围产期小鼠眼内视网膜下注射基因治疗载体与干细胞

摘要

该手术技术演示了将基因治疗载体和干细胞注射到小鼠眼球视网膜下腔的方法。

摘要

视力丧失影响了美国约340万人，并预计在未来几年内将进一步增加。¹ 近年来，基因治疗和干细胞移植已成为治疗由视网膜变性疾病导致失明的关键治疗手段。针对年龄相关性黄斑变性（AMD）的多种自体移植形式，例如虹膜色素上皮细胞移植，已取得令人鼓舞的结果，而其他形式的基因治疗和干细胞疗法也已进入人体临床试验阶段。² 这些疗法包括对莱伯先天性黑蒙患者进行的RPE65基因替代治疗，以及利用人胚胎干细胞（ES细胞）进行视网膜色素上皮细胞移植治疗斯塔加特病。^3-4 鉴于目前已有可用于治疗视网膜疾病患者的基因治疗载体和干细胞，因此在将其应用于人体研究之前，在动物模型中验证这些潜在疗法至关重要。小鼠已成为测试眼部基因治疗载体和干细胞移植治疗效果的重要科学模型。^5-8 在本视频文章中，我们介绍了一种将基因治疗载体或干细胞注射至小鼠眼内视网膜下腔的技术，同时最大限度地减少对周围组织的损伤。

方案

1. 组装用于视网膜下注射的装置

1. 购买或使用玻璃毛细管自行制备一支直径为 100 μm 的针头。可通过 Sutter P-97 拉针仪或其他类似设备手动完成。将毛细管末端加热并拉伸，直至达到所需直径（100 μm）。对于基因治疗载体，可使用更小直径的针头；但本直径是推荐用于细胞注射的尺寸，可避免对细胞或眼球造成损伤。与钢针相比，玻璃毛细管针头具有极细但钝化的尖端，便于观察注射液体并进入视网膜下腔，同时避免视网膜破裂。如需清洁，可用 70% 乙醇处理拉制好的针头，并存放于无菌容器中。一种保存注射针头的方法是使用直径 15 cm 的无菌细胞培养皿，并用胶带固定针头，以确保针头被覆盖且处于无菌环境中。此时，应在即将进行手术的手术室内完成全部装置的准备。为保持无菌状态，尤其是当操作在屏障设施内进行时，最简便的方法是将所有设备始终保留在手术室内。
2. 将硅油吸入注射针头，再推出硅油，使其在针头内壁形成一层涂层。硅油涂层可最大限度地促进细胞和病毒顺利通过针腔，防止其黏附在玻璃毛细管内壁上。
3. 使用无菌塑料管，剪取约 8 cm 长的一段，该塑料管来自带有鲁尔锁接头的 25 ¾ 号采血装置，在紧接针头后的位置剪断（将针头从管路中移除）。
4. 用无菌生理盐水填充一支 1 ml 皮下注射用 26 5/8 号滑动接头注射器，并将注射器上的针头取下。
5. 将注射针头连接至塑料管的切口端，将注射器连接至另一端的鲁尔锁接头。
6. 吸入无菌生理盐水，以填充管路和毛细针头中的死腔，并通过针头推出少量盐水，确保连接正确且无泄漏。随后，吸入一小段空气（约 1 μl）至注射针头尖端。这段空气可将生理盐水与注射液分隔开，在手术过程中提供视觉提示，以识别注射液的终点。注射装置在手术过程中应放置于经 70% 乙醇擦拭过的洁净表面上。此外，除注射针头外，所有手术中使用的设备均应在使用前后用 70% 乙醇清洁。注射针头应始终保持无菌并随时可用，手术后应予以丢弃，不得重复使用。
7. 最后，吸入含有目标包装型基因治疗病毒载体或干细胞的注射溶液。操作时可先用无菌移液器吸头吸取注射液，然后将其滴加至无菌细胞培养皿表面，再通过注射器将溶液轻松吸入注射针头中。所需注射体积因小鼠年龄而异。本实验中使用出生后第 5 天的小鼠，注射量为 0.5–0.8 μl。对于更年幼的小鼠，可使用更小体积（如 0.5 μl 或更少），而成年小鼠则可使用更大体积（如 1 μl）。病毒滴度或细胞数量需根据所注射的病毒/细胞类型及其靶组织确定，因在小体积中注入过多病毒颗粒或细胞可能导致视网膜细胞毒性。在本视频中，为便于观察，我们使用了 1.5 μl 的染料，其体积大于实际眼内注射所需。

