用气相色谱 - 多单元的录音（GCMR）昆虫触角叶嗅觉挥发物的鉴定

1。挥发性Follection

1. 在这个例子中，我们使用挥发性样品M. lewisii花-高山野花原产于美国加州。收集挥发物，采用动态吸附方法，根据到Riffell 等^。14。简单地说，该方法采用一个闭环特氟隆包括在花捕集系统。使用的惰性的真空泵，花的周围空气被吸入，通过一个"陷阱"巴斯德吸管包括充满PORAPAK Q矩阵。从泵的返回空气通过活性炭过滤。一规定时间周期之后，在我们的情况下24小时，PORAPAK Q矩阵，用一种非极性溶剂中，典型的己烷洗脱，收集的浓缩提取物。的提取物，然后储存于-80℃直至分析。如果有必要，样品可以被集中在分析之前，下的氮气流。除非样品良好的特点，运行等分，它通过一个气相色谱 - 质谱（GC-MS）使用样品之前确定挥发性成分。

2。电准备

1. 剪切约1厘米，从1,000微升的移液管尖的末尾。放置一个熊蜂（ 熊蜂的凤仙花 ）到移液管尖端部的基础上，并轻轻推向相对端的前端，直到只有头部露出。
2. 牙科用蜡融化，并在外露的头，模具的蜡附着在安全的复眼，使蜜蜂的头部完全不动。请务必不要让任何到天线的蜜蜂蜡。
3. 一旦头是安全的，做成正方形，窗口等，切口进入头部胶囊用剃刀刀片断路器或适当大小的手术刀切角质层。使用刀片的断路器，从背侧的头壳，紧接后面的天线和相邻的一个的化合物眼。切一条直线上，从一个复眼对侧复眼。直线切割后到对面的复眼，开始做一个切口，背部，直到头壳曲线和其胸部两端附近。在这一点上，朝向头部胶囊的相对端开始削减。最后，一​​旦一条线被切断的相对端，切断回线的初始切口到起始位置。重要的是要除去角质层是相邻天线，因为这会妨碍插入电极。
4. 的角质层被切断后，使用钳子删除蜂角质层，然后公开蜜蜂的大脑，更重要的是，在触角叶。立即开始与昆虫盐水，superfusing大脑，使大脑不成为dessicated的。后大脑暴露出来，仔细一对非常细小的镊子以上的触角叶外周神经鞘立即删除。要非常小心，不蜜蜂的大脑穿刺的镊子。

