利用荧光素酶和活体成像系统（IVIS）作为一种新方法，在临床症状出现前识别疾病终点。IVIS使我们能够实时观察脑炎病毒在多天内的侵袭过程，从而为未来研究提供更为精确的疾病模型。该技术还使我们能够比当前常用的动物模型更快地评估抗病毒药物和疫苗的潜在保护作用。通过在多个时间点对同一动物进行连续监测，可减少实验动物使用数量、降低成本，并降低动物的整体发病率，确保疾病研究过程更加人道且更具科学性。
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摘要
摘要
成像技术的现代进步推动了病毒学研究方法的进一步发展与优化。Russell 和 Burch 在 Hume 提出的“3R 原则”（替代、减量、优化）基础上，倡导在科学研究中不断探索减少动物使用的新方法，同时提升研究的科学准确性与效率。然而，遵循 Hume 原则面临的主要挑战之一是如何在减少动物发病率及使用数量的同时，确保研究结果具有统计学效力。目前，疫苗有效性研究通常需要大量实验动物才能达到统计学显著性，且往往以高发病率和高死亡率为终点指标来判断免疫保护效果。我们采用了 体内 利用成像系统（IVIS）结合萤火虫荧光素酶，可在小鼠模型中逐步追踪脑炎病毒对中枢神经系统（CNS）的侵袭过程。该疾病通常进展较慢，但病毒复制迅速，尤其是在中枢神经系统内，常导致致命性后果。通过鼻腔感染表达荧光素酶基因的减毒委内瑞拉马脑炎病毒株TC83-Luc后，我们能够在临床疾病症状出现前至少三天观察到病毒在脑内的复制。以中枢神经系统侵袭作为脑炎性疾病发展的关键终点指标，可在临床症状出现前快速评估药物治疗和疫苗对TC83-Luc感染的保护效果。借助IVIS技术，我们能够实现对药物疗法和疫苗的快速、准确测试，同时减少实验动物使用数量和动物病痛。
方案
1. 动物准备
- 动物接收：动物到达动物生物安全二级（ABSL2）设施后，应至少给予2天时间以适应新环境。此休息期结束后，检查动物的健康状况及整体外观。
- 当使用荧光报告基因时，重要的是将所有实验动物置于无苜蓿饮食中，以减少胃肠道自发荧光和背景信号。
- 剃除动物毛发：为了在成像过程中提高颅部区域检测到的生物发光信号，需剃除所有动物头部的毛发。使用氧气与气化异氟烷混合气体对动物进行麻醉。待动物完全麻醉后，使用电动剪毛器剃除其头部毛发。剃毛完成后，将动物放回笼中，并观察其完全从麻醉效应中恢复。
- 生物医学数据系统（BMDS）应答器植入（在小鼠剃毛后、处于完全麻醉状态下进行）：为实现微创体温监测，将预先编程的BMDS无线应答器皮下植入每只小鼠的背部区域。这些应答器可实现无线识别和体温记录。植入应答器后，对伤口使用兽用级组织粘合剂。
- 基线数据采集：感染前，记录所有动物的基础体温和体重。在小鼠处于麻醉状态时，通过眶后（RO）采血获取血液样本，用于蚀斑减少中和试验（PRNT）分析。采血后，涂抹兽用抗生素眼膏以降低潜在的继发性细菌感染风险。基线数据采集应考虑因对小鼠造成应激而限制麻醉次数。后续的眶后采血应在成像过程中、小鼠仍处于麻醉状态时完成。单次眶后采血量最大应约为200 μl。
- 感染操作：按照前述方法对小鼠实施麻醉。通过鼻内途径接种，使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）将TC83-Luciferase病毒稀释至总体积40 μl，接种剂量为5×106 至 5×107 pfu。感染完成后，将小鼠放回饲养笼中，并观察其恢复情况。
2. 动物成像
免责声明：始终将小鼠置于其饲养单元、生物安全柜（BSC）或XIC密闭箱内。本方案批准使用的生物安全柜为II级B1型或B2型。
- 按每克体重10 μl的剂量，腹腔注射（IP）浓度为15 mg/ml的荧光素酶底物（luciferin）至所有动物。
- 根据分组情况，对接受Ampligen处理的小鼠在感染后-4小时或+48小时，以12.5 mg/kg体重的剂量进行腹腔注射。
- 在注射荧光素酶底物前，将小鼠每三只一组分开，以确保其能合适地放入XIC-3隔离箱中。
