血脑屏障破坏的大鼠模型以实现靶向性神经血管治疗

摘要

血脑屏障的破坏有助于某些药物向脑部的递送。通过动脉内给予甘露醇可使血管周围细胞收缩，从而在物理上破坏该屏障。

摘要

内皮细胞通过紧密连接，与基底膜及星形胶质细胞终足共同包绕脑血管，形成血脑屏障¹。该屏障根据分子的大小和电荷选择性地阻止物质在血液与脑组织之间自由通过。这一功能可能阻碍治疗神经系统疾病药物的递送。例如，多种化疗药物无法有效穿过血脑屏障以到达肿瘤细胞²。因此，提高药物穿越血脑屏障的递送效率成为研究关注的领域。

提高药物向脑部递送的最常见方法是直接脑内灌注和血脑屏障破坏³直接脑内灌注可确保治疗药物到达脑部，但该方法在药物扩散方面能力有限⁴血脑屏障破坏（BBBD）可使药物直接从循环系统进入脑组织 进入大脑，从而更有效地作用于分散的肿瘤细胞。屏障开放的三种方法包括渗透性屏障开放、药理性屏障开放以及聚焦超声联合微泡技术。渗透性开放由Neuwelt首创，采用25%高渗甘露醇溶液，使血脑屏障细胞脱水收缩，从而破坏其紧密连接。药理性屏障开放则可通过血管活性化合物（如组胺）实现⁵ 和缓激肽⁶然而，该方法主要对脑肿瘤屏障具有选择性⁷此外，与使用25%甘露醇进行渗透性血脑屏障开放（BBBD）相比，缓激肽类似物RMP-7在直接对比中表现较差。⁸另一种方法是聚焦超声（FUS）联合微泡超声造影剂，该方法也已证明可逆性地开放血脑屏障⁹与FUS相比，25%甘露醇在人类患者中具有更长的安全使用历史，使其成为转化研究中一种经过验证的工具。^10-12.

为了实现血脑屏障破坏（BBBD），必须以高流速将甘露醇直接输送到脑部动脉循环中。在人体中，可通过导管介入技术将导管引导至脑部，从而实现快速、直接的灌注。本方案尽可能模拟了人类的 BBBD 过程。在暴露颈总动脉分叉处后，将导管逆行插入颈外动脉（ECA），并用于将甘露醇直接注入颈内动脉（ICA）的血流中。使用异丙酚和一氧化二氮（N₂O）麻醉，因其能够最大程度地增强血脑屏障的破坏效果¹³。若操作得当，该方法能够安全、有效且可逆地开放血脑屏障，从而改善那些通常无法进入脑组织的药物的递送效率^8,13,14。

方案

1. 准备实验动物和实验设备

1. 手术开始前，准备手术区域和动物。通过将23号钝头针插入一段12英寸PE50导管的一端来制备颈动脉导管。在导管的另一端切出约45°的斜面。在手术前对器械进行灭菌。佩戴手术帽、外科口罩和无菌手套。
2. 在手术操作台表面放置加热垫，启动并预热。用吸水性实验台垫覆盖该区域。
3. 确认25%甘露醇溶液中无结晶。若存在结晶，将药瓶置于80 °C热水浴中并定期振荡，直至结晶溶解。
4. 记录动物的质量。
5. 配制丙泊酚稀释液，以0.1 ml/min的速度输注，使给药剂量为0.8 mg/kg/min。
6. 将大鼠放入诱导箱中3分钟。设置参数：异氟烷浓度5%，呼吸机气体流速2 L/min。
7. 在一次性毛巾上剃除颈部及两侧内侧大腿的毛发。

