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原发性脑肿瘤组织的干细胞检测与流式分选处理

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DOI：

10.3791/4111

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2012年9月25日

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Cancer Research Institute, McMaster University

本文内容

摘要

脑肿瘤起始细胞（BTICs）的发现为人类脑肿瘤的发病机制提供了新的认识。BTICs 是异质性肿瘤中具有干细胞特性的稀有细胞。我们已优化了特定的培养条件以富集 BTICs，并常规使用流式细胞术进一步纯化这些细胞群体。随后可对分离得到的细胞进行自我更新能力检测，以及通过单细胞 RT-PCR 进行转录分析。

摘要

脑肿瘤通常由形态多样的细胞组成，这些细胞表达多种神经谱系标志物。只有相对较少的一部分具有干细胞特性的肿瘤细胞，即脑肿瘤起始细胞（BTICs），具备多向分化潜能、自我更新能力以及致瘤性 体内我们采用最初用于正常神经干细胞（NSCs）的培养条件对多种人类脑肿瘤进行培养，发现该培养方法可特异性地富集具有干细胞特性的细胞群体。无血清培养基（NSC）有助于维持干细胞未分化状态，添加bFGF和EGF可促进具有多向分化潜能、自我更新能力且可扩增的肿瘤球形成。

为了进一步表征每种肿瘤中的BTIC群体，我们通过流式细胞术评估细胞表面标志物。我们还可以分选感兴趣的细胞群体以进行更特异的表征。将单个BTIC分选至96孔板中进行自我更新能力检测；在37 °C孵育后形成肿瘤球状体，表明存在干细胞或前体细胞。也可将特定群体的不同数量细胞分选至不同孔中进行极限稀释分析，以评估其自我更新能力。我们还可以利用单细胞RT-PCR研究特定细胞群体内的差异性基因表达。

以下方案描述了我们分离和培养原代人源样本以富集脑肿瘤干细胞（BTIC）群体，以及肿瘤球体解离的操作流程。此外还包括用于流式细胞术分析或分选的染色、自我更新能力检测和单细胞逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的实验方案。

引言

脑肿瘤是人类已知最具侵袭性和异质性的癌症之一。尽管现代神经影像技术有助于脑肿瘤的早期发现和诊断，但我们对许多脑肿瘤仍缺乏根治性疗法，特别是那些弥散性、侵袭性强或位于脑深部的肿瘤。

脑肿瘤是儿童癌症死亡的首要原因，因其具有高度侵袭性且常常无法治愈。胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见的原发性脑肿瘤，也是人类最恶性的癌症之一，因其预后均一性地致命而令人畏惧1。这种高度恶性的星形细胞肿瘤（WHO 4级）通常发生于成人的大脑半球，也可发生于年幼儿童和婴儿。其生长迅速且具有浸润性，诊断性病理特征包括细胞核多形性、微血管增生和坏死2,3。对于新诊断的成人GBM患者，中位生存期很少超过12个月1，对所有治疗方式的总体反应均较差。我们注意到，体细胞干细胞与癌细胞之间存在许多功能和遗传上的相似性，调控正常脑发育的分子通路在癌症中也常常失调。在将干细胞生物学范式应用于脑肿瘤研究时，我们是首批前瞻性鉴定并分离出人GBM中具有体外in vitro4和体内in vivo5增殖、自我更新及分化等干细胞特性的细胞亚群的研究者。我们将最初用于体外in vitro6,7鉴定正常神经干细胞（NSCs）的培养条件和检测方法应用于多种儿童及成人脑肿瘤，并通过细胞分选富集表达神经前体细胞表面标志物CD133的类干细胞群体8,9。在NOD-SCID小鼠脑内，CD133+脑肿瘤组分中的细胞比CD133-组分具有更高的肿瘤启动频率5,10。这正式确立了仅有一小部分具有干细胞特性的脑肿瘤细胞具备启动肿瘤的能力，因此被称为“脑肿瘤启动细胞”（brain tumor initiating cells, BTICs）。BTICs的首次鉴定为人类脑肿瘤发生提供了新的认识，有力支持了癌症干细胞假说10–13作为多种实体瘤的基础，并确立了一个可用于开发更有效癌症疗法的新型细胞靶点14–20。仅针对肿瘤主体细胞的疗法可能遗漏稀有的类干细胞亚群，导致肿瘤持续生长。而以癌症干细胞为靶点的治疗可能为脑肿瘤患者带来更佳的治疗效果和预后。

