗体即足够）。
6. 使用前立即制备抗体包被的磁珠，用1 ml预冷的NT2缓冲液重复洗涤5次。
   1. 4 °C下以13,000 × g离心1-2分钟，洗涤珠子混合物。
   2. 用移液器或抽吸装置小心地尽可能吸除上清液，注意避免扰动沉淀物。
   3. 洗涤有助于从抗体混合物中去除未结合的抗体以及RNase污染物。
7. 最后一次洗涤完成后，将磁珠重悬于700 μl预冷的NT2缓冲液中，随后加入多种RNase抑制剂以保护目标mRNA，包括40 U/μl的RNase Out 10 μl、100 mM DTT 10 μl和EDTA（15 mM）15 μl。用NT2缓冲液将总体积补至1,000 μl。
   1. 由于EDTA的抑制作用，不使用钒酸核苷复合物。

3. 免疫沉淀与RNA沉淀

1. 可选预清除步骤：
   1. 为降低背景，可使用珠子和对照抗体对裂解液进行预清除。此步骤可能会降低最终产物中的信号强度。
   2. 在进行免疫沉淀（IP）后接微阵列分析时，该步骤可能有助于减少背景信号；但在IP后接qRT-PCR分析时通常无需此步骤。
   3. 加入15 μg同型对照抗体，于4 °C轻轻翻转孵育30分钟。
   4. 加入50 μl来自步骤2.1的预溶胀但未包被抗体的PAS珠子。
   5. 于4 °C翻转孵育30分钟。
   6. 在4 °C下以10,000 × g离心，保留上清液用于后续免疫沉淀。
2. 将100 μl已分离并澄清的裂解液（约2–5 mg）加入预先准备好的抗体混合物中。
   1. 稀释裂解液有助于降低背景信号和非特异性结合。
   2. 裂解液的加入量可根据检测方法、RNA结合蛋白（RBP）的丰度或RBP抗体的效率（见步骤1.1.c）进行调整。
3. （可选）立即轻弹管壁数次以充分混匀，随后在4 °C下以10,000 × g短暂离心，使珠子沉淀，立即吸取100 μl上清液作为总输入mRNA样本，用于后续qPCR分析（采用标准RNA提取技术）。
   1. 此步骤用于确认输入裂解液中的RNA是否适合进行免疫沉淀，仅应在验证实验或RIP结果RNA质量不佳时作为排查步骤执行。
4. 用封口膜包裹离心管以确保密封，于4 °C翻转孵育2至4小时。
   1. 孵育时间应根据目标蛋白的丰度进行优化，并应尽量缩短以避免复合物重排或降解。对于某些RNA结合蛋白，较短的孵育时间可能更优。
5. 在4 °C下以5,000 × g离心5分钟，收集上清液可用于后续Western blot分析。分装后储存于-80 °C。
   1. 若上清液分装样本中含有较高量的残留目标蛋白，可能表明该蛋白未能被琼脂糖珠子有效沉淀。
6. 参照前述方法，用1 ml冰冷新配的NT2缓冲液洗涤珠子5次，每次洗涤后在4 °C下以5,000 × g离心5分钟，随后用手持移液器或抽吸装置去除上清液。
   1. 为降低背景信号，可采用更严格的洗涤条件，例如在NT2缓冲液中添加脱氧胆酸钠、尿素或SDS。
   2. 尽可能将样品保持在冰上，并快速操作以最大限度减少目标mRNA的降解。
7. 可选：保留少量珠子混合物（10%）或平行运行额外样品，用于通过Western blot分析检测目标蛋白的免疫沉淀效率。

4. DNase 和蛋白酶 K 处理

1. 洗涤后，用 100 μl 添加了 5 μl 无 RNase 的 DNase 1（2 U/μl）的 NT2 缓冲液重悬珠子。
2. 在 37 °C 下孵育 5–10 分钟。加入 1 ml NT2 缓冲液，在室温下以 5,000 × g 离心 1 分钟。
   1. 可取少量珠子（约 10%）用于通过 SDS-PAGE 分析检测免疫沉淀效率。
3. 将 PAS 沉淀重悬于 100 μl NT2 缓冲液中，加入 5 μl 蛋白酶 K（10 mg/ml）和 1 μl 10% SDS。
4. 将重悬的珠子混合物在 55 °C 水浴中孵育 30 分钟，每隔 10 分钟轻轻弹动一次。
   1. 蛋白酶 K 有助于释放 RNP 组分。
5. 在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟使珠子沉淀，收集上清液（约 100 μl）。
6. 向珠子中加入 200 μl NT2 缓冲液，在室温下以 5,000 × g 离心 2 分钟，收集上清液（约 200 μl），弃去珠子。
7. 合并上清液（100 μl 和 200 μl），加入 300 μl 酸性酚-CHCl₃ 的下层液体。
8. 涡旋混匀 1 分钟（室温），或在 37 °C 摇床上振荡，然后在室温下以 16,000 × g 离心 1 分钟。
9. 吸取 250 μl 上层液体（切勿搅动界面），加入 25 μl pH 5.2 的醋酸钠、625 μl 100% ETOH 和 5 μl glycoblue，充分混匀。
10. 在 -20 °C 下过夜保存。
    1. 为确保 RNA 的有效回收，加入 glycoblue 可作为载体分子，提高 RNA 沉淀的可见性。
11. 次日，将管子颠倒混匀 3–5 次，在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 30 分钟，弃去上清液。
12. 向蓝色沉淀中加入 1 ml 70% ETOH，通过倒置或涡旋混匀。
13. 在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 2 分钟。
14. 弃去上清液，再在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 1 分钟。
15. 用移液器去除残留的 70% ETOH，在室温下空气干燥沉淀 5 分钟。
16. 根据需要，用 20–40 μl 无 RNase/DNase 的水或其他适当体积的溶液重悬沉淀。
    1. 样品现在可用于后续下游应用，如 qRT-PCR 或微阵列分析。
    2. 可使用 Nanodrop 分光光度法评估样品浓度；但对于珍贵样品，建议避免使用 Nanodrop，因其可能造成浪费且准确性相对较低。我们建议通过归一化看家基因转录本以评估珍贵或低产量样品的纯度和免疫沉淀效率。

