通过RIP-Chip分离和鉴定RNA相关复合物的逐步实验方案。
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摘要
摘要
由于高通量测序和高效微阵列分析技术的发展，全基因组基因表达分析已成为一种简便且易于获取的数据收集形式。然而，在许多研究和疾病模型中，靶基因mRNA的稳态水平并不总是与蛋白质的稳态水平直接相关。转录后基因调控很可能是导致两者差异的原因。RNA结合蛋白（RBP）通过与靶mRNA结合形成核糖核蛋白（RNP）复合物，从而调控mRNA的定位、稳定性和翻译，实现转录后调控。从细胞提取物中鉴定RNP复合物内此前未知的从头合成mRNA靶标，对于理解RBP的作用机制、功能及其对蛋白质表达的影响至关重要。本实验方案介绍了一种称为RNP免疫沉淀-微阵列（RIP-Chip）的方法，可在不同实验条件下鉴定与核糖核蛋白复合物特异性结合的mRNA，并为研究人员提供进一步优化实验的可选方案。借助这一重要的实验工具，研究人员能够深入探索转录后基因调控的复杂机制以及其他核糖核蛋白相互作用。
方案
实验准备
开始实验前，确保所有试剂、容器和器皿均无RNase污染至关重要。将玻璃器皿用RNase抑制剂（RNaseZAP, Ambion）处理，随后用DEPC处理的水冲洗。确保所有试剂均已确认为无RNase。
1. 准备 mRNP 裂解液
- 培养并收获处于指数生长期的组织细胞，为每次RNA免疫沉淀（RIP）制备2–5 mg的总蛋白。
- 通常两个P150培养皿即已足够。
- 针对每种待研究的RNA结合蛋白（RBP），必须优化细胞总数和蛋白量，以最大化目标mRNA与RBP之间的相互作用。
- 用于qRT-PCR分析的RIP，由于其扩增和检测方法的敏感性，所需细胞裂解液可能较少（约400 μg总蛋白），尤其适用于HuR、AUF1、TIAR等高丰度RBP。
- 在4 °C条件下，以200 × g离心8–10分钟收集细胞，随后用预冷的PBS洗涤三次。
- 最后一次洗涤后，轻弹管底，将细胞沉淀重悬于等体积的预配多聚核糖体裂解缓冲液（PLB）中，缓冲液中需含有RNase和蛋白酶抑制剂。
- 建议准确测量细胞沉淀的体积。
- 轻轻吹打混合液（切勿涡旋震荡），以分散细胞团块，并将裂解液置于冰上孵育5分钟。
- 在4 °C条件下，以13,000 × g离心20分钟，去除裂解液中的不溶物。
- 立即转移上清液至预冷的微量离心管中。
- 置于冰上，并储存于-80 °C。
- 立即冷冻可确保细胞充分裂解，并防止非特异性结合。样本解冻后应立即进行RIP实验，且操作过程中始终将样本置于冰上，以避免RNA降解。
- 该裂解液可在-80 °C下保存长达六个月。避免反复冻融，以免导致蛋白和/或mRNA降解。
- 使用标准Bradford蛋白测定法测定裂解液中的蛋白浓度。
2. 用抗体包被蛋白A Sepharose磁珠并洗涤
- 预先用含5% BSA的NT2缓冲液（3–4倍体积）孵育蛋白A Sepharose（PAS）珠过夜。储存于 4 °C.
- 长达数月的长期保存 4 °C 在添加0.1%叠氮化钠的情况下是可行的。
- 应根据目标RBP抗体的同种型选择Protein Sepharose珠。Protein A、Protein G以及Protein A/G均具有特定的同种型靶向性，且对不同同种型的亲和力存在差异。本实验根据HuR蛋白抗体的同种型特异性和亲和力，选用Protein A Sepharose珠。
- 使用前去除多余的 NT2 缓冲液，使磁珠与缓冲液的最终比例为 1:1。
- 使用 1.5 ml 无 RNA 酶的微量离心管，移除 100 μl PAS 悬液并添加 30 μg 每次免疫沉淀反应中每种抗体的用量（即，特异性RBP和同型对照）。
- 加入100-200 μl 向抗体-磁珠混合物中加入 NT2 缓冲液。
- 混合物可在 4 °C 当添加 0.1% 叠氮化钠时。
- 应平行使用同型匹配的抗体或同一物种的正常全血清作为抗体对照，以排除背景RNA的干扰。
- 加入适量抗体至珠粒混合物中，置于旋转混合仪上颠倒旋转孵育过夜 4 °C.