- 在所有成像过程中，使用眼部软膏/润滑剂，防止角膜在操作期间干燥。
- 打开LivingImage软件并点击Initialize以准备成像箱；设置自动保存，曝光时间设为自动（曝光时间自动是LivingImage软件3.2及更高版本的新功能），视野设为C，滤光片设为开放状态；视野的选择应基于成像小鼠的数量；滤光片可根据其他成像项目的需要进行优化调整。
- 确认活性炭空气过滤器未过期，氧气瓶已充满，异氟烷储液罐已加满。在XIC-3隔离箱内贴上小条电工胶带，有助于减少成像期间动物的移动。
- 按照第2.1节所述方法对小鼠进行腹腔注射荧光素酶底物，并将其放入异氟烷诱导室（打开盖子）中3-5分钟。
- 5分钟后，关闭诱导室盖子并启动异氟烷气流。麻醉气体浓度维持在约3-5%，氧气流速设定为约2.0 L/min。待小鼠完全失去意识后，再等待30秒，然后将其转移至XIC-3隔离箱。确保所使用的生物安全柜能够安全回收异氟烷，因为此过程会导致异氟烷从诱导室逸出（IVIS设备自带被动式过滤罐，XIC-3隔离箱可直接连接进出气接口，以确保麻醉气体的密闭循环）。
- 根据芯片/组编号将小鼠转移至已连接并打开异氟烷接口的XIC-3隔离箱中。将小鼠以胸卧位平放，头部轻轻置于胶带条上。
- 用乙醇擦拭XIC隔离箱表面，双手和XIC-3底部喷洒Cavicide消毒剂，然后将隔离箱转移至IVIS成像室。进入成像装置后，重新连接麻醉系统至隔离箱。
- 在注射荧光素酶底物后10分钟，通过LivingImage软件对小鼠进行成像。
- 在完成开放滤光片的初步成像后，使用序列分析和Image Wizard设置，启动针对萤火虫荧光素酶的DLIT三维成像。该成像过程需时4-5分钟，应根据所需成像的小鼠数量选择合适的视野。
- 在解剖并取出脑组织后，可进行ex-vivo分析。将脑组织置于无菌培养皿中，在其表面滴加50-100 μl的荧光素酶底物原液，然后放入成像箱中进行成像。
- 在DLIT成像完成后，于感染后15-17分钟获取第二次开放滤光片的成像图像。确保关闭序列分析功能，并将视野和滤光片设置恢复至先前状态。
3. 小鼠归巢与数据分析
- 关闭异氟烷蒸发器，并将 XIC 隔离箱转移回生物安全柜中。
- 将小鼠放回其饲养盒内，盖上盖子，用适当的消毒剂喷洒外部，然后放回饲养架上。
- 确保小鼠已从麻醉状态完全恢复。
- 根据实验需要重复上述操作，直至成像完成。
- 对生物安全柜进行消毒，关闭设备，并将所有数据转移至外部实验室位置以进行进一步分析。
- 分析数据，并利用 LivingImage 软件根据 IVIS 结果生成三维图像。
- 确保图像方向正确，并设置光照/色彩平衡。在工具面板中，选项包括图像调整、校正、图像信息和 ROI 工具。
- 使用 ROI 形状根据位置识别特定信号强度。
- 重建表面拓扑结构以突出小鼠身体，初始化 3D DLIT 重建，并使用线性拟合将器官图谱与拓扑重建对齐。
- 可通过采集血液和器官完成进一步的病毒滴度分析。本研究中的滴定是通过在改良伊格尔培养基（MEM）中匀浆脑组织完成的。匀浆液进行系列稀释后，感染 6 孔板中的 Vero 细胞 1 小时。细胞覆盖 1.5% 琼脂糖/2×MEM 覆盖层，在 37 摄氏度下孵育 2 天。细胞用 10% 甲醛固定 30 分钟，并用结晶紫染色。
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结果
使用基因改造病毒TC83-Luciferase，我们观察到随着病毒复制从鼻腔区域扩散至中枢神经系统，生物发光信号强度逐渐增强（图1）。由于该病毒具有较高的复制速率，我们预期会观察到较强的生物发光信号（图2A），其强度取决于载体本身以及动物对载体的免疫反应。我们预计该信号将持续增强，并在感染后第5至7天达到峰值，这与病毒在中枢神经系统内的复制高峰相一致（图2B）。在信号和病毒复制达到峰值之后，随着病毒复制水平下降以及荧光素酶基因的丢失，生物发光信号将随之减弱。通过这些信号值，我们期望能够根据信号强度定量病毒载量，从而建立一种in vivo的方法，用于准确计算单个动物体内TC83-Luciferase特异性的病毒载量动态增长过程。