2. 对大鼠进行插管

1. 将动物放回诱导箱中，持续 3 分钟。
2. 使用静脉留置针准备气管插管。针对此体型和品系的大鼠，我们使用 18 号留置针。插管必须足够大以保证充足的气流，但又需足够小，以便无损伤地插入气管。将针头从塑料套管中抽出，并小心地在距其尖端约 1 cm 处折断针头。钝化的针头将作为引导丝使用。随后将该针头重新插入套管中。
3. 将大鼠的牙齿挂在倾斜的表面上，使其悬垂。
4. 将光源直接照射在动物颈部，并对准两耳之间的位置。
5. 将小型刮匙插入口腔咽部约 3 cm 深处，同时轻柔地向外牵拉舌头，并向上抬起。
6. 观察气管开口。可见一个小孔随每次呼吸开合。
7. 轻柔地将套管插入该开口中。有时可感觉到塑料套管进入气管软骨。气管较为敏感，切勿强行推进套管。
8. 将呼吸机设置为 1 L/min 的气流速度和 60 次/分钟的呼吸频率，并将异氟烷浓度设为 2%。
9. 将套管连接至呼吸机，并用胶带将导管固定在操作台面上。
10. 通过夹捏足趾测试确认动物是否已充分麻醉。

3. 建立丙泊酚静脉麻醉

1. 用胶带将大鼠的四肢和尾巴固定在手术台面上。
2. 用洗必泰皂液对已剃毛的颈部和腹股沟部位进行三次擦洗，随后再用洗必泰冲洗液擦洗三次。
3. 将装有丙泊酚的注射器连接至静脉延长管，再将注射器安装到输液泵上。
4. 使用手术刀切开已剃毛的大腿皮肤，注意避免损伤肌肉组织。
5. 用镊子撑开切口，以暴露股静脉。
6. 分离覆盖在动脉上的组织，充分暴露血管。
7. 将26号Monoject兽用静脉导管插入静脉。当针头刺穿静脉壁时，会感到推进阻力减小；此时回撤针芯，将导管继续推入血管内。
8. 以0.1 ml/min的速率开始丙泊酚输注。
9. 开始丙泊酚输注后3-5分钟，将麻醉气体切换为50% O₂ 和50% N₂O的混合气体，并关闭异氟烷。

4. 暴露颈总动脉分叉

1. 使用手术刀片在颈部正中做一纵向切口。
2. 用剪刀或手术刀在两侧较大的唾液腺之间进行切割。
3. 解剖分离正中线外侧的组织，以暴露颈总动脉。使用镊子逐层分离组织。可用剪刀去除经镊子暴露后确认血管分布较少的组织。必要时用纱布、棉签或电凝止血。
4. 若出现中度至大量出血，可经腹腔注射3 ml生理盐水。
5. 使用牵开器将组织从颈总动脉处牵开，找到分叉部位。
6. 在分叉远端暴露枕动脉。用镊子夹住枕动脉，电凝夹闭后使用电刀将其分离。
7. 用镊子充分暴露颈总动脉分叉处，并尽可能多地暴露颈外动脉（ECA）。
8. 在枕动脉远端暴露自颈外动脉发出的甲状腺上动脉。用镊子夹住该动脉，电凝夹闭后使用电刀将其分离。

5. 插管颈外动脉

1. 在颈外动脉（ECA）下方放置两段4/0丝线。
2. 用止血钳夹住其中一段缝线，将ECA向尾侧（朝向大鼠足部方向）牵拉。
3. 取另一段缝线，在尽可能靠近头侧（朝向大鼠口部方向）的位置打外科结，形成永久性结扎，以阻断ECA血流。
4. 移除第一个止血钳（原先施加尾侧张力的止血钳），改用止血钳夹住另一段缝线（已围绕ECA打结的缝线），并向头侧施加轻柔张力。
5. 在分叉远端、永久结扎线近端处，用另一段缝线 loosely 打一个外科结（不要完全收紧——保持轻微结扎状态）。
6. 用1%利多卡因冲洗，以松弛动脉。
7. 用肝素化生理盐水填充导管。
8. 在尽可能靠近分叉处的位置放置一个临时血管夹，将血管夹倾斜放置以最大化导管插入空间。将松开的结向血管夹方向滑动。
9. 使用显微剪刀在结扎线近端稍前方的ECA上做一个小的动脉切口（切开）。若血管夹和结扎牢固，则不应有出血。
10. 用镊子控制ECA管壁，将导管斜面端插入血管内。
11. 用松开的缝线结固定导管，将动脉在导管周围结扎紧。
12. 移除血管夹，并用棉签清洁操作区域。
13. 将导管向前推进至距分叉处约1 mm的远端位置。用镊子夹住结扎点近端的动脉，确保血管固定不动。