- 优化所研究特异性蛋白的抗体滴度（1, 5, 10 或 30 μg 抗体的量通常已足够。
- 使用前立即制备抗体包被的磁珠，用 1 ml 冰冷的 NT2 缓冲液洗涤 5 次。
- 以13,000 × g离心1-2分钟，洗涤珠子混合物 4 °C.
- 小心使用手动移液器或抽吸装置尽可能吸除上清液，注意避免扰动沉淀。
- 洗涤有助于从抗体混合物中去除未结合的抗体以及RNase污染物。
- 最终洗涤完成后，将磁珠重悬于 700 μl 冰冷NT2缓冲液处理，随后使用多种RNase抑制剂以保护目标mRNA，包括 10 μl 40 U/的RNase抑制剂μl, 10 μl 100 mM DTT 15 μl EDTA（15 mM）。加体积至 1,000 μl 用 NT2 缓冲液。
- 由于EDTA的抑制作用，不使用钒酰核糖核苷复合物。
3. 免疫沉淀与RNA沉淀
- 可选预清除步骤：
- 为降低背景信号，可使用珠粒和对照抗体对裂解液进行预清除。此步骤可能会降低最终产物中的信号强度。
- 在进行免疫沉淀（IP）后接微阵列分析时，该步骤可能有助于降低背景信号；但在IP后接qRT-PCR分析时通常不需要。
- 加入15 μg同型对照抗体，于4 °C以末端翻转方式轻柔旋转孵育30分钟。
- 加入50 μl来自步骤2.1的预先溶胀但未包被抗体的PAS珠粒。
- 于4 °C以末端翻转方式旋转孵育30分钟。
- 在4 °C下以10,000 × g离心，保留上清液用于后续免疫沉淀实验。
- 将100 μl已分离并澄清的裂解液（约含2–5 mg蛋白）加入预先准备好的抗体混合物中。
- 稀释裂解液有助于降低背景信号和非特异性结合。
- 裂解液的上样量可根据检测方法、RNA结合蛋白（RBP）的丰度或RBP抗体的效率进行调整，具体参见步骤1.1.c中的说明。
- （可选）立即轻轻弹击管壁数次以混匀，随后在4 °C下以10,000 × g短暂离心，使珠粒沉淀，立即吸取100 μl上清液作为总输入mRNA样本，用于后续采用标准RNA提取技术进行qPCR分析。
- 此步骤用于确认输入裂解液中的RNA质量是否适合免疫沉淀实验，仅建议作为验证步骤，或在RIP实验结果RNA得率较低时用于排查问题。
- 用封口膜包裹管口以确保密封，于4 °C以末端翻转方式旋转孵育2至4小时。
- 孵育时间应根据靶标蛋白的丰度进行优化，并应尽量缩短以避免复合物重排或降解。对于某些RNA结合蛋白，较短的孵育时间可能更为理想。
- 在4 °C下以5,000 × g离心5分钟使珠粒沉淀，保留上清液可用于后续Western blot分析。分装后储存于-80 °C。
- 若上清液分装样本中残留大量靶蛋白，可能表明该蛋白未能被Sepharose珠粒有效沉淀。
- 参照前述方法，用1 ml预冷的NT2缓冲液洗涤珠粒5次，每次洗涤后在4 °C下以5,000 × g离心5分钟，然后使用手动移液器或抽吸装置去除上清液。
- 为降低背景信号，可采用更严格的洗涤条件，例如在NT2缓冲液中添加脱氧胆酸钠、尿素或SDS。
- 尽可能将样品置于冰上，并快速操作，以最大限度减少靶mRNA的降解。
- 可选：保留少量（10%）珠粒混合物，或平行运行额外样品，用于通过Western blot分析检测靶蛋白的免疫沉淀效率。
4. DNase 和蛋白酶 K 处理
- 洗涤后，用 100 μl 添加了 5 μl 无 RNase 的 DNase 1（2 U/μl）的 NT2 缓冲液重悬珠子。
- 在 37 °C 下孵育 5–10 分钟。加入 1 ml NT2 缓冲液，并在室温下以 5,000 ×g 离心 1 分钟。
- 可取少量（约 10%）珠子用于通过 SDS-PAGE 分析检测免疫沉淀效率。
- 将 PAS 沉淀重悬于 100 μl NT2 缓冲液、5 μl 蛋白酶 K（10 mg/ml）和 1 μl 10% SDS 中。
- 将重悬的珠子混合物在 55 °C 水浴中孵育 30 分钟，每 10 分钟轻轻弹动一次。
- 蛋白酶 K 将有助于释放 RNP 组分。
- 在室温下以 5,000 ×g 离心 5 分钟使珠子沉淀，并收集上清液（约 100 μl）。
