Application Notes

Профилирование изменения в рецепторных тирозин киназ Фосфорилирование использованием антител Arrays - Реклама

Released: September 27, 2012 doi: 10.3791/4199

Summary

Proteome массивов Profiler антитела являются удобным и экономически эффективным способом для выявления изменений в рецепторной тирозинкиназы (RTK) фосфорилирования без выполнения многочисленных иммунопреципитации (IP) вестернов. ARY001 человека массива RTK позволяет для качественного измерения нескольких RTKs в одном образце с помощью хемилюминесценции обнаружения.

Abstract

Нарушение регуляции рецепторов тирозинкиназы (RTK) выражения и фосфорилирования часто связано с развитием и метастазированием раковых клеток. ^1-3 Значительные усилия были сосредоточены на разработке ингибиторов для решения конкретных RTKs и прервать аберрантных сигнальных путей, связанных с болезнью государства . ^4-7 Целью данного исследования была оценка последствий выбора количества ингибиторов на фосфорилирования RTK. В настоящем исследовании использованы человека фосфо-РТК массив, который является мембрана на основе иммуноанализа сэндвич контролировать увеличение или уменьшение фосфорилирования для многочисленных RTKs одновременно в одном образце. В этом анализе, как фосфорилированные и unphosphorylated RTKs представить в лизата образца захвачен дискретных антител печатные в двух экземплярах через нитроцеллюлозные мембраны размером предметное стекло микроскопа. После промывки массивы инкубировали с анти-фосфо-тирозин-пероксидазой хрена (HRP),которые бутерброды с фосфорилированной RTKs захватили в массиве. После второго этапа стирки, массивы инкубировали с хемилюминесцентных реагентов. Сигнал генерируется при каждом массиве месте пропорционально количеству фосфора связывается с белками каждым захватом антител. В этих экспериментах, массивы были использованы для измерения увеличения фосфорилирования после стимуляции лигандом либо MDA-MB-453 рак молочной железы или желудка KATO III клетки карциномы, а также для характеристики снижения фосфорилирования, связанные с лечением клеток с ингибиторами селективной по отношению к ErbB или FGF членов R семье.

Protocol

1. Подготовка проб

Сбор лизатов из необработанного, лиганд лечение, или ингибитором и лиганда обработанных клеток соответствии с руководящими принципами в области человеческого фосфо-РТК массива таблицы. Буфера для лизиса была оптимизирована для этого комплекта. Замена других буферов лизиса может повлиять на финальное выступление массива. Для предотвращения протеолитической деградации образца, добавляют 10 мкг / мл апротинина, 10 мкг / мл лейпептин, и 10 мкг / мл пепстатин с объемом буфера для лизиса, необходимых для каждого подготовки клеточный лизат свежей для каждого использования.
Lysate концентрация должна быть измерена с помощью bicinchoninic кислоты (BCA) анализа. Примеры концентрации могут быть эмпирически с учетом оптимальную чувствительность и низкий фон. Диапазон 100-300 мкг лизат рекомендуется в качестве начальной отправной точкой.
Циклов замораживания / оттаивания образцы следует избегать и надлежащее хранение лизатов требуется для оптимальной производительности. Размораживайте лизат образцы на льду.