6. 给予甘露醇

1. 用甘露醇填充一条8英寸的静脉延长管和一支6 ml注射器，避免产生任何气泡。将此装置置于37 °C培养箱中保存。注意：操作甘露醇时应迅速，因其在室温下易从溶液中析出。
2. 为观察血脑屏障破坏（BBBD），可给予动物伊文思蓝染料，并观察其进入血脑屏障受损的脑区。为此，通过与丙泊酚输注侧相对的后肢另一侧新建立的静脉通路，给予动物2 ml/kg的2%伊文思蓝。
3. 将延长管连接至一个5 μm滤器，并用甘露醇填充以排除气泡。随后，在不产生气泡的情况下将该装置连接至三通阀。
4. 以0.09 ml/sec的速度输注甘露醇，持续25秒。观察甘露醇是否在颈总动脉靠近颈内动脉（ICA）起始处近端的位置与血流达到平衡。此时甘露醇应随大鼠心率呈现脉动样流动。若甘露醇持续向心脏方向流动，则提示已超过大鼠血压，可能导致危及生命的并发症及血脑屏障破坏效果不佳。

结果

图 1. 通过伊文思蓝染料外渗可视化血脑屏障的破坏。 伊文思蓝染料是一种可与白蛋白结合的色素，在生理条件下不会渗入脑组织。当大脑一侧的血脑屏障受到破坏时，伊文思蓝即可进入并使受损半球染成蓝色，而未受损半球则保持不变，因此该染料可作为血脑屏障破坏的有效标志物。图 1A 为未发生血脑屏障破坏的大脑示例。图 1B 为使用 25% 甘露醇进行渗透性血脑屏障开放（BBBD）后脑组织被染成蓝色的示例。注意其中一个半球被染成蓝色，而另一个半球未被染色。部分蓝色染料因威利斯环处血流混合而进入左侧半球靠近正中纵裂的区域。

讨论

提高BBBD效果的方法有多种。在手术切开阶段，应尽量减少出血。大量出血会影响血压和心率，而这些因素已知会影响BBBD的程度¹³。可通过结扎必须切断的主要血管（如甲状腺上动脉和枕动脉）来减少出血。此外，可使用电凝术切断血管，并分离血供丰富的区域。保持进入动物体内的所有管路（尤其是颈动脉导管）中无空气和固体物质也非常重要。快速操作甘露醇有助于防止其在注射器或管路内形成结晶。

使用甘露醇的流速时，必须根据本实验所用大鼠的体型和品系选择有效的流速。甘露醇输注的流速需与大鼠颈总动脉内的压力相匹配，以确保高浓度甘露醇进入颈内动脉，而不会沿颈总动脉向下流入心脏和肺部，否则可能造成损伤。若研究人员选用与本研究中不同体型或品系的大鼠，应通过实验确定合适的甘露醇流速。

该操作方法的一个局限性在于，它需要牺牲外颈动脉（ECA）。一旦对ECA进行插管，再次插管将变得困难且不可靠。因此，同一脑半球不能重复进行该操作。此外，在血脑屏障开放（BBBD）后给予的化合物必须仔细检测其神经毒性。一些通常情况下安全的药物，一旦穿过血脑屏障...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Long Evans 大鼠	Harlan Laboratories		210–250 g，雄性
PE 50 管	Beckton-Dickinson
18 号 × 2.5" 静脉导管	Terumo		用于气管插管
30" 静脉延长管	Abbott
26 号兽用静脉导管	Monoject
伊文思蓝染料	Sigma	E2129
双极电极	Codman
滤器，5 μm	Braun