- 向珠子中加入 200 μl NT2 缓冲液，在室温下以 5,000 ×g 离心 2 分钟，收集上清液（约 200 μl），弃去珠子。
- 合并上清液（100 μl 和 200 μl），加入 300 μl 酸性酚-CHCl3 的下层液体。
- 涡旋振荡 1 分钟（室温或 37 °C 摇床），然后在室温下以 16,000 ×g 离心 1 分钟。
- 收集 250 μl 上层液体（切勿扰动界面），加入 25 μl pH 5.2 的醋酸钠、625 μl 100% ETOH 和 5 μl glycoblue，充分混匀。
- 在 -20 °C 下过夜保存。
- 为确保 RNA 的有效回收，加入 glycoblue 可作为载体分子提高 RNA 沉淀的可见性。
- 次日，将管子颠倒混匀 3–5 次，在 4 °C 下以 12,000 ×g 离心 30 分钟，弃去上清液。
- 向蓝色沉淀中加入 1 ml 70% ETOH，通过颠倒或涡旋混匀。
- 在 4 °C 下以 12,000 ×g 离心 2 分钟。
- 弃去上清液，在 4 °C 下以 12,000 ×g 离心 1 分钟。
- 用移液器去除残留的 70% ETOH，并在室温下空气干燥沉淀 5 分钟。
- 根据需要，用 20–40 μl 无 RNase/DNase 的水或其他适当体积的溶液重悬沉淀。
- 样品现在可用于后续下游应用，如 qRT-PCR 或微阵列分析。
- 可使用 Nanodrop 分光光度法评估样品浓度；但对于珍贵样品，建议避免使用 Nanodrop，因其可能造成浪费且相对不准确。我们建议通过归一化看家基因转录本以评估珍贵或低产量样品的纯度和免疫沉淀效率。
5. 典型结果
如果实验流程经过优化并正确操作，免疫沉淀应能显著富集目标 mRNA。通常，根据 RNA 结合蛋白（RBP）及其 mRNA 靶标的不同，通过定量反转录 PCR（qRT-PCR）检测可观察到约 10 至 50 倍的富集。利用微阵列分析可大规模发现 RBP 的多种靶标。然而，与 qRT-PCR 相比，该方法对 RNA 降解更为敏感。根据 RBP 的种类、靶标数量及反应效率的不同，微阵列可能揭示数百个新的靶标，也可能仅发现少数甚至无显著靶标。例如，研究较为深入的 RNA 结合蛋白 HuR，可在转录后水平调控许多重要生理基因的表达与翻译1, 2。以乳腺癌细胞系为例，通过 RIP-Chip 方法分离 HuR-核糖核蛋白复合物，qRT-PCR 检测结果显示多个已知的重要 HuR 靶标被富集，其中包括 β-actin（见图 1）。在两种癌细胞系中，β-actin 均被富集 12 至 15 倍。通常情况下，若操作得当，在多种细胞系中均可观察到 β-actin 的显著富集。然而，若免疫沉淀未显示 β-actin 的显著富集，则提示实验过程存在问题，可能需要重复实验。此外，对这些细胞系中免疫沉淀样品进行微阵列分析，揭示了雌激素受体（ER）阳性 MCF-7 癌细胞与 ER 阴性 MB-231 乳腺癌细胞系之间 HuR 靶标的明显差异表达谱（见图 21）。这些靶标可分为多个类别：已知和未知的 HuR 靶标，其中部分与癌症相关，部分无关。例如，CALM2 和 CD9 均为此前未被识别为 HuR 靶标的癌症相关基因。通过微阵列分析并经 qRT-PCR 验证，发现 CALM2 和 CD9 在 HuR 沉淀物中富集 5 至 180 倍，表明 HuR 蛋白与这些靶基因之间存在显著相互作用。
图 1. 在 MB-231 (ER-) 和 MCF-7 (ER+) 乳腺癌细胞中进行的免疫沉淀与 RIP 分析。 使用抗-HuR 单克隆抗体（3A2）及 IgG1 同型对照，从 MB-231 或 MCF-7 细胞裂解液中进行免疫沉淀。A. 使用 3A2 检测到的 HuR 免疫沉淀 Western blot 显示出预期大小的条带。右侧图示显示了两种细胞系输入裂解液中 HuR 的含量，以 β-tubulin 作为上样对照。B. 通过定量 RT-PCR 验证，发现已知 HuR 靶标 β-actin 在 MB-231 和 MCF-7 的 3A2 免疫沉淀中分别富集了 15 倍和 11 倍。所有 ΔΔCT 值均以 GAPDH 为参照进行标准化。实验重复两次（n = 2）。