2. 进入视网膜下腔

1. 在无菌手术室内，根据当地批准的动物操作规程对小鼠进行固定或麻醉，具体方法因小鼠年龄而异。成年小鼠常用的麻醉方法包括使用异氟烷气体，或按每10克体重0.1毫升的剂量腹腔注射氯胺酮（100 mg/ml）和赛拉嗪（20 mg/ml）的无菌生理盐水混合液。对于围产期小鼠，常用麻醉方法包括使用异氟烷气体或低温麻醉（低体温法）。所有麻醉方法在使用前必须获得本地IACUC委员会的批准。我们通常使用出生后第5天（P5）的小鼠，但类似技术也可应用于P0或成年小鼠。手术操作必须等到小鼠四肢停止活动、对脚趾夹捏无反应后方可开始。对于围产期小鼠，当其体色明显变浅时，表明血流减缓，这是判断其已完全进入麻醉状态的另一个关键指标。
2. 对于围产期小鼠，使用Vannas直剪在闭合的眼睑裂处做约1.5 mm的切口。注意应在眼睑未来的自然开裂处（即凹陷处）进行切割，以确保眼睑在小鼠发育过程中能够正常愈合并打开。也可使用手术刀完成此步骤，但我们更倾向于使用Vannas剪刀，因其可降低操作过程中刺破眼球的风险。在视频中，剪刀被直接用于穿刺并沿眼睑边缘剪开。初学者在操作时应先用镊子轻轻提起眼睑再进行切割，以降低损伤眼球的风险。
3. 使用弯头敷料镊将眼睑分开，使眼球突出，并在眼球下方轻轻夹住眼睑以维持眼球突出状态，便于注射。若第二步所做眼睑切口过大，眼球会滑回眼睑下方，导致注射过程中无法充分暴露。对于成年小鼠，可用敷料镊在眼球周围施加轻微压力，以维持眼球突出状态进行注射。
4. 使用15度显微手术刀轻划眼球赤道处或稍靠后的位置，制造一个小的巩膜切口。该切口仅需足够容纳注射针头尖端通过即可，不宜过大。如需要，也可使用细小锐利的针（如针灸针）代替显微手术刀，直接刺入视网膜下腔。在深色素动物中，切口处可见深棕色色素组织（脉络膜-视网膜色素上皮层）。在浅色素或白化小鼠中，可在显微手术刀尖端涂抹外科标记笔，留下墨点以标示切口位置。若切口处有透明液体（玻璃体）反流，说明刀片插入过深，已进入玻璃体腔，可能导致治疗性病毒或细胞在注射时进入玻璃体腔。为便于观察，视频中已将切口做到此深度。尽管此时仍可完成视网膜下注射，但由于注射液引起的视网膜脱离可能无法完全愈合。因此，注射前必须小心仅切开眼球外层，避免穿透视网膜。
5. 小心将注射针插入切口，并沿眼球外壁平行推进，进入视网膜下腔。若推进过程中过于贴近外壁或过深进入眼内，将导致注射位置错误。判断针头是否位于正确位置的最佳方法是通过练习掌握该技术。在浅色素或白化小鼠上练习有助于实现精确且准确的视网膜下注射，因为针头和注射液在这些小鼠眼中清晰可见。
6. 轻压注射器推杆，开始注入所需液体。若针头正确位于视网膜下腔，会感受到中等程度的回弹阻力。若针头位于玻璃体内，则回弹阻力显著减小，且注射过程中可能出现液体反流。若回弹阻力较大，应在拔出针头前保持针头位置至少额外15秒，以使眼内高压得以平衡，避免注射的病毒或细胞从切口处反流出来。由于注射过程中需要较高压力，部分空气和生理盐水可能被注入视网膜下腔。应注意避免过量注射空气或生理盐水，否则可能将已注入的病毒或细胞冲出眼外。此外，向视网膜下腔注入过多液体还可能导致永久性视网膜脱离。为便于观察，视频中向视网膜下腔注入了过量染料和空气。可以清楚看到，若注入过多，部分染料会被冲出视网膜下腔，而气泡则保留在视网膜下腔内，不会进入玻璃体。此操作旨在强调所有注射均准确位于眼球正确位置，以便观察针头应如何进入切口。所有视网膜下注射均会因注射液的存在而引起暂时性视网膜脱离。若注射操作正确，该脱离将在24小时内愈合，小鼠可继续用于后续实验。由于手术影响，眼球可能在约一周内保持较软状态，因此在此期间应避免进行第二次注射。
7. 对于新生小鼠，使用弯头敷料镊轻轻将眼球推回眼睑后方并复位至眼眶内。可等待约一分钟，使病毒在视网膜下腔充分沉降，避免在轻柔复位眼球时将其从切口处冲出。术后可在注射部位滴加一滴由25号针头注射的0.5%布比卡因（marcaine）生理盐水稀释液（稀释至0.25%）。小鼠在视网膜下注射手术后通常无明显痛苦表现，过去三年的实践表明，使用布比卡因作为长效局部镇痛剂已足够。手术后应持续监测小鼠是否出现痛苦迹象，如感染、肿胀或日常活动减少等。若出现上述情况，应通知兽医，并可给予如丁丙诺啡（0.05 mg/kg）等进一步镇痛药物，通过腹腔注射给药。
8. 根据当地批准的动物操作规程将小鼠从麻醉状态中唤醒。苏醒过程中应将小鼠置于加热垫上，以维持其正常体温。整个手术过程应在五分钟内完成（不包括麻醉时间）。因此，在实际操作过程中通常无需使用加热垫，但在学习该技术初期，由于操作时间可能较长，可能需要使用。小鼠必须在能够自主活动后方可放回清洁笼盒。对于新生鼠，可轻捏脚趾以帮助其完全恢复意识，待其恢复粉红色体色和正常活动能力后，方可放回母鼠身边。应持续观察小鼠是否出现前述痛苦迹象。

