Summary
这项研究描述了一个发展
Abstract
菱形唇是位于后脑的胚胎神经上皮之间的神经管及第四脑室（1检讨）roofplate交界。可分为菱形嘴唇上的菱形唇（URL），其中包括1（R1）和菱产生小脑的神经元和低菱形唇（LRL的），而产生不同的神经脑干谱系2-4。 LRL的衍生工具包括耳蜗核的听觉神经细胞和那些的原子核参与调节平衡和电机控制5-8 precerebellar的。神经再生的LRL的发生在一个大的时间窗口，包括胚胎（五）9.5-16.5 5天，9。不同的神经细胞谱系出现分裂后的细胞在不同发育天，在此期间神经窗口（或出生）LRL的。
基因表达结构的电可以用来操纵LRL的祖细胞的基因表达，并可能改变命运10-12从本地区产生的神经元。通过在子宫内的电LRL的祖细胞在小鼠的基因表达改变已经非常成功地操纵胚胎一天E12.5或以后10 12-14出生的谱系。 在宫内 electroporations前到E12.5已经失败主要是由于穿刺第四脑室roofplate的必要步骤，在提供外源DNA进入LRL的电穿孔相关的杀伤力。然而，许多LRL的派生谱系来自LRL的早于E12.5 9。这些以前出生的谱系，包括外侧网状神经元组成，外部的楔形，下橄榄核的precerebellar系统的功能连接脊髓和大脑皮质的投入小脑5。为了操作的LRL的表达胚胎E12.5年轻，我们开发了在体外系统在胚胎放置到文化电。
这项研究提出了一个在E11.5 LRL的祖细胞的基因表达操纵的高效率和有效的方法。重复性表示培养24小时后的GFP绿色荧光蛋白（GFP）的广泛积极的CAG启动驱动与电穿孔的胚胎。此法的一个重要方面，是基因表达的改变只因为外源基因的表达，并没有因为二次效应，从电和栽培技术的结果。它被确定内源性基因表达模式保持原状电穿孔和培养胚胎。此法可以用来改变命运的细胞从胚胎E12.5年轻的过度表达质粒引进LRL的新兴或击倒（通过RNA干扰）不同亲神经转录因子。
Protocol
1。以电穿孔前的准备
- 由马克西准备（总理或Qiagen公司）的DNA扩增为电。 DNA的浓度应该是最低的1毫克/毫升的高效吸收。
- 5微升0.01％快速绿色1×PBS（磷酸盐缓冲液）在离心管取出495μLDNA和混合。
2。胚胎丰收
- CD-1小鼠（哈伦）建立定时交配。检查阴道塞的存在，并把阴道塞观察胚胎一天（五）0.5的日期。胚胎将可视化插件（E11.5）后11天收获。
- 将在70％乙醇消毒工具。层流罩与紫外线灯治疗至少一小时前使用。喷雾罩，托盘解剖，解剖用70％乙醇的范围。预热1×PBS至37°C。
- 在E11.5安乐死的女性，根据研究所批准的条件护理和使用动物（ICCUA）的成分委员会。放置在层流罩的解剖托盘。喷用70％乙醇对女性的腹部。
- 打开腹腔，针城墙解剖的托盘。拉出子宫角，以便它的腹腔内休息。
- 仔细剖开的子宫角的墙上。使用20毫米的勺子（精细的科学工具）轻轻取出胚胎卵黄囊远离胎盘。预填充10毫升无菌1×PBS 2.2预热到100毫米组织培养皿的地方胚胎。
- 出席会议的所有胚胎重复。
3。 E11.5胚胎的电（ 图1）
- 使用20毫米的勺子，第一胚胎转移到与预先填写10 mL无菌1XPBS预热至37中一个新的100毫米菜°C。
- 使用1 0.05×0.02毫米的小费（精细的科学工具）11厘米镊子仔细重新移动和丢弃卵黄囊。
- 胚胎的位置，因此，其背侧朝上，以便它类似于图1A卡通。使用7毫米的电极桨（哈佛器械）轻轻按住胚胎。电极应定位在任的神经管在一侧的后脑第四脑室水平。脑室是肉眼可见的，但使用解剖显微镜可以方便准确桨安置。桨的定位是，以确定该地区接收的电穿孔DNA的关键。如果是理想的，较低的菱形唇（LRL）背胚胎后脑桨必须是这样，它们直接侧翼第四脑室开放的最广泛的部分。
- 用1毫升注射器制订混有0.01％的快速绿色的质粒DNA。 500μL混合物应为至少8-10胚胎（见3.5）的电足够。