图 2. HuR RIP-CHIP 鉴定出 ER+ 和 ER- 乳腺癌细胞中不同的基因表达谱。 使用 HuR 抗体及 IgG1 同型对照，从 MB-231 或 MCF-7 细胞裂解液中进行 HuR 免疫沉淀，并与 Illumina Sentrix 芯片（47,000 个基因）杂交。减去对照信号。结果来自 12 次不同芯片的累积数据。每个细胞系均设置三复孔（n = 3），并配有相应的对照。数值尺度为 log2。
讨论
由于本实验的特性，优化过程和实践经验是成功获得预期结果的唯一可靠保障。在该实验流程的多个步骤中，温度控制以及对试剂和产物的有效操作至关重要。合理规划并规范执行操作技术，有助于确保实验在推荐的最佳温度条件下于适当的时间范围内完成。RNA分离实验的一个主要问题是RNA极易被RNase降解。所有试剂必须无RNase，并须储存在无RNase的容器中或使用无RNase的容器进行操作。这是确保mRNA样品完整性的关键步骤。然而，即使实验操作正确，也可能因RNA结合蛋白（RBP）与其靶mRNA之间相互作用的特性而无法达到预期结果。
一个可能的问题是，通过RIP-Chip分离的RNA信号较低甚至无信号。尽管总RNA可能有信号，但这可能是由于磁珠拉下的结合蛋白量不足所致。首先应排查的问题是确认所用的细胞裂解液中该特定RNA结合蛋白（RBP）的表达量是否充足。在确认表达正常后，可在最后一次NT2洗涤后将蛋白沉淀物分离，并重悬于Laemmli缓冲液或其他合适的变性缓冲液中，在95 °C加热5分钟。随后可对这些样品进行Western印迹分析，同时结合输入裂解液样品及阴性对照，以确认目标蛋白已被充分拉下。
此外，由于需要裂解细胞才能获取这些组分，原本分隔存在的蛋白质与 mRNA 之间可能发生异常且非预期的相互作用。这些相互作用可能通过非特异性结合“吸附”目标 mRNA 或结合蛋白，从而降低其可用性。另外，在不同条件下，蛋白质可能形成多种折叠构象，导致其结合基序无法与目标 mRNA 接触，进而阻碍二者相互作用。上述因素均凸显了高效操作以及采用推荐的最佳温度条件以减少非特异性相互作用的重要性。此外，针对每种特定目标蛋白优化洗涤条件对于提高相互作用复合物的纯度至关重要，可能需要更严格的洗涤条件。例如，可在洗涤缓冲液中添加 SDS 或适量尿素，以降低非特异性结合和信号背景。具体条件完全取决于实验者所研究的目标 RNA 结合蛋白（RBP）及其在特定生理环境下的目标 mRNA。某些条件可能不适用于特定的 mRNA 分析工具，因此在样品制备过程中应予以注意。
尽管RIP在富集RNA-蛋白质相互作用方面已取得成功，但RIP（CHIP）方法一个众所周知的局限性在于无法鉴定RBP在瞬时mRNA靶标上的特异性结合区域。可采用多种交联技术结合RIP来分离独特的序列靶标；然而，短波紫外光的使用往往会导致核酸损伤。一种名为PAR-CLIP（光活化核糖核苷交联与免疫沉淀）的新方法利用长波紫外光将硫代尿苷掺入新生RNA，从而能够从稳定和瞬时的RNA相互作用中识别出独特的结合位点。
总体而言，RIP-Chip 已被我们研究团队以及许多其他研究团队确立为一种优秀的工具，用于分离和研究 RNA 结合蛋白与其 mRNA 靶标之间的相互作用。尽管该方法在本质上和操作上较为敏感，但只要正确执行，即可成功分离这些 RNP 复合物，而这些复合物直到最近仍难以被发现和分析。
披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
美国国防部（创意奖 W81XWH-07-0406）— 授予 Ulus Atasoy
NIH RO1 A1080870 - 致 Ulus Atasoy
NIH R21 A1079341 - 致 Ulus Atasoy
密苏里大学机构基金 - 致 Ulus Atasoy
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M 二硫苏糖醇 | Fisher | BP172-5 | DTT |
| DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
