围产期小鼠眼内视网膜下注射基因治疗载体与干细胞

摘要

该手术技术演示了将基因治疗载体和干细胞注射到小鼠眼球视网膜下腔的方法。

摘要

视力丧失影响了美国约340万人，并预计在未来几年内将进一步增加。¹ 近年来，基因治疗和干细胞移植已成为治疗由视网膜变性疾病导致失明的关键治疗手段。针对年龄相关性黄斑变性（AMD）的多种自体移植形式，例如虹膜色素上皮细胞移植，已取得令人鼓舞的结果，而其他形式的基因治疗和干细胞疗法也已进入人体临床试验阶段。² 这些疗法包括对莱伯先天性黑蒙患者进行的RPE65基因替代治疗，以及利用人胚胎干细胞（ES细胞）进行视网膜色素上皮细胞移植治疗斯塔加特病。^3-4 鉴于目前已有可用于治疗视网膜疾病患者的基因治疗载体和干细胞，因此在将其应用于人体研究之前，在动物模型中验证这些潜在疗法至关重要。小鼠已成为测试眼部基因治疗载体和干细胞移植治疗效果的重要科学模型。^5-8 在本视频文章中，我们介绍了一种将基因治疗载体或干细胞注射至小鼠眼内视网膜下腔的技术，同时最大限度地减少对周围组织的损伤。

方案

1. 组装用于视网膜下注射的装置

1. 购买或使用玻璃毛细管自行制备一支直径为 100 μm 的针头。可通过 Sutter P-97 拉针仪或其他类似设备手动完成。将毛细管末端加热并拉伸，直至达到所需直径（100 μm）。对于基因治疗载体，可使用更小直径的针头；但本直径是推荐用于细胞注射的尺寸，可避免对细胞或眼球造成损伤。与钢针相比，玻璃毛细管针头具有极细但钝化的尖端，便于观察注射液体并进入视网膜下腔，同时避免视网膜破裂。如需清洁，可用 70% 乙醇处理拉制好的针头，并存放于无菌容器中。一种保存注射针头的方法是使用直径 15 cm 的无菌细胞培养皿，并用胶带固定针头，以确保针头被覆盖且处于无菌环境中。此时，应在即将进行手术的手术室内完成全部装置的准备。为保持无菌状态，尤其是当操作在屏障设施内进行时，最简便的方法是将所有设备始终保留在手术室内。
2. 将硅油吸入注射针头，再推出硅油，使其在针头内壁形成一层涂层。硅油涂层可最大限度地促进细胞和病毒顺利通过针腔，防止其黏附在玻璃毛细管内壁上。
3. 使用无菌塑料管，剪取约 8 cm 长的一段，该塑料管来自带有鲁尔锁接头的 25 ¾ 号采血装置，在紧接针头后的位置剪断（将针头从管路中移除）。
4. 用无菌生理盐水填充一支 1 ml 皮下注射用 26 5/8 号滑动接头注射器，并将注射器上的针头取下。
5. 将注射针头连接至塑料管的切口端，将注射器连接至另一端的鲁尔锁接头。
6. 吸入无菌生理....

结果

图中展示了小鼠眼球的示意图，并标注了主要结构以供参考，箭头指示了玻璃体内注射和视网膜下注射手术的操作位置（箭头尖端，图1）。基因治疗载体（如 lacZ 慢病毒载体（图2））可通过这些位置进行注射。此外，干细胞（如小鼠胚胎干细胞（图3））也可移植至小鼠眼球的这些部位。

将1 μl携带由巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的lacZ报告基因的慢病毒载体（1×10⁸ TU/ml，Lentigen Corporation，图2A）注射至C57BL/6J小鼠的视网膜下腔。在小鼠6周龄时，通过钝性分离摘除眼球，并在1 mg/ml X-gal溶液（5 mM K₃Fe(CN)₆、2 mM MgCl₂、0.02% NP₄₀和0.1%脱氧胆酸钠）中37 °C孵育过夜。眼球用2%甲醛/0.2%戊二醛固定30分钟，随后用切片机进行切片.......

讨论

本视频技术提供了成功完成视网膜下注射手术操作的指导，并确保基因治疗载体或干细胞被准确放置于有效治疗眼科疾病所需的位置。该技术能够靶向视网膜色素上皮细胞（RPE）或光感受器等视网膜细胞，因为它将基因治疗载体或干细胞来源的组织直接置于这些细胞附近。以往的方法采用玻璃体内注射，即将液体注入玻璃体腔内，使其穿过视网膜才能到达特定靶区。玻璃体内注射会降低靶向光感受器或RPE的基因治疗载体的转导效率，因为并非所有病毒颗粒都能迁移至正确位置。此外，干细胞在替代病变的RPE或光感受器方面正变得越来越受欢迎，而这些已分化的细胞必须被移植到视网膜下腔内。⁵

该操作的关键步骤是进入视网膜下腔，因为这能确保基因治疗载体或干细胞来源组织的准确位置，从而实现治疗效果，同时降低视网膜脱离或周围眼组织损伤的风险。操作前必须仔细排查并解决潜在问题，以准确定位并将液体注入视网膜下腔。可通过使用染色剂和白化小鼠进行练习（如视频所示），因为在有色小鼠的眼内无法观察到注射针头。经过练习后，研究人员将学会感知液体正确注入视网膜下腔时的压力差异，并能够熟练、及时地完成手术操作。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.8-1.10 x 100 mm 毛细管（玻璃）	Kimble Glass, Inc.	34502 99
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument	P-97	可使用 Narishige 微型玻璃针加工仪替代。目录号 #MF-900
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-25ML	硅酮
含氯化钙和氯化镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Gibco-Invitrogen	14040-133
Safety-Lok 25 3/4G x 12"; 血液采集套装	B-D Vacutainer	367298
1 ml 皮下注射 26 5/8G 滑动式针头注射器	Becton-Dickinson	309597
0.5-10 μl Finnpipette II 可调体积移液器	Fisherbrand	21-377-815
1-200 μl 天然斜面吸头	USA Scientific, Inc.	1111-1700
Discovery.V8 体视显微镜	Zeiss	MC1500
60 mm x 15 mm 经表面处理的聚苯乙烯细胞培养皿	Corning Incorporated	430166
Vannas 直头剪刀	Storz Ophthalmics	E3383 S
带锯齿的弯头精细敷料镊	Storz Ophthalmics	E1408
15 度显微外科手术刀	Wilson Ophthalmic Corp.	091204
氯胺酮	Ketaset III	NADA #45-290
赛拉嗪	Lloyd Laboratories	NADA #139-236
布比卡因（Marcaine）	AstraZeneca	N/A
丁丙诺啡	Sigma Aldrich	B9275