5. 代表性结果

如果实验步骤经过优化并正确操作，免疫沉淀应能显著富集mRNA靶标。通常，根据RNA结合蛋白（RBP）及其mRNA靶标的种类不同，通过qRT-PCR检测可观察到约10至50倍的富集效果。利用微阵列分析可大规模发现RBP的多种靶标。然而，与qRT-PCR相比，该方法对RNA降解更为敏感。根据RBP的种类、靶标数量以及反应效率的不同，微阵列可能揭示数百个新的靶标，也可能仅发现少数甚至无显著靶标。例如，研究较为深入的RNA结合蛋白HuR可在转录后水平调控许多重要生理基因的表达与翻译^{1, 2}。以乳腺癌细胞系为例，通过RIP-Chip技术分离HuR-核糖核蛋白复合物，qRT-PCR结果显示多个已知的重要HuR靶标被富集，其中包括β-actin（见图1）。在两种癌细胞系中，β-actin均被富集了12至15倍。通常情况下，若操作得当，在多种细胞系中均可观察到β-actin的显著富集。然而，若RIP实验未能显示β-actin的显著富集，则提示实验过程存在问题，可能需要重复实验。此外，对这些细胞系免疫沉淀样品进行微阵列分析发现，在雌激素受体（ER）阳性的MCF-7癌细胞与ER阴性的MB-231乳腺癌细胞系之间，HuR靶标的表达谱存在明显差异（见图2 ¹）。这些靶标可分为多个类别：包括已知和未知的HuR靶标，其中部分与癌症相关，部分无关。例如，CALM2和CD9均为此前未被识别为HuR靶标的癌症相关基因。通过微阵列分析并结合qRT-PCR验证，发现CALM2和CD9在HuR沉淀物中富集了5至180倍，表明HuR蛋白与这些靶基因之间存在显著的相互作用。

图1. 在MB-231（ER-）和MCF-7（ER+）乳腺癌细胞中进行的免疫沉淀与RIP分析。 使用抗HuR单克隆抗体（3A2）及IgG1同型对照，从MB-231或MCF-7细胞裂解液中进行免疫沉淀。A. 使用3A2抗体进行IP后的Western印迹检测到预期大小的HuR条带。右侧图示显示了两种细胞系输入裂解液中的HuR蛋白量，以β-微管蛋白作为上样对照。B. 通过定量RT-PCR验证，发现已知HuR靶标β-肌动蛋白在MB-231和MCF-7细胞的3A2免疫沉淀样品中分别富集了15倍和11倍。所有ΔΔCT值均以GAPDH为参照进行标准化。实验重复两次（n = 2）。

图 2. HuR RIP-CHIP 鉴定出 ER+ 和 ER- 乳腺癌细胞中不同的基因表达谱。 使用 HuR 抗体及 IgG1 同型对照从 MB-231 或 MCF-7 细胞裂解液中进行 HuR 免疫沉淀，并杂交至 Illumina Sentrix 芯片（47,000 个基因）。减去对照信号。结果来自 12 张不同芯片的累积数据。每种细胞系的实验均设置三重复（n = 3），并配有相应的对照。坐标刻度为 log2。

讨论

由于本实验的特性，优化过程和实践经验是成功获得预期结果的唯一可靠保障。在该实验流程的多个步骤中，温度控制以及对试剂和产物的有效操作至关重要。合理规划并规范执行操作技术，有助于确保实验在推荐的最佳温度条件下于适当的时间范围内完成。RNA分离实验的一个主要问题是RNA极易被RNase降解。所有试剂必须无RNase，并须储存在无RNase的容器中或使用无RNase的容器进行操作。这是确保mRNA样品完整性的关键步骤。然而，即使实验操作正确，也可能因RNA结合蛋白（RBP）与其靶mRNA之间相互作用的特性而无法达到预期结果。

