Summary
البصرية صفا موجزا لهذه التقنية الجراحية وجهاز يستخدم لإيصال (الجينات والخلايا) العلاجات في الحبل الشوكي. ويتجلى هذا الأسلوب في الحيوان بل هو ترجمة تماما والتي تستخدم حاليا لتطبيق البشرية.
Abstract
هذا هو وصف المدمجة المرئية لمجموعة من تقنية جراحية وجهاز لتوصيل (الجينات والخلايا) العلاجات في الحبل الشوكي. بينما أظهرت هذه التقنية في الحيوان، والإجراء هو وافقت عليها الهيئة والتي تستخدم حاليا لزراعة الخلايا الجذعية في النخاع الشوكي من المرضى الذين يعانون من المرض. في حين أن FDA قد اعترفت إثبات صحة المبدأ بيانات عن الكفاءة العلاجية في نماذج القوارض يتميز إلى حد كبير، ويعتبر استخدام الحيوانات الكبيرة الحاسمة للتحقق من صحة الجمع بين إجراء العمليات الجراحية، جهاز، وسلامة العلاج النهائي للاستخدام البشري . يتم التعرف على حجم، وعلم التشريح، والضعف العام في العمود الفقري والحبل الشوكي من الخنازير إلى الإنسان أفضل نموذج. وعلاوة على ذلك، فإن عملية جراحية لفضح التلاعب والحبل الشوكي وكذلك إغلاق الجرح في الخنازير لا يمكن تمييزه تقريبا من الإنسان. نعتقد أن هذا النموذج يمثل الخنزير صحية critiكال الخطوة الأولى في دراسة السلامة الإجرائية.
Protocol
1. استخدام الحيوان
وقد تمت الموافقة على إجراءات أثبتت هنا من قبل العناية جامعة إيموري الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC). وتستخدم النساء minipigs جوتنجن وزنها كيلوغرام تقريبا 15-20.
2. خدر
وصام ما يقرب من 12 ساعة الحيوانات قبل الجراحة. تخدير الحيوانات وتحريض التخدير تتكون من مزيج من الكيتامين العضلي (35 ملغ / كغ)، آسيبرومازين (1.1 ملغ / كلغ)، والأتروبين (0.04 ملغ / كلغ). ومدخل أنبوب ثم الحيوانات والحفاظ على الأوكسجين و٪ isoflurane 1-3 التخدير العام. في هذه النقطة، يتم حلق الظهر والرأس من كل حيوان. ويتم رصد عمق التخدير من قبل الكوادر البيطرية. وتستخدم غياب ردود الفعل بين الأصابع، والقرنية الجفن، وكذلك القلب والجهاز التنفسي حال، قياس التأكسج النبض، مباشرة / غير مباشرة ضغط الدم، ونهاية المد والجزر قياسات ثاني أكسيد الكربون، وقوة العضلات / استجابة للمؤثرات الضارة لرصد عمق من التخدير.
3. وضع
يتم أخذ الحيوانات إلى غرفة العمليات، ووضع في وضعية الرقود على العرف الإطار مصممة لتقليد المرضى لتحديد المواقع على طاولة جاكسون الجراحية الشوكي. الإطار تستخدم الرافعات قابل للتعديل التي توضع تحت الصدر والحوض من الحيوان، مما يسمح البطن لشنق مجانا، وبالتالي تقليل الضغط على البطن والصدر ونزيف وريدي يترتب فوق الجافية (الشكل 1). كما يوفر الإطار الخارجي للتجميد العمود الفقري لهذا الإجراء 1.
بالإضافة إلى ذلك، يتم وضعها على وسادة الحيوانات إعادة تعميم ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم والأذن وريد هامشية مقسطر لإدارة السوائل وتقديم الأدوية اللازمة أي أثناء الجراحة. وأخيرا، وهيأهم مجال الجراحية مع الكحول وحل Chlorhexadine أو Betadine وتوضع الستائر الجراحية في الميدان الجراحية.
جنيه "> 4. الثقبيتم تنفيذ الجلد حوالي 10-15 سم ويتم تشريح شق عضلات محيطة بالنخاع قبالة العمود الفقري ثنائيا. المقبل، يتم تنفيذ الظهرية متعددة المستويات الثقب. تتم إزالة الصفيحة والعمليات الشائكة من المغطي فقرات 3 C3-C5-L4 أو L2 شرائح باستخدام قراضة والحفر الجراحية.