- 轻轻穿刺roofplate OVerlying与25G 5/8结核菌素1毫升注射器针第四脑室及脑室注入DNA染料混合物。成功的注射填补了整个脑室系统（ 图1C）由DNA染料混合物的特点。通常注射DNA的染料混合物的数量少于50μL。确切数额之间胚胎变量的混合物的一部分，往往泄漏到周围的胚胎PBS心室。将通过访问软腭上覆的脑穿刺脑室系统提供的DNA染料混合物的替代手段。再次，成功的注射DNA染料混合物填充整个脑室系统的特点。
- 交付使用电脉冲发生器（BTX）和7毫米的电极桨5平方脉冲。每个脉冲50 V的持久5毫秒500毫秒之间的每个脉冲，每脉冲。组织最接近的带正电荷的电极，然后德电子商务支撑的载体。
4。文化的胚胎
- 在层流罩，填写2毫升辅以10％小牛血清，5％马血清，1％谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素预热的DMEM/F12媒体外井12井培养皿到37°C。培养条件进行了改编自15 de地亚哥和他的同事们。
- 在层流罩在中段（以下心）用钳子捏胚胎并取出胚胎的后部。放入前部的12孔培养皿中充满井之一。
- 重复所有的胚胎。只填写12孔板外井文化，以避免污染。
- 在37℃培养箱培养胚胎用5％的CO 2。电穿孔质粒表达应观察24小时内。
- 应该更长文化理想，填写一个新的12孔板出井，2毫升媒体4.1。用消毒勺转移胚胎以及在新板。放回37℃培养箱。 48小时的文化是可能的。
- 当达到所需的培养时间，解决胚胎进行分析（见下文）。
5。用于分析胚胎的制备
- 在4°C冲洗胚胎五分钟，1×PBS。重复。
- 修正了2％多聚甲醛分析2小时1XPBS（PFA）的胚胎在4°C
- 在4°C冲洗胚胎五分钟，1×PBS。重复。
- 在30％蔗糖1×PBS平衡胚胎一夜之间在4°C。
- 嵌入最佳切削温度（OCT）复合使用干冰/乙醇浴中的胚胎。胚胎可以保存在-20°C
- 低温恒温器（徕卡）到30微米的部分幻灯片上装载（厂商VWR，Superfrost加），第胚胎。贮存于-20°C
6。免疫nohistochemistry分析
- 16所述进行免疫组化。用于这项研究的主要抗体稀释包括兔的α-GFP（Invitrogen公司）1:2500;小鼠α-，MASH1（BD Biosciences公司）1:100;兔α-Ngn1，（简·约翰逊）1:5000;兔α-Ptf1a（简·约翰逊）1:2500;兔MATH1（简·约翰逊）1:100。孵育平面幻灯片，标本方在4°C过夜染色托盘。
- 幻灯片分析了复合显微镜（奥林巴斯BX51）。
7。代表结果
图1A中的示意图描绘了电实验。 图1B显示了一个E11.5胚胎矢状前操纵的。相同的胚胎，含造影:: GFP质粒注射0.01％快速绿色显示在图1C和有代表性的非固定胚胎参展单方面的GFP显示在图1D背后脑24小时以下文化的表达。 LRL的，是成功的电穿孔面积的范围是可变的，似乎是高度依赖的电极定位。在我们的研究结果发现，52 65（80％）的电穿孔胚胎成功表达GFP。组织被认为是成功的电穿孔，如果它是固定和免疫组化分析（见下文）后的几个部分，在局部地区的GFP阳性。胚胎未能满足此条件，取得了在电不成功的尝试。
电效率的进一步评估，确定对GFP电穿孔胚胎在第四脑室水平的横截面进行免疫组化。 图2显示了从代表显示单方面胚胎的连续切片GFP的表达。 图2A显示了一个理想化的原理，说明胚胎左侧是朝正电极。横截面（ 图2A中的卡通所代表的水平），揭示了完全本地化的GFP表达左侧后脑组织（ 图2C和2D）。电穿孔的LRL的面积没有扩大整个前后轴的神经管延髓300微米或更大，以图2C显示，部分考试不表达GFP（ 图2B）。