3。气相色谱与多声道录音

1. 蜜蜂"准备" - 管固定在它的大脑暴露 - 现在是准备好电生理记录。将蜜蜂，固定在夹具的磁基地，位于空气表。
2. 安排的输液袋，流量控制器，和油管（充满昆虫盐水），以便，盐水连续superfuses大脑。
3. 使用一台显微操作，insertareference电极，钨丝，到蜜蜂的眼睛。
4. 使用一个单独的微操纵器，如一个螺旋线的四极管，或硅的多通道电极（Neuronexus技术），插入的多通道电极， 到的蜜蜂触角叶。此电极被连接到一个预放大器，如的TDT系统的S-3 Z系列的TDT系统的Z-的总线bioamp处理器。气相色谱输出matogram经由屏蔽BNC电缆的探测器可以是接口与放大器和数据采集系统，使得两个神经和GC的信号是同步的。
5. 等待约30-60分钟，以稳定的神经录音。一旦在记录信道为单位的自发活动和波形形状已成为一致，使用的气味刺激的蜜蜂的注射器，并观察响应的记录信道的气味。
6. 记录神经元的细胞外尖峰通过自动阈值由3.5至5西格玛各个记录通道上的信号的记录信道。手动阈值，可能需要一些渠道，以避免电气噪声污染。从神经元的动作电位，会出现作为在记录通道的电压尖峰。当通道的电压超过阈值时，系统缓冲器并保存阈值交叉之前和之后的几毫秒，从而羚牛GA管理单元拍摄的波形，或尖峰。
7. 立即到空气表旁边是GC。花的提取物注射到GC之前，请务必升温的GC运行，该方法是正确的。在我们的例子中，我们使用一个开始温度的方法，在50℃，4分钟，随后在10℃/分钟的速率由一个增加的温度。至220°C，届时我们举办的GC 6分钟。我们使用DB-5气相色谱柱（J＆W科学，福尔瑟姆，CA，USA），用氦气作为载气。的入口是不分流，与设定为200℃的温度下火焰离子化检测器的温度被设定为230℃。
8. 的提取物样品的花香顶空进样到被加热的注射端口的GC释放到GC柱吸附的挥发物。列的污水分裂1:1之间火焰离子化检测器（FID）和蜜蜂天线使用玻璃"Y"型连接器（J＆W科学）。开始记录奥尔丁从电极注入到GC中的样本。
9. GC运行完成后，让制备5〜15分钟的休息。然后或者另一个样品注入到GC或刺激使用单一挥发性化合物或化合物的混合物的制剂。在这后者的刺激的制备方法，从一个恒定的空气流的空气的脉冲改道通过含有该化合物已经沉积的一片滤纸的玻璃注射器。由一个螺线管激活的阀，由软件控制的装置，脉冲刺激气味。
10. 如果单位活动突然停止或更改，请检查吊盐水，让准备休息了15分钟。如果自发活动不恢复以前的水平，然后准备应被丢弃和另外一只蜜蜂（如果可用）。
11. 实验结束后，用5％福尔马林20分钟的探头还组织修复大脑。其次，消费的大脑并将其放置在2％的戊二醛，4小时，并随后做一个梯度乙醇脱水系列和清除与水杨酸甲酯的脑。基于的组织，其中电极刺破组织应该是清晰可辨的，通过共聚焦显微镜在AL的位置上的固定和结算。

4。数据分析

1. 分析所收集的数据，实验后的分离和识别所记录的神经单位。使用典型的软件程序（离线的分拣，MClust，并SClust）独立波形，或"尖峰"，根据穗的形状，如峰值或谷值振幅，半峰宽等，或减少的措施（主要成分^{）17 ，18（} 图2）。只有那些使用集群的尖峰，在 ​​三维空间中分离（PC1-PC3），在统计学上彼此不同的（多元方差分析，P <0.05）（ 图2），以供进一步分析。请参阅引用＃S 17-19的四极记录和穗排序方法的完整描述。
2. 在每个群集高峰时间戳记，并导出这些数据进行分析，使用MATLAB或Neuroexplorer的（NEX），北卡罗来纳州温斯顿-塞勒姆，创建栅格图和射击频率响应（ 图2，图3A）。
3. 识别使用同时记录GC数据的挥发物的保留时间。使用的挥发物的保留时间，确定从色谱图中的峰的顶点，在这些时间点检查单元响应。
4. 要检查个别单位的反应，通过GC运行，BIN数的峰值在100毫秒的间隔和检查过程中，发射率参考洗脱挥发物的保留时间。在100毫秒的时间间隔的像素合并的尖峰提供足够的细节，或信号，有关的时间过程中神经元的响应于从GC洗脱加臭剂。
5. 要EXA开采的人口不同洗脱挥发物的反应，集成的单个的单元的发射率响应超过3秒的采样窗口，1.5秒前，和1.5秒后，在保留时间为易失性的（ 图3）。此时间段典型的洗脱挥发性从GC的持续时间。我们发射率响应的单位按颜色编码（红色的是射速高，反应，蓝色是一种低响应），并安排他们的活动矩阵，每一行代表合奏GC污水（列）（ 图3）。