5. موضع ديريك الشوكي
ندعو ديريك الشوكي للجهاز مصمم لتقديم (الجينات والخلايا) في العلاجات 2-5 الحبل الشوكي. ويمكن الاطلاع على مناقشة مفصلة عن تصميم وتطور هذا الجهاز على رايلي وآخرون، 2011 .. 4
لتأمين جهاز للمريض، يتم وضعها عن طريق الجلد من خلال شقوق المشاركات الجلد 1CM فوق وتحت شق الابتدائية وشنت على الصفيحة فوق وتحت شق الأولية.
المقبل، وترد 2 الكامشات متكامل لFOاور عن طريق الجلد المشاركات فوق وتحت موقع شق لفضح مجال العمود الفقري التي مرت الثقب.
6. افتتاح الجافية
مع المعونة من أداة ودسون الأسنان وشفرة 11، يتم إجراء شق 2.5 سم من خلال الجافية، ويعرض الحبل الشوكي. ينعكس دورا بعيدا عن طبقة باستخدام حنوني 4-0 خياطة وNurolon الممنوحة للعضلات محيطة بالنخاع عميقة.
توضع الفطائر الجراحية في منقاري والذيلية المتطرفة من الافتتاح. هذه توفر حاجزا جزئي لتدفق السائل المخي الشوكي، وكذلك تقديم هدفا آمنة للجراحين لوضع المصاصون دون إتلاف سلك. في البشر، تحت المجهر التكبير الجراحية، يتم تشريح سطح حنوني في هذه المرحلة. بسبب القيود التقنية، لا يشترط هذا الإجراء ممكنا أو في الحيوانات.
7. حقن الحبل الشوكي والتشرد الجانبي للديريك الشوكي لحقن إضافيةق
مباشرة قبل الحقن، يتم إعطاء بلعة من methylprednisolone (125 ملغ، IV) لمنع تورم الحبل الشوكي.
عند هذه النقطة، يتم إرفاق منصة نظام السكك الحديدية ويتم ضبط الجانب القضبان لتناسب الطول المناسب. جندول هو أعلى تحميلها على أشرطة (2) ويتم تحميل محرك الأقراص Z على عالمية مشتركة. المقبل، يتم وضع قنية تحميلها على ميكرودريفي. باستخدام عالمية مشتركة على منصة حقن مكروي، يتم ضبط زوايا الاكليلية والسهمي لضمان مسار متعامد على سطح حقن العمود الفقري تتبع موضع قنية. يتم وضع إبرة الإنسي وفقا لذلك إلى منطقة الجذر الظهري دخول (DREZ). يتم التعرف على الإصدار 3.5x التكبير DREZ تحت العدسة الجراحية وتوغلوا في مسار متعامد على السطح الحبل عند نقطة <1 مم بشكل إعلامي.
في البشر، والتصوير بالرنين المغناطيسي قبل العملية يوفر الأساس تقييم سو أبعاد الحبل الشوكي للتخطيط المنطوق. وعلاوة على ذلك، يتم قياس سمك الحبل الشوكي لتحديد عمق الهدف من القرن البطني.
هي التي غرست في التعليق على عمق 4 مم من الاتصال حنوني. A شفة المصنوعة من البلاستيك آلتم بمثابة سدادة على سطح الحنون لمنع الإبرة من التقدم أعمق من المطلوب. مرة واحدة يتم وضع إبرة في تلميح الهدف، يتم سحبها كم المعادن الصلبة الخارجي يصل، وترك أنابيب مرنة عرضة للخطر. بمجرد الانتهاء من الحقن، ويتم ترك الإبرة في مكان لحد أدنى 1 إضافية لمنع ارتداد الخلية يصل الجهاز حقن قنية.
والحرص على تجنب الأوعية الدموية السطحية من خلال تعديل طفيف في ميكرودريفي إما تجانب أو rostro نحو caudally. قد يكون بعض النزيف من مواقع الاختراق يحدث. عند مواجهة مثل هذه النزيف، توضع الفطائر الصغيرة على موقع النزيف وثقب يتم تطبيق الشفط لهم لالفتيل الدم من penetr قنيةموقع أوجه ومنع تراكم في الحبل. وهذا يسمح للدم بشكل موثوق لتخثر. يتم تجنب الكي كما هو الضغط المباشر.
بعد إزالة الإبرة، ونقل جهاز التجسيمي إلى موقع الهدف التالي على طول محور rostro-الذيلية، مفصولة 2 أو 4 مم أو عند الضرورة لتجنب الأوعية الدموية مرئية على السطح الظهري للنخاع. وتتكرر هذه العملية عدة مرات على النحو المقترح في دراسة معينة.