此法对基因表达操纵的工具是依赖于内源性蛋白的表达域的稳定。 LRL的特点是原神经转录因子的表达差异（审查1）具有独特的祖域已被定性为。这些因素中的一个子集（MASH1，MATH1，Ngn1，Ptf1a），被选择的分析，由于他们的建议和/或规范的LRL的，今后的研究课题16-18 precerebellar神经亚型特点的角色。所有四个蛋白质有高度在在E11.5 16-18尾后脑特征表达域。我们观察到，置于文化的胚胎未能扩大规模，也未能启动生产的脉络丛上皮内陷LRL的和roofplate，E11.5和E12.5 5之间发生的形态学事件。根据这些意见，它被确定在这些胚胎的正常发育停止或严重延迟和培养的胚胎相媲美的控制应该是落后的胚胎在E11.5。
为了确保文化和电不打扰内源性蛋白的水平，我们分析了四个不同的蛋白质由immunohistoch我 emistry化（IHC），电穿孔，然后培养24小时，至少在34个不同的胚胎。 表显示每个标记和分析，保留了正常的蛋白质水平。 图3免疫组数据显示代表胚胎的百分比分析胚胎数从蛋白质分析，MASH1（ 图3A和3B）和MATH1（ 图3C和3D）。我们观察到，大部分胚胎电和文化表达（ 图3B和3D）保留正常水平相比，控制胚胎E11.5（ 图3A和3C）。重要的是，这些蛋白质的特征表达域，不慌乱。
图1。在E11.5胚胎的电。日（一）示意图ê电实验。 E11.5胚胎分离和表达质粒在0.01％的快速绿色到第四脑室注射。胚胎，然后两侧电极桨和50 V脉冲之前被放置到文化（二）注射前的E11.5胚胎矢状。 （三）同一E11.5胚胎后，在0.01％的快速绿色注射质粒。 （四）单方面后脑表达GFP的观察E11.5胚胎后24小时的文化。 MB-脑; 4V第四脑室。
图2。电穿孔组织中的绿色荧光蛋白表达的影响。（一）在左边的卡通描绘电极周围的E11.5胚胎的位置。中东卡通描绘胚胎左侧质粒编码绿色荧光蛋白的摄取和表达。右边的卡通是一个理想化的横向部分通过胚胎在l原理evels由中间卡通黑线表示。通过电穿孔E11.5胚胎培养24小时后的横截面的绿色荧光蛋白的免疫组织化学（的B-D）。箭头指示的roofplate（RP）的陷阱二级抗体。图像是在10X的放大倍率。显示部分的相对水平描述（一）通过中间卡通水平线。 MB-脑，L 4V第四脑室; RP-roofplate。
图3。菱形唇下的内源性蛋白的免疫组织化学，MASH1（A和B）或比较E11.5胚胎的横截面，培养与电穿孔与CAG的胚胎（C）MATH1（C和D）的表达。 GFP和培养24小时（B和D）。在10倍放大倍率拍摄的图像。
| 原神经Transcripti分析因子 | 胚胎数分析 | 挡土墙的正常表达模式的百分比 |
| MATH1 | 15 | 86.7％ |
| MASH1 | 12 | 83.3％ |
| ngn1 | 7 | 71.4％ |
| ptf1a | 6 | 100％ |
表一百分比电穿孔和培养胚胎，保留原神经正常的转录因子在LRL的域。
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Discussion
在这项研究中提出的技术在体外电击是一种新颖的方法，可以有效地利用胚胎年龄小于12天的妊娠期，操纵基因表达。胚胎放置到文化允许引入基因的表达和规避杀伤力观察电穿孔胚胎时，被允许留在体内 。这种技术允许基于电的研究，这在以前无法进入的胚胎祖细胞的基因表达操纵。
电技术，导致在引入80％的胚胎基因的高效表达分析。观察图2中的局部离散地区的电穿孔组织程度。以专门针对特定的后脑区域的电电极必须小心放置的位置，作为这个执政ffected组织。如果胚胎后脑背菱形唇较低，是理想的，桨必须是这样，它们直接侧翼第四脑室开放的最广泛的部分。如果所需的单方面表达对神经管的一侧，然后胚胎需要的位置，这样神经管轴是平行的桨电极之间的。倾斜的胚胎可以导致不正确的定位和/或双边的表达。在优化，以达到更好的电效率可能会有所不同电电压，因为这可能会增加细胞吸收的电穿孔的DNA的比例。人们还可以进一步集中的DNA股。由于神经管只能容纳液体的体积小，更浓缩的样品应增加质粒进入细胞后，电引入。最后，我们可以改变桨的直径。如果一个人想瞄准一个较小的D更多的局部地区可能是最好的，以减少叶片大小。