Принесите все компоненты набора до комнатной температуры перед использованием. Чтобы избежать загрязнения, носить перчатки при выполнении процедуры.
Внесите 2,0 мл массива буфера 1 в каждую лунку 4-ну Multi-блюдо будет использоваться. Массив буфера 1 служит в качестве блока буфера.
Использование плоским наконечником пинцет, удалите каждой мембраны, которые будут использоваться с между защитными листами и места в скважине 4-ну Multi-блюдо. Массив номер должен быть направлен вверх.
При контакте с массивом буфера 1, синий краситель из пятна исчезнут, но захват антитела сохраняются в определенных местах.
Выдержите в течение 1 часа на качающейся платформе. Orient лоток таким образом, что каждый конец массива пород до конца его хорошо. Поверхность массива должны быть полностью смачивается и покрыта блок буфера.
В то время как мембраны блокируются, развести необходимое количество клеточных лизатов до конечного объема 1,5 мл с массивом буфера 1.
Выдержите в течение ночи при температуре 2-8 ° C на качающейся платформе. Короче инкубационный период может быть использован, если оптимальной чувствительности не требуется.
Осторожно снимите каждой мембраны из 4-ну Multi-блюдо и поместить в отдельные пластиковые контейнеры с 20 мл 1X промывочного буфера. 4-ну Multi-блюдо не может быть использована для завершения промывания. Промойте 4-ну Multi-блюдо с деионизированной или дистиллированной водой и тщательно высушите.
Мыть каждый мембраны с 1х промывочного буфера в течение 10 мин на качающейся платформе шейкера. Повторите два раза в общей сложности 3 стирок.
Развести анти-фосфо-тирозин-пероксидазой хрена (HRP) выявления буфера в 1X массива буфера 2, используя коэффициент разбавления на этикетке флакона. Внесите 2,0 мл разведенного раствора в каждую лунку 4-ну Multi-блюдо.
Осторожно снимите каждой мембраны от ее мыть контейнер.Разрешить превышение очистить буфер от мембраны и вернуть мембрану к 4-ну Multi-блюдо с разбавленным анти-фосфо-тирозин-HRP. Накройте скважин с крышкой.
Выдержите в течение 2 часов при комнатной температуре на качающейся платформе.
Мыть каждый массив как описано выше.
Выполните оставшиеся шаги без перерыва. Осторожно снимите каждой мембраны от ее мыть контейнер. Разрешить превышение очистить буфер от мембраны промокательной нижний край на фильтровальной бумаге. Место каждого мембраны на пластиковой защитой листа с идентификационным номером вверх.
Внесите 1 мл подготовленного реагента Chemi смешать поровну на каждый мембраны. Использование менее 1 мл Chemi реагента Mix в мембрана может привести к неполному покрытие мембраной. Замена некоторых высокой интенсивности хемилюминесцентных реагентов для Chemi Реагенты 1 и 2 может привести либо увеличить фона или уменьшение сигнала в зависимости от реагента.
Осторожно накройте пластиковойлист защитника. Аккуратно сгладить любые пузырьки воздуха и обеспечить Chemi реагента Mix распространяется равномерно во все уголки каждой мембраны. Выдержите в течение 1 мин.
Позиция бумажные полотенца сверху и по бокам пластиковой защитой лист, содержащий мембраны и тщательно отожмите излишки реагентов Chemi Mix.
Снимите верхнюю пластиковую защитника лист и аккуратно положите абсорбирующие лаборатории протрите поверх мембраны, чтобы смыть с нее остатки реагентов Chemi Mix.
Оставив мембраны на дне защитника пластиковый лист, накрыть крышкой мембраны с полиэтиленовой пленкой заботиться, чтобы мягко сгладить любые пузырьки воздуха. Оберните превышение полиэтиленовой пленкой вокруг задней части листа защитника, так что мембраны и лист защитник полностью завернуты.
Поместите мембран с идентификационными номерами вверх, в кассете авторадиографии фильм, который не используется радиоактивный изотоп обнаружения.
Expose для Kodak фильм Свет BioMax в течение 1-10 мин. Несколько экспозиций являются Рекомендзакончился. Кроме того, изображения могут быть собраны с помощью хемилюминесценции совместимых изображений, таких как Carestream здоровье Image Station 4000мм PRO.

3. Анализ данных

Позитивные сигналы видны на проявленной пленки могут быть быстро идентифицированы путем размещения прозрачность наложения на массиве изображений и приведения его в соответствие с парами ссылкой пятна напечатаны в углах для этой цели. Штампованные идентификационный номер в массиве должны быть размещены на левой стороне было. Расположение органов управления и захвата антител, перечисленных в Приложении к правам фосфо-РТК массива таблицы.
Плотность пикселей на развитых пленка может быть собрана с использованием передачи в режиме сканера, такие как Совершенство Epson V750 PRO.
Создание шаблона для анализа плотность пикселей в каждой точке массива с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений программы. Совместимость программы включают ImageQuant или ArrayVision программное обеспечение от GE, Западной видение SOFtware с шаблонами, характерные для протеома Profiler массивы, BioRad Количество One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ и белка Простой AlphaView.
Экспорт значений сигнала в файл электронной таблицы для манипуляций в такие программы, как Microsoft Excel.
Определить среднюю сигнала (плотность пикселей) пары дубликатов пятна, представляющие каждый RTK.
Вычтите усредненного сигнала фона от каждого пятна. Использование сигнала от четкого области массива или отрицательные пятна контроля в качестве фонового значения.
Сравните соответствующие сигналы на разных массивах, чтобы определить относительное изменение уровня фосфорилирования RTK между образцами.

4. Представитель Результаты

Этот протокол показывает, как человека фосфо-РТК массив может быть использован для скрининга эффекты стимуляции лигандом и ингибиторов на фосфорилирования RTK. На рисунке 1 показаны данные для MDA-MB-453 клетки, которые были лечить, обрабатывали 100 нг/ Мл rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) в течение 5 мин, или предварительной обработке с известной семьи ErbB ингибиторов ^8-11 до HRGβ1 лечения. Для ингибитор экспериментов клетки инкубировали с 1 мкМ HDS 029, 200 нМ PD 153035, или 200 нМ PD 158780 в SFM течение трех часов. Каждый массив инкубировали с 100 мкг лизата. Увеличение фосфорилирования наблюдается ErbB2, ErbB3, и ErbB4 захвата пятна при сравнении с необработанными клетками HRG-β1 рассматривать MDA-MB-453 клеток. Обработка клеток всех трех ErbB семьи селективных ингибиторов до HRG-β1 инкубации привело к снижению ErbB2, ErbB3, и ErbB4 фосфорилирования.