为了研究脑肿瘤干细胞样细胞（BTIC）群体，我们优化了培养方案，以特异性筛选出具有干细胞特性的脑肿瘤细胞群体。无血清的神经干细胞（NSC）培养基可维持细胞处于未分化状态，添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）和白血病抑制因子（LIF）可促进多能性、自我更新且可扩增的人源肿瘤球的增殖。本文描述了原代脑肿瘤组织处理及在NSC培养基中培养以富集BTIC群体的方法。我们将实验模型系统称为“BTIC患者来源分离细胞”，以强调这些细胞仅在干细胞条件下进行最低限度的培养，以筛选出干细胞样细胞群体。文中还介绍了对BTIC群体进行关键干细胞标志物（如CD133和CD15）的免疫标记及流式细胞术分析。随后，我们讨论了有限稀释分析法，该方法有助于研究BTIC的自我更新能力。最后，我们探讨了通过将单个细胞分选至AmpliGrid载玻片并进行单细胞RT-PCR，对这些稀有细胞进行基因表达分析。这些技术同样适用于其他类型的脑肿瘤，如髓母细胞瘤、室管膜瘤和儿童胶质瘤。

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方案

1. 脑肿瘤组织的培养

  1. 向15 ml人工脑脊液（aCSF，见表1）中加入200 μl解冻的Liberase（Roche Applied Science），置于37 °C水浴中。Liberase TM是一种蛋白水解酶混合物，用于解离原代组织样本以及培养的肿瘤球。与胰蛋白酶-EDTA不同，Liberase法可保留细胞表面抗原CD133。对于约0.5 cm3的组织样本，我们使用200 μl Liberase；若组织较小，则使用100 μl。
  2. 将氯化铵溶液（Stem cell technologies）恢复至室温。氯化铵溶液可温和裂解红细胞，对其他细胞影响极小，且不含固定剂。
  3. 在无菌生物安全柜中，向标本容器中加入5 ml aCSF，轻轻旋转冲洗组织，然后用移液器吸除。此步骤有助于去除红细胞（RBC）。
  4. 将脑肿瘤组织转移至无菌的100 mm培养皿中。
  5. 使用精细剪刀或手术刀及镊子，将组织机械解离至浆状。
  6. 用10 ml普通移液管或镊子收集样本，将组织碎片转移至含有预热aCSF与Liberase的离心管中。
  7. 将离心管置于摇床培养箱中，设置为37 °C、30 rpm，孵育15分钟。
  8. 通过70 μm细胞滤网将组织裂解液过滤至50 ml Falcon管中。
  9. 以280 × g离心5分钟，沉淀细胞。
  10. 小心吸除上清液，并观察细胞沉淀的大小和颜色：若沉淀呈粉红色或红色，提示红细胞较多。
  11. 用1 ml PBS重悬细胞沉淀。
  12. 根据沉淀体积及红细胞污染程度，加入适量氯化铵溶液（4–12 ml）（氯化铵溶液作用温和，过量使用对除红细胞外的其他细胞无害）。
  13. 室温孵育5分钟。
  14. 以280 × g离心5分钟，沉淀细胞。
  15. 用10 ml无菌PBS洗涤一次。
  16. 用5 ml NSC完全培养基（表2）重悬细胞，转移至超低吸附60 mm组织培养板（Corning）。我们使用具有共价结合亲水性中性电荷水凝胶表面的超低吸附培养板，以最大限度减少细胞贴壁介导的分化。

培养初期不要换液：仅根据需要补充添加1–2 ml培养基，之后继续观察培养情况，当培养基颜色略微变黄时再进行换液。

2. 肿瘤球解离用于流式细胞术

  1. 在显微镜下评估肿瘤球：如果球体大小 >100 μm，建议进行解离，因为较大的球体中心可能坏死。
  2. 将培养物转移至15 ml圆锥形离心管中。
  3. 加入2–3 ml无菌PBS充分冲洗培养板，并将冲洗液加入离心管中。
  4. 在280 × g下离心5分钟。
  5. 弃去上清液，用1–2 ml无菌PBS重悬沉淀。
  6. 加入10 μl Liberase。
  7. 在37 °C水浴中孵育3分钟。取出后肉眼评估细胞悬液，若可见多个团块，用1,000 μl移液器枪头轻柔吹打。
  8. 若团块仍存在，继续孵育额外1–2分钟。
  9. 加入5 ml无菌PBS洗涤细胞，在280 × g下离心5分钟。
  10. 弃去上清液，用500–1,000 μl无菌PBS + 2 mM EDTA重悬细胞。
  11. 使用台盼蓝评估细胞数量和活力。
  12. 用PBS + 2 mM EDTA将细胞浓度调整至100万/ml。