这项技术在操作后脑基因表达的工具，关键是正常的基因和蛋白表达模式的胚胎后，电和文化的保留。正如在图3和表记录，正常前神经转录因子水平和模式是保留83％的胚胎分析MASH1表示，86％表示MATH1，100％表示Ptf1a。 Ngn1水平强劲保留（71％），其他的转录因子检测。虽然它是可能的，这个特殊的转录因子电和文化过程的不利影响，我们认为还存在另一种解释。它已被证明，Ngn1背后脑表达减少胚胎一天（五）12.5 16消失的水平，随着时间的推移。鉴于在p比那些保留正常表达评估的其他蛋白质（83％或更高），它是可能的，至少部分的30％是在缺乏的背Ngn1表达的胚胎已经在进步的表达Ngn1胚胎ercentage是低正常的发展计划，关闭24小时后，在E11.5的收获和安置到文化Ngn1表达。这表明，在E11.5和E12.5之间的背后脑发生的分子变化可能发生在胚胎的一部分，但对一个异步或延迟的时间框架，以便这一发现在今后的研究值得进一步分析，但此法的热情并没有减弱。胚胎可能会发生的正常发展过程中发生的分子变化的可能性也应告知如何利用这项技术的研究结果进行解释。
日提出的变化和文化条件的优化电研究是可能的。结果发现，50伏了强大的吸收与组织完整性的干扰最小的电穿孔基因。电压为electroporations可以修改，以微调此法，以个别实验者的需求。直接在12孔板放置到文化传媒（如上所述）的胚胎培养条件进行了优化。这种技术可以放置到一个膜（COSTAR）置于12孔板媒体胚胎修改。这种变化在优化栽培技术尝试，但它并未显着影响的实验结果电穿孔基因表达或保留正常的基因表达模式。
这项研究侧重于培养的胚胎为24小时。胚胎已培养了48小时，24小时正在改变媒体。它被发现，组织的完整性与长期下降呃孵育时间，但电穿孔GFP的表达可以被检测出来。对于潜伏期较长时间（过去48小时），它可能是必要的改变培养条件，将可能成为未来调查的主题。
在优化文化检测，结果发现，在胚胎神经管更大的接触到的媒体环境改善的内源性基因表达的保留。在这些研究中取得了第 4 届的心室roofplate和胚胎的尾鳍部分切除多余的组织穿刺之前放置在文化。未来的研究将调查是否可以成功地在这些条件下培养的显微神经管。
这项研究侧重于胚胎电在妊娠11.5天（E11.5）。未来的发展方向将是优化技术发展的早期阶段。我们已经用这种技术对胚胎收获10.5天，而我们还没有积累和分析胚胎1显着，我们已经看到成功引入GFP和培养胚胎。更深入进一步研究将是必要的，肯定地说，在这项研究中所使用的技术可以应用到年轻的胚胎。有可能胚胎比10.5天年轻electroporate，但还没有尝试过。
功能应用这种技术的可能是过度或击倒的调查，如果其蛋白产物是LRL的从不同的神经亚型生产的关键基因的功能。未来的实验，这种技术将侧重于引进前神经转录因子的改变从E11.5 LRL的生产不同神经subypes的命运。该技术也可以适应针对其他地区正在积极生产E11.5的神经元，神经上皮。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢简·约翰逊的MATH1，Ngn1，的Ptf1a抗体和康妮Cepko为“pCAG :: GFP的质粒。这项工作是由NIH的R15的1R15HD059922-01。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher Scientific | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher Scientific | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher Scientific | AC41053-0250 | 0.01% |
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