在使用M. GCMR分析的lewisii花香的味道，我们3微升提取物注入到GC。挥发物的纯化，通过GC的总数通常为60-70挥发物。香味M. lewisii是主要组成的单萜类化合物，包括β-月桂烯（非周期性）和α-蒎烯，用剩余六碳挥发物，如2 -己醇，倍半萜类化合物，包括<1％的顶空组成的气味。

GCMR利用触角叶神经元的敏感性，以及神经元的处理用的重要的生物的挥发物。然而，这种性质的多声道录音，效果，采取随机抽样的神经元在触角叶。这是因为在不同制剂之间的探头的位置的位置的轻微的变化可能会导致在记录阵列采样不同的神经元。此外，确切位置和Mo因为该记录是细胞外记录神经元的rphologies的是未知的。为了适应这些影响，我们通常运行GCMR实验用8到16个准备，在每个准备用8至18个神经元。然而，为了说明的目的，我们将使用的数据只从一个准备（8个单位）。

从GCMR实验中，我们已经发现，单位是惊人的选择性中的挥发物的反应中，如在图3A中描绘。下面的曲线（黑色）表示的离子色谱图，其中每个峰对应于一个给定的挥发性，到达检测器，随着时间的推移。上部跟踪（蓝色）显示击发率响应的一个单元。单位反应，通过像素合并在一个100毫秒的时间间隔中产生的尖峰的数字计算，并除以该时间内产生的速率。在该示例中，是神经元选择性地响应于D-柠檬烯。需要注意的是，在这个单元中，自发FIRIN克率仍然可以是可变的和随机波动。然而，D-柠檬烯的反应，远高于95％的置信区间，通过时间的发射率响应的方差计算。

然而，并非所有单位从GC挥发物洗脱。事实上，在平均约50％的记录单元在每个合奏无响应（ 图3B）。这是令人惊讶的，在花顶空进样的GC洗脱挥发性化合物的多样性。然而，在合奏的比例不响应单位之间的准备工作，如发现在以往的研究13,14是出奇的一致。

的单个单位的反应之外，GCMR系统还可以分析的人口水平的响应洗脱从GC的气味分子。在这里所示的例子中，有强烈的合奏几个加臭剂的基团选择性（ <s仲>图3B）。最上方的图中显示的色谱图的加臭剂（编号在x-轴）对应于与每个峰。加味剂33和35（D-柠檬烯，和反式-β-罗勒烯，分别）在合奏产生快速响应，为代表的合奏中的每个单元的归一化的燃烧率（彩色刻度）。

图1。顶空吸附和GCMR的系统的概略图，（A）在电路图上，花封入内特氟隆袋，并使用真空泵通过一个易失性的陷阱（PORAPAK Q），从包装袋中的空气被吸入到集中发出的挥发性物质。空气被过滤并返回到封闭的花，（B）的提取物样品的花香顶空注入GC中，从柱的流出物被分成这样，有一半的流量进入GC的火焰电离检测器，并通过一个加热的传输线进行的流出物的另一半，并同时在到达蜜蜂的天线。 AL神经合奏的动作电位持续记录的方法，在20分钟的气味传递通过GC。 点击此处查看大图 。

图2。单位排序记录的多声道录音阵列（MR）在蜜蜂的AL。两个柄隔开，使得该阵列包括一个大体积的AL（A）的波形的特性（ 例如安培 litude，谷）的每个"秒杀"的四极记录可以被绘制在三维空间。在这里所示的例子中，3 4记录通道中每个尖峰的高度是在3-D作图。由于每个单元将具有其自己的尖峰形状，从一个给定单元的尖峰将聚集在一起，从而使单位进行识别和排序条件彼此。排序单位在射击反应表现出明显的差异（B光栅图）和波形（C）定位的四个通道每一个柄上记录的大区域内处理肾小球和神经纤维。神经活动被记录在每一个四通道，在三维空间中绘制的（ 中的A所示），并根据波形特征排序。 点击此处查看大图 。

没有利益冲突的声明。