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方法文章

利用气相色谱-多通道记录技术（GCMR）鉴定昆虫触角叶中的嗅觉挥发物

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DOI：

10.3791/4381

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2013年2月24日

 ,  , 
1Department of Biology, University of Washington

本文内容

摘要

嗅觉信号介导昆虫的多种不同行为，通常是由数十至数百种挥发性化合物组成的复杂混合物。我们采用气相色谱结合昆虫触角叶的多通道记录技术，描述了一种用于鉴定生物活性化合物的方法。

摘要

所有生物都生活在一个充满感觉刺激的世界中，这些刺激决定了它们对环境的行为和生理反应。嗅觉在昆虫中尤为重要，昆虫利用其嗅觉系统对复杂的气味刺激作出响应并加以区分。这些气味会引发介导繁殖和栖息地选择等过程的行为1-3。此外，昆虫的化学感知还调控着对农业和人类健康具有重要意义的行为，包括传粉4-6、农作物植食性损害7以及疾病传播8,9。因此，识别嗅觉信号及其在昆虫行为中的作用，对于理解生态过程以及人类的食物资源和福祉具有重要意义。

迄今为止，鉴定驱动昆虫行为的挥发性物质一直较为困难且常十分繁琐。现有技术包括气相色谱-触角电位联用记录法（GC-EAG）以及气相色谱-单感器电生理记录法（GC-SSR）10-12。这些技术已被证明在生物活性化合物的鉴定中至关重要。我们开发了一种方法，将气相色谱与来自触角叶（AL；昆虫主要的嗅觉中枢）神经元的多通道电生理记录联用（称为“GCMR”）13,14。这一先进技术使我们能够探究气味信息在昆虫脑中的表征方式。此外，由于在该嗅觉处理层级上，触角上的受体神经元向AL神经元高度汇聚，导致神经元对气味的反应极为敏感，因此AL记录能够高效且高灵敏度地检测天然气味中的活性成分。本文将介绍GCMR方法，并举例说明其应用。

检测生物活性挥发物及昆虫反应通常涉及几个基本步骤。首先，需要从感兴趣的来源收集挥发物（本示例中使用的是透骨草科Mimulus属的花朵），并根据需要采用标准的气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）进行成分分析14-16。昆虫经最小程度的解剖处理后即可用于实验，随后将记录电极插入其触角叶，开始多通道神经信号记录。对神经数据进行后续处理，即可确定哪些特定的气味分子能够引起昆虫神经系统显著的神经反应。

尽管本文所展示的示例主要针对传粉研究，但气相色谱-多重反应监测（GCMR）技术可拓展应用于多种研究生物和挥发性物质来源。例如，该方法可用于鉴定吸引或驱避媒介昆虫及农作物害虫的气味物质。此外，GCMR还可用于识别对有益昆虫（如传粉昆虫）具有吸引作用的化合物。该技术亦可进一步扩展至非昆虫研究对象。

方案

1. 挥发性物质采集

  1. 在本示例中，我们使用来自M. lewisii花朵的挥发性样品——这是一种原产于加利福尼亚州的高山野生花卉。挥发性物质的收集采用动态吸附法，具体方法参照Riffell et al.14。简而言之，该方法采用封闭循环捕集系统，将花朵密封于特氟龙袋中。利用惰性真空泵，将花朵周围的空气抽吸通过一个“捕集阱”，该捕集阱由填充Porapak Q介质的巴斯德移液管构成。泵的回气经活性炭过滤。在规定的时间段（本实验中为24小时）后，用非极性溶剂（通常为正己烷）洗脱Porapak Q介质，以收集浓缩提取物。提取物随后储存于-80 °C，直至进行分析。如有需要，可在分析前用氮气流对样品进行浓缩。除非样品已有明确的成分表征，否则在使用样品前，应取部分样品通过气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析，以鉴定其挥发性组分。

2. 电生理学准备

  1. 用剪刀从1,000 μl移液器吸头末端剪下约1 cm。将一只大黄蜂（Bombus impatiens）放入吸头底部，轻轻推动至吸头另一端，直至仅头部露出。
  2. 熔化牙科蜡，并将其塑形包裹在暴露的头部周围，确保蜡牢固地附着在复眼上，以固定头部并使其完全不能移动。注意不要将任何蜡沾到蜜蜂的触角上。
  3. 待头部固定后，使用剃刀刀片或适当尺寸的解剖刀在头壳上做一个方形、窗口状的切口，以切开外骨骼。从头壳背面开始切割，位置位于触角后方并紧邻一侧复眼。先从一侧复眼沿直线切至对侧复眼；完成该直线切割后，继续向背侧切开，直至头壳弯曲并接近其与胸部连接处。此时，开始向头壳的另一端切割。最后，当切至头壳远端后，再切一条线返回初始切口的起点。必须去除紧邻触角的那部分外骨骼，否则会阻碍电极的插入。
  4. 外骨骼切开后，用一对镊子小心移除蜜蜂的头壳，从而暴露其脑组织，尤其是触角叶。脑组织暴露后应立即用昆虫生理盐水进行灌流，防止脑组织干燥。暴露脑部后，再用一对极细的镊子仔细去除位于触角叶上方的神经鞘膜。操作时务必小心，避免镊子刺破蜜蜂的脑组织。