3. 表面染色

  1. 每项检测取100 μl浓度为1×106/ml的细胞悬液，加入12×75 mm的流式管中。
  2. 加入适量抗体。每种抗体均应设置相应的同型对照（见表3）。
  3. 冰上孵育30分钟。
  4. 向每根流式管中加入2 ml PBS+2 mM EDTA。
  5. 以200 × g离心4分钟，弃上清并吸除残留液体。
  6. 将沉淀重悬于300 μl PBS+2 mM EDTA中。
  7. 每管加入10 μl 7AAD活性染料，冰上孵育至少15分钟。
  8. 通过流式细胞术进行分析。

4. 流式细胞术数据采集与分析

流式数据的采集与分析具体步骤取决于所用仪器。需运行具有代表性的阴性样本，并设定前向散射（细胞大小）和侧向散射（细胞颗粒度）的仪器参数。这种散射图模式可使最终用户观察样本中的所有细胞，包括碎片。通常在目标细胞周围绘制一个区域（图4a）。随后设定所有荧光检测器的参数，使阴性细胞位于荧光强度图的第一个数量级内。当使用一种以上染料或荧光素时，必须运行单染对照，以确定荧光补偿值（扣除干扰性荧光信号）。在检测活细胞时，需使用活力染料（如7-AAD（7-氨基放线菌素D，激发波长488 nm，发射波长655 nm）），并绘制第二个区域以排除死细胞（图4b）。这两个区域将应用于后续所有样本分析。

5. 自我更新能力检测

克隆球生长显著促进的关键检测是 体外 自我更新能力检测，即有限稀释分析。将肿瘤球解离后以梯度稀释方式接种，最低至每孔单个细胞，培养7天后计算形成球体的比例。第7天时，记录每个细胞接种密度下未形成球体的孔所占百分比（F0) 根据每孔细胞数量进行计算并作图x）。每个孔中形成至少一个肿瘤球所需的细胞数量由该直线与0.37水平线交点处确定（F0 = e -x）。在细胞的泊松分布中，F0 = 0.37 对应每孔一个细胞的稀释度，因此该计算（37%交点）反映了整个细胞群体中克隆形成干细胞的频率图5).

6. 单细胞 RT-PCR

使用Beckman Coulter MoFlo XDP将不同细胞群体的单个细胞分选至AmpliGrid载玻片（Beckman Coulter货号：AG480F）的反应位点上。根据制造商说明书，采用AmpliGrid Single One Step RT-PCR系统（Beckman Coulter货号：OAX04515）进行单细胞RT-PCR。简言之，将单个细胞分别沉积至AmpliGrid载玻片的各个反应位点中，并通过显微镜确认每个反应位点中存在单个细胞。分选后立即进行逆转录（RT），以防止样本降解。按照试剂盒说明（表4）新鲜配制RT主混合液。每个反应中加入0.03 μl的25 μM随机引物（Promega）；将1 μl主混合液加入每个反应位点中央，随后立即覆盖5 μl密封液（Beckman Coulter货号：OAX04503）。使用AmpliSpeed载玻片循环仪（Beckman Coulter；货号：OAX04101），将载玻片在25 °C孵育10分钟，42 °C孵育10分钟，55 °C孵育45分钟。逆转录完成后，向每个反应位点加入3 μl无DNase/RNase的水，并将全部混合物转移至PCR管中（每孔对应一管）。在PCR板中进行定量PCR，反应体系为10 μl：包含8 μl qPCR主混合液（5 μl Sybr Green（Quanta）、1 μl水、1 μl 10 μM正向与反向引物混合液）以及2 μl RT反应产物。为实现实时定量，使用BioRad循环仪运行以下程序：95 °C预变性10分钟，随后进行45个循环（95 °C变性30秒，60 °C退火60秒，72 °C延伸60秒），最后72 °C延伸10分钟并进行熔解曲线分析。Ct值由Opticon Monitor 3（BioRad）软件确定。每个细胞可检测三个基因，其中包括作为内参基因的GAPDH。基因表达水平根据2-ΔCt方法归一化至GAPDH的表达水平。同一次分选中来自相同细胞群体的至少十几个单细胞可作为生物学重复，以弥补技术重复的缺失。