8. العائمة قنية
يتم استخدام قنية ذات قطر ضخ مخصصة لضيق الحقن. وقنية يتكون من إبرة قياس 30-مشطوف من طول ثابت متصلة أنابيب قياس 30-حية مزروعة سيلوستيكيا مرنة من طول متغير. تم تجهيز الطرف البعيد مع تأمين الأنبوب هاملتون التي يتم تركيبها على مضخة microinjector. ومغمد الأنبوب القريب حية مزروعة سيلوستيكيا خلال قنية 24-قياس خارجية صلبة أن المقاعد على الطرف القريب من حقن إبرة شفة. هذا كل شفة المقاعدوقنية الخارجي ويخدم كمحطة لعمق الإبرة الحقن. لكل الحقن، هي التي غرست حجم مناسب لتعليق العلاجية من قبل. باستخدام ما قبل معايرة MINJ-PD microINJECTOR مضخة (Tritech البحوث، وشركة، ولوس أنجلوس، CA) بمعدل من 5 ميكرولتر في الدقيقة
9. إغلاق
مرة واحدة وقد بذلت جميع الحقن، تتم إزالة بلطف ديريك الشوكي، وتغلق فيه شقوق في أربع طبقات. يتم إغلاق الجافية باستخدام Nurolon 4،0 غرزة، بطريقة ماء. ومستعملة 0 Vicryl خياطة لطبقة العضلات العميقة. ثم يتم إغلاق اللفافة مع خياطة Vicryl 0 أيضا بطريقة ماء. وأخيرا يتم إغلاق الجلد مع طبقة Vicryl 2.0، مع غرزة على التوالي. اكتمال إغلاق الجلد باستخدام الخيط النايلون 3-0.
10. الانتعاش وإدارة الألم
وextubated الحيوانات ومراقبتها لمدة 2 ساعة التخدير الانتعاش التالية. المقبل، يتم نقل الحيوانات لج الفرديةالأعمار و. رصد ما لا يقل عن مرة واحدة يوميا للاستهلاك الغذائي، التغوط، والتبول
لإدارة الألم، ويتم تدبيس رقعة الفنتانيل عبر الجلد (75 ميكروغرام) على الجزء الخلفي من الحيوانات لمدة ثلاثة أيام بعد العملية تسكين. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا البوبرينورفين (0.05 مغ / كغ، BID، IM) تعطى لمدة تصل إلى ثلاثة أيام بعد العملية.
11. النتائج والمخرجات الممثل
يتم تنفيذ الملاحظات السريرية والسلوك قبل الجراحة وبعد ذلك سجلت في أيام 1 إلى 7 وحتى نقطة النهاية الأسبوعية وفقا لتصميم الدراسة. ويتم جمع البيانات السلوكية لتقييم اعتلال عصبي كما هو موضح سابقا 6. ويتم تقييم وظيفة الحواس عن طريق وجود أو عدم وجود استجابة لانسحاب التحفيز الميكانيكي لأصابع القدم الأمامية وأطرافه من الخلفيتين. يتبع الوظيفة الحركية نقاط Tarlov (الجدول 1): 0 - الشلل، لا حركة، 1 - توترية ملموس في الأطراف الخلفية، m طفيفovement، 2 - الحركة في الأطراف الخلفية، ولكن غير قادر على الجلوس أو الوقوف، 3 - القدرة على الوقوف والمشي ولكن ورنحي لفترات قصيرة؛ 4 - الانتعاش الكامل، وظيفة عادية للسيارات.
يتم تحديد سلامة الإجراء الذي من قدرة الحيوان على العودة إلى خط الأساس قبل العملية. يجب أن العجز العصبية عابرة في الغالب في حل بعد الجراحة بين 1 و 7 أيام، مع بعض الاختلافات تبعا لسلالات الحيوانات والإجراءات (عدد الحقن، من بين غيرها من المعالم). يتم تعريف الاعتلال العصبي الدائم بسبب العجز المالي الدائم الذي لا حل في الوقت الحيوانات تصل إلى نقطة النهاية IACUC الافتراضي (الشكل 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
| Tarlov نقاط | |
| 0 | شلل، أي حركة |
| 1 | توترية ملموس في الأطراف الخلفية، حركة طفيفة |
| 2 | الحركة في الأطراف الخلفية، ولكن غير قادر على الجلوس أو الوقوف |
| 3 | القدرة على الوقوف والمشي ولكن ورنحي لفترات قصيرة |
| 4 | استكمال الانتعاش، وظيفة عادية للسيارات |
ويتم تقييم نقاط جدول Tarlov 1. الاعتلال العصبي والانتعاش بتسجيله ظيفة الحيوان السيارات.