На рисунке 2 показаны данные для Kato клетки III известны сверхэкспрессировать R2 RTK FGF. В этой серии экспериментов, Kato III клетки были лечить, обрабатывали 100 нг / мл rhFGF кислой (FGF) и 1 мкг / мл гепарина, или предварительно обработанных FGF R селективные ингибиторы ^12-15 до обработкиFGF и гепарин. Ингибиторы PD173074, PD 161570, 166285 и PD были использованы при концентрации 1 мкМ и инкубировали с клетками Kato III в течение 3 ч в сыворотке крови свободных СМИ. В то время как учредительный фосфорилирования и EGF и FGF R R2 в необработанных клетках KATO III, увеличение фосфорилирования R2 FGF наблюдался при лечении FGF. Инкубации клеток с PD 173074, PD 161570, 166285 или PD привело к снижению FGF и EGF R2 R фосфорилирования. Хотя эти ингибиторы, как известно влияет на фосфорилирование членов семьи FGF R, эти результаты показывают полезность человека фосфо-РТК массив для мониторинга влияния концентрации специфических ингибиторов может иметь на другие RTKs, такие как EGF R в этом случае.

Рисунок 1. Индукция и ингибирование рецепторовтор тирозин киназ фосфорилирования в клетках рака молочной железы. массива изображений с Proteome Profiler человека фосфо-РТК массивов и соответствующие профили гистограмме показано на рисунке. MDA-MB-453 клетки были необработанные или обработанные RTK ингибиторов с последующей обработкой NRG-β1/HRG-β1. Массив был использован для мониторинга эффектов ингибиторов киназы на фосфорилирования в MDA-MB-453 клеток. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 2. Индукция и ингибирование рецепторов тирозин-киназы фосфорилирования в клетках желудка рак. Массива изображений с Proteome Profiler человека фосфо-РТК массива и соответствующей гистограммы профилей показано на рисунке. Kato III клетки ЕНТreated или при лечении ингибиторами RTK с последующей обработкой FGF кислых и гепарин. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Ссылки