7. 代表性结果

图1 显示了一名代表性胶质母细胞瘤（GBM）患者的磁共振成像（MRI）扫描结果。根据汉密尔顿健康科学中心/麦克马斯特健康科学研究伦理委员会的批准，研究在患者知情同意后，于手术结束后立即获取脑肿瘤组织样本。每份样本的一部分送至神经病理科进行常规临床诊断，其余部分则按 图2 所示流程进行处理。将肿瘤细胞接种于含生长因子的完全神经干细胞培养基后，可形成如 图3 所示的肿瘤球（tumorspheres）。

如图4所示，使用神经表面干细胞标志物CD133和CD15对肿瘤细胞进行标记，并通过流式细胞术进行分析。

不同群体的单细胞 例如，CD15+/CD133+、CD15+/CD133-、CD15-/CD133+、CD15-/CD133- 随后被分选至96孔板中（图5a）或 AmpliGrid 载玻片（图6a).

在96孔板中，具有自我更新能力的单个细胞（例如 CD133+ 细胞）（例如 CD133+ 细胞），（图5b），经孵育后可形成肿瘤球（图5c）。通过计数每孔中形成的球体数量，可绘制自我更新曲线（图5d）。将单个细胞分选至Ampligrid载玻片的反应位点（图6a）。从单个细胞中提取的RNA可使用Advalytix AmpliSpeed进行逆转录（图6b）。所得cDNA用于进行实时RT-PCR检测（图6c）。

脑部MRI扫描；显示异常肿块的轴向视图。诊断成像；神经学评估工具。
图1. 一名胶质母细胞瘤（GBM）患者的磁共振成像（MRI）。 一名16岁女孩的脑部MRI扫描，该患者有长达一个月的头痛史，以及一周的呕吐、嗜睡和视力模糊症状。轴向FLAIR序列显示一个大型跨半球（“蝴蝶状”）GBM。

在培养皿中进行组织解离（a），带有样本的细胞培养装置（b），实验室实验。
图 2. 脑肿瘤样本处理。 脑肿瘤样本取自手术后知情同意的患者。样本首先进行机械解离（如图 a 所示），随后在 aCSF 中加入 Liberase 酶，在 37 °C、30 rpm 的摇动培养箱中孵育 15 分钟，进行酶解解离（b）。

干细胞培养物的显微镜图像，显示在静态条件下用于研究的细胞聚集现象。
图3. BTIC群体在培养中形成肿瘤球。 分离的脑肿瘤细胞在含生长因子的完全神经干细胞培养基中培养，可形成肿瘤球。

流式细胞术分析；散点图；细胞设门；示意图；荧光；实验室设备。
图 4. BTIC 群体的流式细胞术分析。 （a）前向散射与侧向散射特性可呈现所有细胞的图像，包括碎片；（b）被活率染料 7-AAD 染色的细胞被排除在分析之外；（c）通过合适的同型对照确定统计象限的位置；（d）用表面标志物 CD15-PE 和 CD133-APC 染色的肿瘤细胞；（d）Moflo XDP 细胞分选仪。 点击此处查看高清大图。

96孔板实验、神经球形成、显微镜图像、细胞密度图分析
图 5. 脑肿瘤起始细胞的极限稀释分析揭示其自我更新能力。 (a) 将不同稀释浓度的细胞分选至含有 200 μl 神经干细胞培养基（NSC）的 96 孔板中，(b) 每孔一个细胞。(c) 经过 7 天培养后，形成肿瘤球。继发性肿瘤球的形态与原发性肿瘤球相同。(d) 可通过极限稀释分析计算每种肿瘤亚型的平均 x 轴截距值，以揭示每孔至少形成一个肿瘤球所需的细胞数量。

