原发性脑肿瘤组织的干细胞检测与流式分选处理

摘要

脑肿瘤起始细胞（BTICs）的发现为人类脑肿瘤的发病机制提供了新的认识。BTICs 是异质性肿瘤中具有干细胞特性的稀有细胞。我们已优化了特定的培养条件以富集 BTICs，并常规使用流式细胞术进一步纯化这些细胞群体。随后可对分离得到的细胞进行自我更新能力检测，以及通过单细胞 RT-PCR 进行转录分析。

摘要

脑肿瘤通常由形态多样的细胞组成，这些细胞表达多种神经谱系标志物。只有相对较少的一部分具有干细胞特性的肿瘤细胞，即脑肿瘤起始细胞（BTICs），具备多向分化潜能、自我更新能力以及致瘤性 体内我们采用最初用于正常神经干细胞（NSCs）的培养条件对多种人类脑肿瘤进行培养，发现该培养方法可特异性地富集具有干细胞特性的细胞群体。无血清培养基（NSC）有助于维持干细胞未分化状态，添加bFGF和EGF可促进具有多向分化潜能、自我更新能力且可扩增的肿瘤球形成。

为了进一步表征每种肿瘤中的BTIC群体，我们通过流式细胞术评估细胞表面标志物。我们还可以分选感兴趣的细胞群体以进行更特异的表征。将单个BTIC分选至96孔板中进行自我更新能力检测；在37 °C孵育后形成肿瘤球状体，表明存在干细胞或前体细胞。也可将特定群体的不同数量细胞分选至不同孔中进行极限稀释分析，以评估其自我更新能力。我们还可以利用单细胞RT-PCR研究特定细胞群体内的差异性基因表达。

以下方案描述了我们分离和培养原代人源样本以富集脑肿瘤干细胞（BTIC）群体，以及肿瘤球体解离的操作流程。此外还包括用于流式细胞术分析或分选的染色、自我更新能力检测和单细胞逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的实验方案。

引言

脑肿瘤是人类已知最具侵袭性和异质性的癌症之一。尽管现代神经影像技术有助于脑肿瘤的早期发现和诊断，但我们对许多脑肿瘤仍缺乏根治性疗法，特别是那些弥散性、侵袭性强或位于脑深部的肿瘤。

脑肿瘤是儿童癌症死亡的首要原因，因其具有高度侵袭性且常常无法治愈。胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见的原发性脑肿瘤，也是人类最恶性的癌症之一，因其预后均一性地致命而令人畏惧¹。这种高度恶性的星形细胞肿瘤（WHO 4级）通常发生于成人的大脑半球，也可发生于年幼儿童和婴儿。其生长迅速且具有浸润性，诊断性病理特征包括细胞核多形性、微血管增生和坏死^2,3。对于新诊断的成人GBM患者，中位生存期很少超过12个月¹，对所有治疗方式的总体反应均较差。我们注意到，体细胞干细胞与癌细胞之间存在许多功能和遗传上的相似性，调控正常脑发育的分子通路在癌症中也常常失调。在将干细胞生物学范式应用于脑肿瘤研究时，我们是首批前瞻性鉴定并分离出人GBM中具有体外in vitro⁴和体内in vivo⁵增殖、自我更新及分化等干细胞特性的细胞亚群的研究者。我们将最初用于体外in vitro^6,7鉴定正常神经干细胞（NSCs）的培养条件和检测方法应用于多种儿童及成人脑肿瘤，并通过细胞分选富集表达神经前体细胞表面标志物CD133的类干细胞群体^8,....

方案

1. 脑肿瘤组织的培养

1. 向15 ml人工脑脊液（aCSF，见表1）中加入200 μl解冻的Liberase（Roche Applied Science），置于37 °C水浴中。Liberase TM是一种蛋白水解酶混合物，用于解离原代组织样本以及培养的肿瘤球。与胰蛋白酶-EDTA不同，Liberase法可保留细胞表面抗原CD133。对于约0.5 cm³的组织样本，我们使用200 μl Liberase；若组织较小，则使用100 μl。
2. 将氯化铵溶液（Stem cell technologies）恢复至室温。氯化铵溶液可温和裂解红细胞，对其他细胞影响极小，且不含固定剂。
3. 在无菌生物安全柜中，向标本容器中加入5 ml aCSF，轻轻旋转冲洗组织，然后用移液器吸除。此步骤有助于去除红细胞（RBC）。
4. 将脑肿瘤组织转移至无菌的100 mm培养皿中。
5. 使用精细剪刀或手术刀及镊子，将组织机械解离至浆状。
6. 用10 ml普通移液管或镊子收集样本，将组织碎片转移至含有预热aCSF与Liberase的离心管中。
7. 将离心管置于摇床培养箱中，设置为37 °C、30 rpm，孵育15分钟。
8. 通过70 μm细胞滤网将组织裂解液过滤至50 ml Falcon管中。
9. 以280 × g离心5分钟，沉淀细胞。
10. ....

讨论

癌症干细胞假说¹⁰基于白血病²¹、乳腺癌¹¹和脑癌^4,5的研究，认为肿瘤中只有一小部分细胞（称为癌症干细胞）具有广泛增殖和自我更新的能力。大多数肿瘤细胞在分化为构成肿瘤表型特征的细胞后，失去了增殖和自我更新的能力。在脑肿瘤细胞群体中识别出能够维持肿瘤生长的关键细胞，将有助于揭示脑肿瘤发生机制，并使我们能够追溯到肿瘤的起源细胞。

干细胞的功能定义为具有自我更新能力并能进行多谱系分化的细胞^22-24。原发性脑肿瘤组织在有利于干细胞生长的培养条件下进行培养，该条件先前已被用于以肿瘤球形式分离神经干细胞²⁵。神经干细胞培养基（NSC）可维持干细胞未分化状态，添加bFGF和EGF可诱导具有多能性、自我更新能力且可扩增的干细胞增殖^6,26。无论病理亚型如何，在原代培养24至48小时内，大多数脑肿瘤均会产生少量细胞，这些细胞可生长为克隆来源的类神经球样细胞簇，即肿瘤球。因此，我们能够从患者脑肿瘤组织中富集脑肿瘤干细胞（BTIC）群体。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1:1 DMEM:F12	Invitrogen	11320-082
N2 添加剂	Invitrogen	17502-048
1M HEPES	Wisent Inc.	330-050-EL
葡萄糖	Invitrogen	15023-021
N-乙酰半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165-25g
神经存活因子-1 (NSF-1)	Lonza Clonetics	CC-4323
表皮生长因子 (EGF)	Sigma-Aldrich	E9644
碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)	Invitrogen	PHG0261
白血病抑制因子 (LIF)	EMD Millipore	LIF1010
抗生素/抗真菌剂	Wisent Inc.	450-115-EL
Liberase TM	Roche Group	05 401 119 001
氯化铵溶液	Stem Cell Technologies	07850