3. 带多通道记录的气相色谱法

  1. 蜜蜂“准备”——固定在管中并暴露其脑部——现已准备好进行电生理记录。将蜜蜂置于夹具中，并固定在位于气浮台上的磁性底座上。
  2. 将静脉输液袋、流量控制器和管路（内充满昆虫生理盐水）摆放妥当，使生理盐水持续灌流脑组织。
  3. 使用显微操作仪将由钨丝制成的参考电极插入蜜蜂的复眼中。
  4. 使用另一个显微操作器，插入多通道电极，例如盘绕导线式四极电极或硅基多通道电极（Neuronexus Technologies）， 进入蜜蜂的触角叶。该电极连接至前置放大器，例如TDT系统的S-3 Z系列，再接入TDT系统的Z-bus生物放大器处理器。气相色谱仪检测器的输出信号可通过屏蔽BNC电缆与放大器及数据采集系统连接，从而使神经信号与气相色谱信号实现同步。
  5. 等待神经记录信号稳定，约需30–60分钟。当记录通道中神经元的自发活动和波形形态趋于稳定后，使用气味注射器刺激蜜蜂，并观察记录通道对气味的响应。
  6. 通过自动设定记录通道的阈值为各通道信号的3.5至5倍标准差（sigma），记录神经元的细胞外峰电位。部分通道可能需要手动设定阈值，以避免电噪声的干扰。神经元的动作电位在记录通道中表现为电压尖峰。当通道电压超过阈值时，系统将缓冲并保存阈值跨越前后数毫秒内的信号，从而获取该波形或峰电位的片段。
  7. 紧邻气相色谱仪的是气桌。在将花提取物注入气相色谱仪之前，需确认气相色谱运行的程序升温方法设置正确。在本示例中，我们采用的温度程序为：起始温度50 °C，保持4 min，随后以10 °C/min的速率升温至220 °C，并在此温度下再保持6 min。我们使用DB-5气相色谱柱（J&W 公司，美国加利福尼亚州福尔松），载气为氦气。进样口为不分流模式，温度设为 200 °C。火焰离子化检测器温度设为 230 °C。
  8. 将花香头部空间的提取样品注入气相色谱仪的加热进样口，使吸附的挥发性物质释放至气相色谱柱中。色谱柱流出物通过玻璃“Y”型连接器（J）以1:1的比例分流至火焰离子化检测器（FID）和蜜蜂触角。&W Scientific）。开始向气相色谱仪中注入样品时，同步启动电极记录。
  9. 气相色谱运行结束后，让样品静置5至15分钟。随后可向气相色谱仪注入另一个样品，或使用单一挥发性化合物或化合物混合物刺激样品。在后一种刺激方法中，来自恒定气流的空气脉冲被引导通过一个玻璃注射器，该注射器内装有一张滤纸，滤纸上已沉积有所需化合物。气味刺激通过软件控制的电磁阀以脉冲方式施加。
  10. 若单位活动突然停止或发生变化，应检查生理盐水滴注情况，并让制备样本静置15分钟。如果自发活动未能恢复至先前水平，则应弃用该样本，如有备用蜜蜂，应更换蜜蜂重新实验。
  11. 实验结束后，将探针保留在组织中，用5%甲醛固定脑组织20分钟。随后取出脑组织，置于2%戊二醛中固定4小时，接着进行梯度乙醇脱水，并用冬青油透明脑组织。根据组织的固定与透明效果，可通过共聚焦显微镜清晰观察到电极在前脑（AL）穿刺部位的位置。