显示荧光循环分析图的PCR工作站，配备AmpliGrid和AmpliSpeed。
图6. 利用单细胞RT-PCR技术可实现单个BTIC细胞的基因表达分析。 （a）可将BTIC细胞群体中的单个细胞分选至AmpliGrid载玻片上。（b）使用Advalytix AmpliSpeed在AmpliGrid载玻片上的单个细胞中进行cDNA合成。（c）对从单个BTIC细胞合成的cDNA进行定量实时PCR分析。

2M NaCl62 ml
1M KCl5 ml
1M MgCl23.2 ml
155 mM NaHCO3169 ml
1M 葡萄糖10 ml
108 mM CaCl20.9256 ml
纯化超纯水 H20749.84 ml

表1. 人工脑脊液（aCSF）- 1,000 ml。

储存基础培养基500 ml
1:1 DMEM:F12480 ml
N2 添加剂5 ml
1M HEPES5 ml
葡萄糖3.0 g
N-乙酰半胱氨酸 (60 μg/ml)1 ml
神经存活因子-1 (NSF-1)10 ml

表2. 神经干细胞培养基。

NSC 完全培养基（使用前新鲜配制）：
NSC 基础培养基 + 20 ng/ml EGF（表皮生长因子） + 20 ng/ml bFGF（碱性成纤维细胞生长因子） + 10 ng/ml LIF（白血病抑制因子）* + 10 μl/ml 抗生素-抗真菌剂

*白血病抑制因子（LIF）：该试剂来自Millipore，含有白细胞介素6家族的细胞因子，这种蛋白可抑制干细胞的自发分化，从而长期维持干细胞培养。

抗体供应商/货号每测试用量（在 100 μl 中）μl/test (in 100 μl)
CD133/2 APC (293C3)Miltenyi Biotec/130-090-8545
IgG2b APC (同型对照)Miltenyi Biotec/130-092-2175
CD15PEBeckman Coulter/IM1954U5
IgG2a PE (同型对照)Beckman Coulter/A091415
7AADBeckman Coulter/A0770410

表3. 流式抗体。

组分体积（1个反应）体积（48个反应）
2x 单细胞反转录反应缓冲液0.50 μl30.0 μl
RNase抑制剂（10 U/μl）0.02 μl1.2 μl
5X 单细胞RT增强液0.15 μl9.00 μl
单细胞RT酶混合液0.04 μl2.4 μl
Advablue (OAX04227)0.1 μl6.00 μl
无核酸酶水加至1 μl加至60 μl

表4. 单细胞RT-PCR（货号 OAX04515）的RT预混液组成。

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讨论

癌症干细胞假说10基于白血病21、乳腺癌11和脑癌4,5的研究，认为肿瘤中只有一小部分细胞（称为癌症干细胞）具有广泛增殖和自我更新的能力。大多数肿瘤细胞在分化为构成肿瘤表型特征的细胞后，失去了增殖和自我更新的能力。在脑肿瘤细胞群体中识别出能够维持肿瘤生长的关键细胞，将有助于揭示脑肿瘤发生机制，并使我们能够追溯到肿瘤的起源细胞。

干细胞的功能定义为具有自我更新能力并能进行多谱系分化的细胞22-24。原发性脑肿瘤组织在有利于干细胞生长的培养条件下进行培养，该条件先前已被用于以肿瘤球形式分离神经干细胞25。神经干细胞培养基（NSC）可维持干细胞未分化状态，添加bFGF和EGF可诱导具有多能性、自我更新能力且可扩增的干细胞增殖6,26。无论病理亚型如何，在原代培养24至48小时内，大多数脑肿瘤均会产生少量细胞，这些细胞可生长为克隆来源的类神经球样细胞簇，即肿瘤球。因此，我们能够从患者脑肿瘤组织中富集脑肿瘤干细胞（BTIC）群体。

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作由安大略癌症研究所（OICR）、特里·福克斯基金会以及美国神经外科医师协会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1:1 DMEM:F12Invitrogen11320-082
N2 添加剂Invitrogen17502-048
1M HEPESWisent Inc.330-050-EL
葡萄糖Invitrogen15023-021
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165-25g
神经存活因子-1 (NSF-1)Lonza CloneticsCC-4323
表皮生长因子 (EGF)Sigma-AldrichE9644
碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)InvitrogenPHG0261
白血病抑制因子 (LIF)EMD MilliporeLIF1010
抗生素/抗真菌剂Wisent Inc.450-115-EL
Liberase TMRoche Group05 401 119 001
氯化铵溶液Stem Cell Technologies07850

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