| 乙二胺四乙酸 | Fisher | BP118-500 | EDTA |
| 糖原 | Ambion | 9516 | |
| 1 M HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
| Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
| 1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
| 1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| NT2 缓冲液 | *见下文 | ||
| 多聚核糖体裂解缓冲液 | *见下文 | ||
| 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche | 11873580001 | |
| Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
| 蛋白酶K | Fisher | BP1700-100 | |
| RNase Out RNase抑制剂 | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
| 1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Fisher | BP166-500 | SDS |
| 1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| 钒酰核糖核苷复合物 | New England Labs | S1402S | VRC |
| 试剂配制 | |||
| 在无RNase/DNase、经DEPC处理的玻璃器皿中配制试剂 | |||
| 多聚核糖体裂解缓冲液 | |||
| 100 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 10 mM HEPES (pH 7.0) | |||
| 0.5% NP40 | |||
| 1 mM DTT | |||
| 100 单位/毫升 RNase Out | |||
| 400 μM VRC | |||
| 蛋白酶抑制剂混合片剂 | |||
| 5 ml 多聚核糖体裂解缓冲液 | |||
| 加入 50 μl 1 M HEPES (pH 7.0) | |||
| 500 μl 1 M KCl | |||
| 25 μl 1 M MgCl2 | |||
| 25 μl NP40 | |||
| 4.7 ml 无RNase-DNase的H2O | |||
| 50 μl 1 M DTT | |||
| 12.5 μl 100 U/ml RNase Out | |||
| 200 μl 蛋白酶抑制剂混合液（按制造商说明溶解） | |||
| 10 μl 200 mM VRC（使用时加入） | |||
| NT2 缓冲液 | |||
| 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 1 mM MgCl2 | |||
| 0.05% NP40 | |||
| 1 L NT2 缓冲液 | |||
| 50 ml Tris (pH 7.4) | |||
| 30 ml 5 M NaCl | |||
| 1 ml 1 M MgCl2 | |||
| 500 μl NP40 | |||
| 820 ml 无RNase-DNase的H2O |
参考文献
- Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).
- Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis. Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).
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重印与许可
