처프 긴 noncoding RNAs의 게놈에 바인딩 사이트 (lncRNAs)를 매핑하는 소설 및 신속한 기술입니다. 방법은 lncRNA 바인딩된 게놈 사이트의 열거를 허용하는 안티 센스가 원래의 oligonucleotides의 특이성을 이용합니다.
긴 noncoding의 RNAs에는 투여 보상, 각인, 그리고 발달 유전자 발현 1,2,3,4,5,6,7 같은 중요한 생물 학적 과정 동안 염색질 상태 중 핵심 규제입니다. mediates 히스톤 H3 라이신 27 trimethylation (H3K27me3)가 유전자에 특정한에서 염색질 상태를 관리하는 수많은 lncRNAs에 대한 광범위한 역할을 제시하는 등 Polycomb 억압 단지 2 (PRC2)와 같은 특정 염색질의 수정 단지와 협회의 lncRNAs 수천명의 최근 발견 패션 8,9. 일부 lncRNAs은 인근의 유전자에있는 CIS에서 일할 것으로 생각되고 있지만, 다른 lncRNAs가 먼에 위치한 유전자를 조절하는 트랜스으로 작동합니다. 예를 들어, Drosophila lncRNAs roX1과 남성 세포 X의 염색체에 roX2 구속 수많은 지역 및이 복용량 보상 10,11 위해 중요합니다. 그러나 그들의 구속력이 사이트의 정확한 위치는 높은 해상도로 알려져 있지 않습니다. 마찬가지로, 인간 lncRNA HOTAIR은 H에 PRC2 인 영향을 미칠 수유전자 게놈 차원 3,12,13,하지만 어떻게 특이성이 이루어지면의 undreds가 불분명합니다. LncRNAs 또한 여러 단백질 단지의 어셈블리를 채용한 모듈형 공사장 공중 발판이 될 수 있습니다. 클래식 트랜스 연기 RNA 비계 14 복잡한 telomerase를위한 템플릿 및 발판 역할 TERC RNA이며 HOTAIR도 PRC2위한 발판와 13 단지 H3K4 demethylase로 검색할 수 있습니다.
염색질에서 RNA의 인지도를 선행 연구는 상당한 통찰력에게 15,16을 보여주지만, 한 번에 하나의 유전자 현장에있다. 대부분의 lncRNAs의 인 사이트는 알려져 있지되며, 염색질 조절에 lncRNAs의 역할은 주로 lncRNA의 섭동의 간접적인 영향으로부터 유추되었습니다. 염색질의 immunoprecipitation는 microarray 또는 깊은 시퀀싱 (각각 칩 칩 또는 칩 seq) 뒤에 것처럼 크게 게놈 규모의 단백질-DNA 상호 작용에 대한 우리의 이해를 개선하고있다, 우리가 recen을 보여주는tly 고해상도 17 살의 긴 RNA의 인 게놈 전체를 매핑하기위한 전략을 발표했다. 다음과 함께 수백 개의 기지의 해상도 게놈 바인딩 사이트의지도를 생성하는 안티 센스-oligos을 기와로 염색질 복합 : RNA의 정제 (처프) (그림 1)에 의해이 메소드는, 염색질 격리는 대상 lncRNA의 친화 캡쳐를 기반으로 고감도와 배경 쌉니다. 친화력 – 프로브의 설계는 RNA 시퀀스 주어진 간단하고 RNA의 구조 또는 기능적 도메인에 대한 지식을 필요로하지 않기 때문에 처프 다수 lncRNAs에 적용됩니다.
여기 짹짹-seq, 생체내 lncRNA 구속력이 사이트는 게놈 전체에 매핑하는 방법을 설명했다. 성공을위한 주요 파라미터는 oligonucleotide 프로브 및 글루 타 알데히드 crosslinking을 기와의 분할 수영장입니다. 친화력 – 프로브의 설계는 RNA 시퀀스 주어진 간단하고 RNA의 구조 또는 기능적 도메인에 대한 사전 지식이 필요하지 않습니다. 두 종족에 세보다는 다른 RNAs – – roX2, TERC 및 HOTAIR와의 성공 짹짹-seq 많은 lncRNAs 대한 가능성 generalizable 것을 제안합니다. 모든 실험과 마찬가지로, 관리 및 적절한 컨트롤이 결과를 해석해야합니다. 다른 lncRNA는 조건 적정과 같은 서로 다른 선호도 프로브 또는 crosslinkers의 선택과 같은 조건의 의식 변화를 요구할 수 있습니다, RNA-염색질 상호 작용의 다양한 측면을 강조할 수 있습니다. 칩 seq 마찬가지로, 모든 바인딩 이벤트가 반드시 기능적 있으며, 추가적인 연구는 RNA O의 생물 학적 결과를 확인하는 데 필요한염색질에 ccupancy. 그럼에도 불구하고, 우리는 수천 8,9의 현재 번호를 다른 염색질 – 관련 lncRNAs의 연구자들은이 기술의 많은 흥미로운 애플 리케이션을 예견한다. 칩 seq는 DNA-단백질 상호 작용의 게놈 차원의 탐험을 위해 문을 열었습니다 것처럼, "RNA interactome"의 짹짹-seq 연구는 생물학의 많은 새로운 길을 보여줄 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 T. 숙취, MC 감사합니다. 영, O. 매너 E. Segal, M. 구로다, T. Swigut 및 토론을위한 나 Shestopalov. 과학, 기술, 싱가포르 (CC), NIH R01-CA118750 및 R01-HG004361 (HYC) 및 재생 의료 (HYC)의 캘리포니아 공과 대학 연구 기관 지원. HYC는 하워드 휴즈 의학 연구소의 조기 채용 과학자이다.
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma Aldrich | G5882-10x10ml |
Motorized pellet mixer | VWR | V8185-904 |
Protease inhibitor | Roche | 11873580001 |
PMSF | Sigma Aldrich | 78830 |
Superase-in | Ambion | AM2696 |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 |
Falcon tubes (for sonication) | Corning | 430790 |
Proteinase K | Ambion | AM2546 |
PCR purification kit | Qiagen | 28106 |
C-1 magnetic beads | Invitrogen | 65002 |
PMSF | Sigma Aldrich | P7626-25G |
DynaMag-15 magnet | Invitrogen | 123-01D |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
MIRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 |
Rnase H | Epicentre | R0601K |
Rnase A | Sigma Aldrich | R4875-100MG |
Phase Lock Gel Heavy | 5 PRIME | 2302810 |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Phenol:chloroform:Isoamyl | Invitrogen | 15593-031 |
Chloroform | Ricca | RSOC0020-1C |
GlycoBlue | Ambion | AM9515 |
Glycine | J.T. Baker | 4057-06 |
PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 |
Elution Buffer (EB) | Qiagen | 19086 |
20x SSC | Invitrogen | 15557-036 |
10% SDS | Invitrogen | 15553-027 |
DNA-free | Ambion | AM1906 |
Buffer kit | Ambion | AM9010 |
Formamide | Invitrogen | 15515-026 |