Хенрикссон, ML, Эдин, S., Далин, AM, Oldenborg, PA, Оберг, A., Van Guelpen, B., Rutegard, J., Stenling, R., & Palmqvist, Р. клеток колоректального рака активировать соседние фибробластов в результате В FGF1/FGFR3 сигнализацию и повышения вторжения. Ам. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011).
Morishita А., Gong, J., Nomura, T., Yoshida, H., Izuishi, К., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba Р., D'Armiento, J., & Masaki, Т. использования белка массивов для выявления наведения рецепторов тирозинкиназы для лечения рака толстой кишки человека. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010).
Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, В. Го, Т., Вонг, GC, Socci, ND, Maki, RG,DeMatteo, RP, Besmer П., и Антонеску, CR Молекулярная характеристика детских желудочно-кишечных стромальных опухолей. Clin. Cancer Res. 14, 3204-3215 (2008).
Стоммел, JM, Kimmelman, AC, Ин, H., Nabioullin Р., Ponugoti, AH, Wiedemeyer Р., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Бреннан, С. Чин, L., и DePinho, RA Coactivation киназ рецептор тирозин влияет на ответ опухолевых клеток к целевой терапии. наук. 318, 287-290 (2007).
Агарвал, С., Zerillo, C., Колмакова, J., Кристенсен, Дж. Харрис, LN, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, и Стерн, DF Ассоциации конститутивно активированного рецептора фактора роста гепатоцитов (Met) с устойчивостью к двойной EGFR/Her2 ингибитора в не-мелкоклеточный клеток рака легких. Br. J. Cancer. 100, 941-949 (2009).
Dewaele, BM, Floris Г., Finalet-Ferreiro, Дж. Флетчер, CD, Coindre, JM, GuillouЛ., Hogendoorn, PC, Возняк, А., Vanspauwen В., Schoffski П., MARYNEN П., Ванденберг, P., Sciot, R., & Debiec-Rychter, М. Со-активированной PDGFRA и EGFR являются потенциальной терапевтической цели в интимной саркома. Cancer Res. 70, 7304-7314 (2010).
Юн, YK, Ким, HP, Хань, SW, Гур, HS, О, DY, Im, SA, Bang, YJ, и Ким, Т. Сочетание EGFR и MEK1 / 2 ингибитора показывает синергетический эффект, подавляя EGFR/HER3-dependent AKT активации желудка человека раковых клеток. Mol. Рак Ther. 8, 2526-2536 (2009).
Fry, DW, Нельсон, JM, Slintak, В. Келлер, PR, Rewcastle, GW, Денни, WA, Чжоу, H., и мосты, AJ Биохимические и антипролиферативные свойства 4 - [Ar (алк) иламино] пиридопиримидины, Новый класс химической мощным и конкретные рецептора эпидермального фактора роста ингибитор киназы тирозина. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997).
Бос,М., Мендельсон, Дж. Ким, YM, Albanell, J., Фрай, DW, и Baselga, J. PD153035, ингибитор тирозинкиназы, предотвращает рецептора эпидермального фактора роста активации и подавляет рост раковых клеток в число рецепторов- зависимым образом. Clin. Cancer Res. 3, 2099-2106 (1997).
Stoll, SW, Kansra С., Peshick, С. Фрай, DW, Леопольд, WR, Wiesen, JF, Sibilia, М., Чжан, T., Werb, Z., Derynck, Р. Вагнера, EF, И старейшины, JT использования дифференциального и локализации ErbB рецептора тирозинкиназы в кожу по сравнению с нормальной и злокачественной кератиноцитов. неоплазии. 3, 339-350 (2001).
Klutchko, SR, Чжоу, H., Зимы, РТ, г. Чан, TP, мосты, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Эллиотт, WL, Мид, штат Массачусетс, Робертс, BJ, Фрай, DW, Gonzales, AJ, Харви , PJ, Нельсон, JM, Sherwood, В. Хан, HK, Pace, G., Smaill, JB, Денни, штат Вашингтон, и Шоуолтер, HD ингибиторы тирозин-киназы. 19. 6-алкnyamides из 4-anilinoquinazolines и 4-anilinopyrido [3,4-D] пиримидинов как необратимые ингибиторы ErbB семейства рецепторов тирозинкиназы. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006).
Кунии, К. Дэвис, Л., Горенштейн, J., Hatch, H., Yashiro, М., Di Bacco А., Elbi, C., & Lutterbach, Б. FGFR2 усиленный желудка линий раковых клеток требуется FGFR2 и ErbB3 сигнализации для роста и выживания. Cancer Res. 68, 2340-2348 (2008).
Чжоу, W., Гур, В. McDermott, U., Датта, А., Сиань, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Шарма, SV, Брюгге, J., Меерсон, М., Settleman, J . & Gray, NS структуры наведением подход к созданию ковалентных ингибиторов FGFR. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010).
Batley, BL, Догерти, М., Hamby, JM, Lu, GH, Келлер, П., Dahring, TK, Хван О., Crickard, К., и Панек RL Ингибирование FGF-1 рецептора тирозинкиназы по PD 161570 , новый белок-Тирозин киназ. Life Sci 62. 143-150 (1998).
Панек, RL, Лу GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, Hamby, JM, Халлак Х., Доэрти, AM, и Кайзер, JA В пробирке фармакологических характеристик PD 166285, новых наномолярных мощных и широко активный белок тирозин киназ. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997).

Discussion

Человек фосфо-РТК является экономичной и быстрой альтернативой традиционных методов, таких как иммунопреципитации (IP) для скрининга Западной изменений в фосфорилирования RTK. Используя этот метод, относительные уровни из 42 фосфо-RTKs были показаны одновременно с помощью одного образца MDA-MB-453 или Kato III клеточный лизат. Кроме того, этот массив анализа требуется 2,5 часа практического времени, что делает этот метод гораздо больше времени эффективным, чем выполнение нескольких IP-вестернов. Используя метод обнаружения хемилюминесценции, нет специализированного оборудования сверх того, что, как правило, используется для сбора данных Западная требовалось. Массивы являются чувствительными и могут быть использованы для сравнения изменений в фосфорилирования вызвано как лиганда и ингибитора лечения. Этот метод также позволяет оценить ингибитор селективность по от-целевого RTKs. Положительные хитов может быть дополнительно оцениваются с помощью количественного анализа, таких как ELISA.

Чтобы эффективно использовать массивы для выявления измененийВ фосфорилирования, некоторые ключевые экспериментальные принципы должны быть соблюдены. Во-первых, эксперименты должны включать соответствующие контрольные образцы. Например, в этих экспериментах эффект ингибиторов на MDA-MB-453 или Kato III лизатов были измерены на лизатов образцов, полученных в тот же день. Только массив данных, собранных в рамках одного эксперимента должны быть проанализированы, чтобы свести к минимуму изменения сигнала из-за различий в образце обработки, время инкубации, пипетки технику, или мыть технику. Сравнение интенсивности сигналов между двумя аналитов на той же мембраны не рекомендуется, поскольку захват антитела не были выбраны, чтобы иметь параллельные сходства.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась по R & D Systems, Inc

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.