الرقم المواقع الجدول 1. لالاجراءه. يتم وضع الحيوانات في وضعية الرقود على العرف الإطار مصممة لتقليد المرضى لتحديد المواقع على طاولة جاكسون الجراحية الشوكي. الإطار تستخدم الرافعات قابل للتعديل التي توضع تحت الصدر والحوض من الحيوان، مما يسمح البطن لشنق مجانا، وبالتالي تقليل الضغط على البطن والصدر ونزيف وريدي يترتب فوق الجافية. كما يوفر الإطار الخارجي للتجميد العمود الفقري لهذا الإجراء.
الرقم ظيفة الحركة 2. تقييم نتائج والممثل. الحيوانات الخضوع لفحص قبل الجراحة العصبية العامة وعلى أساس منتظم بعد الشفاء الكامل من هذا الإجراء. يتم تقييم مشية وظيفة الحركة وفقا لدرجة Tarlov. هذا النطاق يوفر معايير موضوعية تقييم قدرة الحيوانات على التجول باعتباره surroالتدبير بوابة ظيفة الحركة. يتم تحديد سلامة الإجراء الذي من قدرة الحيوان على العودة إلى خط الأساس قبل العملية. يجب أن العجز العصبية عابرة في الغالب في حل بعد الجراحة بين 1 و 7 أيام، مع بعض الاختلافات تبعا لسلالات الحيوانات والإجراءات (عدد الحقن، من بين غيرها من المعالم). يتم تعريف الاعتلال العصبي الدائم بسبب العجز المالي الدائم الذي لا حل في الوقت الحيوانات تصل إلى نقطة النهاية IACUC الافتراضي.
إضافي
يتم وضعها في حالة العلاج بالخلايا، وذلك قبل الثقب وتحت التخدير، وريد 10F الوداجي القسطرة المزمن (تقنيات الوصول، CCPS072106A) للإدارة في الوريد الادوية المثبطة للمناعة لمدة الدراسة. وهيأهم عنق الحيوان ورايات. يتعرض الوريد الوداجي الداخلي جراحيا ومقنى مع القسطرة، التي يتم تأمين مع ربطة عنق من الحرير 3-0. نهاية القريبة من الوداجي الداخلي هون ligated مع ربطة عنق من الحرير 3-0. المقبل، والقسطرة نفق للخروج من جلد الرقبة ظهريا والمضمون مع 3-0 غرز النايلون. وأخيرا، يتم ري الجرح ومغلقة مع غرزة تشغيل النايلون 3-0. غير مطلوب إجراء من هذا القبيل في البشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من الموافقة على المضي قدما في تقنية الموضحة في البشر 7-9، أسئلة حرجة لا يزال يتعين الإجابة عليها حتى لعلاجات الحبل الشوكي لتحقيق النجاح. مطلوب فهم دقيق للالتسامح الحبل الشوكي لحقن intraparenchymal لتمكين تخطيط وتنفيذ المحاكمات تطوير علاجات لالمزيل، التنكسية، وأمراض الحبل الشوكي الصدمة. حاليا، لا يوجد فهم واضح لعدد من الحقن أن الثدييات الكبيرة الحبل الشوكي يمكن أن يتسامح دون الاعتلال عابرة ودائمة. وبالمثل، تباعد من الحقن ومن المحتمل أن يؤثر الاعتلال. وعلاوة على ذلك، العيانية (على سبيل المثال، التهوية أو غير مقصودة ذات الصلة حركة المريض) والمجهرية (أي مع كل من التذبذب نبض القلب والتهوية) تحركات الحبل الشوكي تشكل خطرا على الحبل الشوكي أثناء الحقن. وفهم عتبة الاعتلال في نموذج حيواني كبير مساعدةالجرعات حسابات لجميع برامج الحبل الشوكي العلاج. لدينا متعدية زرع النخاع الشوكي المختبر متاح لمساعدة برامج التنمية قبل السريرية من جميع الفرق حاليا تصميم التجارب لتطبيق الحبل الشوكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الدكتور Boulis هو مخترع لتمكين أجهزة الحقن المأمونة ودقيقة من الحبل الشوكي الإنسان. وقد اشترت Neuralstem، وشركة على رخصة حصرية لهذه التكنولوجيا. تلقى الدكتور Boulis حصة في invento من هذا الرسم، ولها الحق في دفع الرسوم لتوزيع هذه التكنولوجيا. مؤلفين آخرين ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر شعبة جامعة إيموري الموظفين الثروة الحيوانية والرعاية البيطرية ل. مصادر التمويل ما يلي: ALS جمعية، وزارة الدفاع، وشركة Neuralstem،
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
- Usvald, D., et al. Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs. Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).
- Riley, J., et al. Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation. Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).
- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
- Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery. Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).
- Riley, J., et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, 164-171 (2011).
- Boulis, N. M., et al. Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Rev. Neurol. , (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes. Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).
- Boulis, N. M., et al. Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients. Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).