一个可能的问题是，通过RIP-Chip分离的RNA信号较低甚至无信号。尽管总RNA可能有信号，但这可能是由于磁珠拉下的结合蛋白量不足所致。首先应排查的问题是确认所用的细胞裂解液中该特定RNA结合蛋白（RBP）的表达量是否充足。在确认表达正常后，可在最后一次NT2洗涤后将蛋白沉淀物分离，并重悬于Laemmli缓冲液或其他合适的变性缓冲液中，在95 °C加热5分钟。随后可对这些样品进行Western印迹分析，同时结合输入裂解液样品及阴性对照，以确认目标蛋白已被充分拉下。

此外，由于需要裂解细胞才能获取这些组分，原本分隔存在的蛋白质与 mRNA 之间可能发生异常且非预期的相互作用。这些相互作用可能通过非特异性结合“吸附”目标 mRNA 或结合蛋白，从而降低其可用性。另外，在不同条件下，蛋白质可能形成多种折叠构象，导致其结合基序无法与目标 mRNA 接触，进而阻碍二者相互作用。上述因素均凸显了高效操作以及采用推荐的最佳温度条件以减少非特异性相互作用的重要性。此外，针对每种特定目标蛋白优化洗涤条件对于提高相互作用复合物的纯度至关重要，可能需要更严格的洗涤条件。例如，可在洗涤缓冲液中添加 SDS 或适量尿素，以降低非特异性结合和信号背景。具体条件完全取决于实验者所研究的目标 RNA 结合蛋白（RBP）及其在特定生理环境下的目标 mRNA。某些条件可能不适用于特定的 mRNA 分析工具，因此在样品制备过程中应予以注意。

尽管RIP在富集RNA-蛋白质相互作用方面已取得成功，但RIP（CHIP）方法一个众所周知的局限性在于无法鉴定RBP在瞬时mRNA靶标上的特异性结合区域。可采用多种交联技术结合RIP来分离独特的序列靶标；然而，短波紫外光的使用往往会导致核酸损伤。一种名为PAR-CLIP（光活化核糖核苷交联与免疫沉淀）的新方法利用长波紫外光将硫代尿苷掺入新生RNA，从而能够从稳定和瞬时的RNA相互作用中识别出独特的结合位点。

总体而言，RIP-Chip 已被我们研究团队以及许多其他研究团队确立为一种优秀的工具，用于分离和研究 RNA 结合蛋白与其 mRNA 靶标之间的相互作用。尽管该方法在本质上和操作上较为敏感，但只要正确执行，即可成功分离这些 RNP 复合物，而这些复合物直到最近仍难以被发现和分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M 二硫苏糖醇	Fisher	BP172-5	DTT
DNase 1	Ambion	2235	RNase free
乙二胺四乙酸	Fisher	BP118-500	EDTA
糖原	Ambion	9516
1 M HEPES	Sigma	H3375-100G	pH 7.0
Igepal Nonidet P-40	USB	78641	NP40
1 M KCl	Fisher	BP366-500
1 M MgCl2	Fisher	BP214-500
NT2 缓冲液	*见下文
多聚核糖体裂解缓冲液	*见下文
蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche	11873580001
Protein A Sepharose Beads	Sigma	P3391
蛋白酶K	Fisher	BP1700-100
RNase Out RNase抑制剂	Invitrogen	10777-019	40 U/μl
1 M NaCl	Fisher	BP358-212
十二烷基硫酸钠	Fisher	BP166-500	SDS
1 M Tris-HCl	Fisher	BP153-500	pH 7.4
Trizol	Invitrogen	15596-026
钒酰核糖核苷复合物	New England Labs	S1402S	VRC
试剂配制
在无RNase/DNase、经DEPC处理的玻璃器皿中配制试剂
多聚核糖体裂解缓冲液
100 mM KCl
5 mM MgCl2
10 mM HEPES (pH 7.0)
0.5% NP40
1 mM DTT
100 单位/毫升 RNase Out
400 μM VRC
蛋白酶抑制剂混合片剂
5 ml 多聚核糖体裂解缓冲液
加入 50 μl 1 M HEPES (pH 7.0)
500 μl 1 M KCl
25 μl 1 M MgCl2
25 μl NP40
4.7 ml 无RNase-DNase的H2O
50 μl 1 M DTT
12.5 μl 100 U/ml RNase Out
200 μl 蛋白酶抑制剂混合液（按制造商说明溶解）
10 μl 200 mM VRC（使用时加入）
NT2 缓冲液
50 mM Tris-HCl (pH 7.4)
150 mM NaCl
1 mM MgCl2
0.05% NP40
1 L NT2 缓冲液
50 ml Tris (pH 7.4)
30 ml 5 M NaCl
1 ml 1 M MgCl2
500 μl NP40
820 ml 无RNase-DNase的H2O