利用该模型作为分析疫苗和抗病毒治疗手段的方法，我们预期能够通过生物发光信号的减弱来区分有效的治疗措施。在本研究中，针对TC83-Luciferase，我们可采用腹腔注射Ampligen（一种Toll样受体3激动剂）或在感染前3周进行疫苗接种...
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讨论
尽管本方案涵盖了体内分析的成像方面，但必须认识到生物发光载体是未来研究中的一个关键因素。我们使用TC83（一种减毒的VEEV疫苗株）作为荧光素酶表达的载体，可确保在中枢神经系统（CNS）中因病毒的高复制率而大量产生该酶，如先前研究所述1-4。尽管引入第二个亚基因组启动子和荧光素酶基因导致重组病毒相较于野生型TC83进一步减毒，但这种减毒似乎并未改变感染后前6天内的疾病临床进程5。我们预期随着病毒的持续复制，荧光素酶基因会逐渐丢失，但这种现象同样仅在疾病发展的后期才被观察到。其他致病性载体（包括病毒性和细菌性）的开发进一步证实了IVIS系统与荧光素酶在多种病原体研究领域中的潜力与高效性6-9。
成像过程本身包含若干关键步骤，必须在开展完整研究之前完成。应首先在包含少量动物的预实验中完成对载体生物发光强度的初步分析。预期位置 在体 由于所使用的载体不同，荧光素酶的积累情况应事先了解，但在开展大规模研究之前仍需确定预期的信号强度。由于新软件已内置自动曝光检测功能，因此不再需要进行曝光时间...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
德克萨斯大学医学分部转化科学研究所获得美国国立卫生研究院资助（项目编号：1UL1RR029876-01），以及Alisha Prather在本稿件视频编辑方面提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| D-荧光素 | |||
| 异氟烷 | |||
| Xenogen IVIS 系统（Spectrum） | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8 气体麻醉系统 | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 隔离箱 | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 软件 | Caliper Life Sciences | ||
| 遥测/识别芯片 | 生物医学数据系统公司（Bio Medic Data Systems） | IPTT-300 | 用于动物编号与体温监测 |
| BD Integra 1 ml 结核菌素注射器，配 26 g × 3/8” 针头 | 费舍科学公司（Fisher Scientific） | 305279 | |
| Vet Bond 组织粘合剂 | 费舍科学公司（Fisher Scientific） | NC9259532 | |
| Vetropolycin 眼科软膏 | 韦伯斯特兽医产品公司（Webster Veterinary Products） | 78444656 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（1X） | 英潍捷基公司（Invitrogen） | 14190-144 | |
| BMDS 芯片读取器 | 生物医学数据系统公司（Bio Medic Data Systems） | DAS-7007S | |
| DAS-HOST 软件 | 生物医学数据系统公司（Bio Medic Data Systems） | 用于下载探针信息 |
参考文献
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重印与许可
