Eine einfache Methode zur Ableitung und pflegen Spermatogonien Stamm-und Vorläuferzellen Zelllinien aus erwachsenen Mäusen wird hier vorgestellt. Das Verfahren nutzt Feeder-Zellen, die aus dem somatischen Zellkompartiment der adulten Maus Hoden. Diese Technik ist für die gemeinsame Mausstämmen, auch transgenen Knock-out und Knock-in Mäusen.
Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) der Hoden sind ein klassisches Beispiel für adulten Stammzellen und die Erhaltung der Fruchtbarkeit für fast die gesamte Lebensdauer des Tieres. Während die genauen Mechanismen, die Selbsterneuerung und Differenzierung in vivo zu regeln Studie sind anspruchsvoll, wurden verschiedene Systeme zuvor murinen SSCs in vitro unter Verwendung einer Kombination von speziellen Kulturmedien und Feeder-Zellen 1-3 Propagation entwickelt.
Die meisten in vitro Streifzüge in die Biologie der SSCs haben Zelllinien von Neugeborenen, möglicherweise aufgrund der Schwierigkeiten bei der Beschaffung Erwachsenen Zelllinien 4 abgeleitet. Jedoch weiterhin die Hoden zu reifen bis ~ 5 Wochen alt in den meisten Mausstämmen. In den frühen postnatalen Phase treten dramatischen Veränderungen in der Architektur der Hoden und in der Biologie der sowohl somatische und spermatogenen Zellen, einschließlich Änderungen in Expression von zahlreichen Stammzellen-bezogeneGene. Daher kann abgeleitet SSC neonatal-Linien nicht vollständig rekapitulieren die Biologie von erwachsenen SSCs, die nach der erwachsenen Testis einen stationären Zustand erreicht hat persistieren.
Mehrere Faktoren haben die Produktion von Erwachsenen SSC Linien behindert historisch. Erstens kann der Anteil an funktionellen Stammzellen im Erwachsenenalter verringern, entweder durch intrinsische oder extrinsische Faktoren 5,6. Weiterhin, wie bei anderen adulten Stammzellen, ist es schwierig gewesen, um ausreichend SSCs bereichern aus Gesamt erwachsenen Hodenzellen ohne Verwendung einer Kombination von Immunselektion oder andere Sortier Strategien 7. Üblicherweise eingesetzten Strategien zählen die Verwendung von Mäusen kryptorchiden als Quelle von Donorzellen aufgrund einer höheren Verhältnis von Stammzellen zu anderen Zelltypen 8. Basierend auf der Hypothese, dass die Entfernung von somatischen Zellen aus der Vorkultur Interaktionen mit der Stammzell-Nische, die für SSC Überleben stört, haben wir bisher entwickelten Methoden zur Ableitung von Erwachsenen lines die keine Immunselektion und kryptorchiden Spendern einzusetzen sondern seriellen Anreicherung von SSC in Kultur, nachfolgend als 2,3 SESC.
Das nachfolgend beschriebene Verfahren führt zu einer einfachen Prozedur zum Ableiten erwachsenen SSC Linien durch Dissoziieren erwachsenen Spenders Samenleiter, durch Plattieren von Zellen auf einer Feeder testikulären stromalen Zelllinie (JK1) 3 umfasst gefolgt. Durch serielle Passagierung, stark haftenden, nicht-verunreinigenden Keimzellen aus der Kultur bei gleichzeitiger Anreicherung von SSCs abgereichert. Kulturen auf diese Weise hergestellte enthalten eine Mischung aus Spermatogonien in verschiedenen Stadien der Differenzierung, welche enthalten SSC, über langfristige Selbsterneuerung Fähigkeit auswählt. Der Kern des SESC Methode ist, dass SSCs ermöglicht, den schwierigen Übergang von der Selbst-Erneuerung in vivo-bis langfristigen Selbsterneuerung in vitro in einer radikal anderen Mikroumgebung zu machen, produziert langfristige SSC Linien, frei von verunreinigendensomatischen Zellen und ermöglicht dadurch anschließenden experimentellen Manipulation von SSCs.
Diese Methode zur Ableitung Erwachsenen SSCs mit adulten Hoden-derived Feeder-Zellen ist robust und gelungen, wenn gemeinsame genetische Herkunft (zB FVB, C57Bl6 und gemischte 129SV/C57Bl/6) und verschiedene Mutanten 2,3,7,14 beschäftigt waren. In der Tat ist die Mikroumgebung von der Kultur-System angelegt ausreicht, um einige der genetischen Barrieren zur Aufrechterhaltung erwachsenen SSCs in vivo (zB im Falle von PLZF – / – Tieren) überwunden 7. Während wir JK1 Ze…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der New York State Department of Health (C026878) unterstützt. MS war ein New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Unterstützt in Part von Research Grant No 5-WJ11-571 aus der March of Dimes Foundation.
Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | – | |
Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
Table 2. Dissociation buffer | |||
StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
Additional supplements** | |||
Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
Table 3. Stem cell medium | |||
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. |