4. 数据分析

  1. 实验结束后分析采集的数据，以分离和识别记录到的神经元单位。使用常用软件程序（Offline Sorter、MClust 和 SClust）根据动作电位波形的形态特征（如峰电位或谷电位的幅值、峰半宽等）或降维参数（主成分）对波形或“尖峰”进行分类。17,18 (图2）。仅使用在三维空间（PC1-PC3）中分离且彼此间具有统计学差异的簇状峰电位（多元方差分析； p < 0.05) (图2) 进行进一步分析。有关四极电极记录和峰电位分类方法的完整描述，请参见参考文献17-19。
  2. 对每个簇中的峰电位进行时间戳标记，并导出这些数据，使用 MATLAB 或 Neuroexplorer（Nex Technologies，Winston-Salem，NC）生成点阵图和放电率响应图2、图3A).
  3. 使用同步记录的气相色谱（GC）数据确定挥发性物质的保留时间。根据色谱图中峰顶点所确定的挥发性物质保留时间，检查相应时间点的单位响应。
  4. 通过气相色谱运行过程分析单个神经元单位的反应，将尖峰数量按100毫秒时间间隔进行分 bin，并参照挥发性物质洗脱的保留时间，考察放电频率反应的时间进程。以100毫秒间隔对尖峰进行分 bin 可提供足够的细节或信号，用于解析神经元对从气相色谱中洗脱出的气味物质所产生的反应时间进程。
  5. 为了分析群体神经元对不同洗脱挥发物的响应，对单个神经元在挥发物保留时间前后各1.5秒、共计3秒采样窗口内的放电率响应进行积分。图3）。该时间范围通常与气相色谱流出的挥发性物质持续时间相当。我们通过颜色编码（红色表示高发放率反应，蓝色表示低发放率反应）展示各神经元的发放率反应，并将其排列为活动矩阵，其中每一行代表神经元群对气相色谱流出物（列）的反应集合图3).

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结果

在使用GCMR检测时 M. lewisii 花香，我们注入 3 μl 提取物注入GC。通常有60-70种挥发性物质随GC洗脱出来。其气味为 M. lewisii 主要由单萜类化合物组成，包括 β月桂烯（无环）和 α-pinene，其余气味成分由六碳挥发物（如2-己醇）和倍半萜类化合物组成 < 1% 的顶空部分。

GCMR 利用了触角叶神经元对生物重要挥发性物质的敏感性以及神经元对这些物质的处理能力。然而，此类多通道记录实际上是对触角叶中神经元的随机采样，因为在不同制备之间探针位置的微小变化都可能导致记录阵列采集到不同的神经元。此外，由于记录方式为细胞外记录，所记录神经元的精确位置和形态结构均未知。为了弥补这些影响，我们通常进行 8 到 16 次制备的 GCMR 实验，每次制备包含 8 到 18 个神经单元。但为了说明目的，本文仅使用一次制备的数据（8 个神经单元）。

通过GCMR实验，我们发现神经元单位对挥发性物质的反应出人意料地具有选择性，如<...

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讨论

昆虫的嗅觉介导行为驱动着多种不同的生理过程，包括繁殖、寄主位点选择以及适宜食物资源的识别。对这些过程的研究需要能够鉴定出气味源释放的挥发性物质，同时还需要确定其中介导行为反应的化合物。复杂之处在于，气味通常由数十至数百种单一化合物组成，这些化合物共同形成一种独特的气味，其感知效果与各单一组分不同6,7,13,19,20。早期在性信息素系统12中的研究，以及近年来在与食物和产卵相关气味方面的研究13,20表明，混合物的行为有效性取决于其中少数关键挥发性成分，且混合物引发的行为反应显著强于其任何单一组分。因此，鉴定这些关键组分是现代化学生态学和嗅觉神经生物学研究中的重要环节。

在过去五十年中，出现了多种用于鉴定驱动昆虫行为的生物活性化合物的技术。昆虫触角检测挥发性物质的主要技术是气相色谱-触角电位联用技术（GC-EAG）。触角电位（EAG）最初由Schneider21开发，其记录的是刺激过程中昆虫触角尖端与基部之间大量嗅觉神经元电去极化所引起的小幅电压波动。随后，EAG与气相色谱（GC）联用，以精...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国家科学基金会（NSF）资助项目 IOS 112692 以及华盛顿大学研究基金会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Porapak Type Q 80-100 网目WatersWAT027060
Reynolds 烤箱袋Reynolds
气相色谱仪（GC）Agilent7820A
气相色谱柱J&W Scientific, Folsom, CA, USADB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm)
分析用氦气载气PraxairHE K1 cc/min
16通道硅电极Neuronexus Technologiesa4x4-3mm50-177
细丝 NiCr，直径 0.012 mmSandvik Kanthal HP ReidPX000004用于制作定制的四极电极和立体电极
前置放大器Tucker-Davis SystemPZ-2
放大器Tucker-Davis SystemRZ-2
数据采集系统 - OpenEx 套件Tucker-Davis System
在线尖峰信号分类软件 - SpikePacTucker-Davis System
离线尖峰信号分类软件 - Mclust 尖峰信号分类工具箱David Redish，明尼苏达大学神经科学系可于 http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html 免费下载MATLAB 工具箱

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