结果

图中展示了小鼠眼球的示意图，并标注了主要结构以供参考，箭头指示了玻璃体内注射和视网膜下注射手术的操作位置（箭头尖端，图1）。基因治疗载体（如 lacZ 慢病毒载体（图2））可通过这些位置进行注射。此外，干细胞（如小鼠胚胎干细胞（图3））也可移植至小鼠眼球的这些部位。

将1 μl携带由巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的lacZ报告基因的慢病毒载体（1×10⁸ TU/ml，Lentigen Corporation，图2A）注射至C57BL/6J小鼠的视网膜下腔。在小鼠6周龄时，通过钝性分离摘除眼球，并在1 mg/ml X-gal溶液（5 mM K₃Fe(CN)₆、2 mM MgCl₂、0.02% NP₄₀和0.1%脱氧胆酸钠）中37 °C孵育过夜。眼球用2%甲醛/0.2%戊二醛固定30分钟，随后用切片机进行切片...

讨论

本视频技术提供了成功完成视网膜下注射手术操作的指导，并确保基因治疗载体或干细胞被准确放置于有效治疗眼科疾病所需的位置。该技术能够靶向视网膜色素上皮细胞（RPE）或光感受器等视网膜细胞，因为它将基因治疗载体或干细胞来源的组织直接置于这些细胞附近。以往的方法采用玻璃体内注射，即将液体注入玻璃体腔内，使其穿过视网膜才能到达特定靶区。玻璃体内注射会降低靶向光感受器或RPE的基因治疗载体的转导效率，因为并非所有病毒颗粒都能迁移至正确位置。此外，干细胞在替代病变的RPE或光感受器方面正变得越来越受欢迎，而这些已分化的细胞必须被移植到视网膜下腔内。⁵

该操作的关键步骤是进入视网膜下腔，因为这能确保基因治疗载体或干细胞来源组织的准确位置，从而实现治疗效果，同时降低视网膜脱离或周围眼组织损伤的风险。操作前必须仔细排查并解决潜在问题，以准确定位并将液体注入视网膜下腔。可通过使用染色剂和白化小鼠进行练习（如视频所示），因为在有色小鼠的眼内无法观察到注射针头。经过练习后，研究人员将学会感知液体正确注入视网膜下腔时的压力差异，并能够熟练、及时地完成手术操作。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.8-1.10 x 100 mm 毛细管（玻璃）	Kimble Glass, Inc.	34502 99
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument	P-97	可使用 Narishige 微型玻璃针加工仪替代。目录号 #MF-900
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-25ML	硅酮
含氯化钙和氯化镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Gibco-Invitrogen	14040-133
Safety-Lok 25 3/4G x 12"; 血液采集套装	B-D Vacutainer	367298
1 ml 皮下注射 26 5/8G 滑动式针头注射器	Becton-Dickinson	309597
0.5-10 μl Finnpipette II 可调体积移液器	Fisherbrand	21-377-815
1-200 μl 天然斜面吸头	USA Scientific, Inc.	1111-1700
Discovery.V8 体视显微镜	Zeiss	MC1500
60 mm x 15 mm 经表面处理的聚苯乙烯细胞培养皿	Corning Incorporated	430166
Vannas 直头剪刀	Storz Ophthalmics	E3383 S
带锯齿的弯头精细敷料镊	Storz Ophthalmics	E1408
15 度显微外科手术刀	Wilson Ophthalmic Corp.	091204
氯胺酮	Ketaset III	NADA #45-290
赛拉嗪	Lloyd Laboratories	NADA #139-236
布比卡因（Marcaine）	AstraZeneca	N/A
丁丙诺啡	Sigma Aldrich	B9275