Genetisk modifiering och rekombination av saliv kulturer Gland Organ

Summary

En teknik för att genetiskt manipulera epitelceller i hela

Abstract

Förgrening morfogenes sker under utvecklingen av många organ, och den embryonala mus submandibular körtel (SMG) är en klassisk modell för att studera förgrening morfogenes. I utvecklingsländerna SMG innebär denna process iterativa steg epitelial knopp och kanal bildning, för att slutligen ge upphov till ett komplext förgrenad nätverk av acini och kanaler, som tjänar till att producera och modifiera / transportera saliv respektive in i munhålan ^{1 - 3.} Den epitel-associerad basalmembranet och aspekter av den mesenkymala facket, inklusive mesenkymceller, tillväxtfaktorer och extracellulära matrix, som produceras av dessa celler är avgörande för förgrening mekanismen, men hur de cellulära och molekylära händelser samordnas fortfarande dåligt känd ⁴ . Studien av de molekylära mekanismerna driver epiteliala morfogenes förskott vår förståelse av utvecklingsstörningar mekanismer och ger en inblick i eventuella Regenertiva medicin metoder. Sådana studier har hindrats på grund av brist på effektiva metoder för genetisk manipulation av saliv epitel. För närvarande representerar adenoviral transduktion den mest effektiva metoden för inriktning epitelceller hos vuxna körtlar in vivo ^5. Men i embryonala explantat, hindrar tät mesenkym och basalmembranet som omger epitelcellerna virala tillgång till de epiteliala cellerna. Om mesenkym avlägsnas, kan epitelet transfekteras med adenovirus, och epiteliala grunderna kan återuppta förgrening morfogenes i närvaro av Matrigel eller laminin-111 ^6,7. Mesenkym-fri epitelial rudiment tillväxt kräver också ytterligare tillskott med lösliga tillväxtfaktorer och inte helt rekapitulera förgrening morfogenes som förekommer i intakta körtlar ^8. Här beskriver vi en teknik som underlättar adenoviral transduktion av epitelceller och kultur transfekterade epithelium med tillhörande mesenkym. Efter mikrodissektion av de embryonala SMGs, avlägsnande av mesenkym, och viral infektion av epitelet med en GFP-innehållande adenovirus, visar vi att epitelet spontant rekombinerar med oinfekterade mesenkym, återupplever intakt SMG glandulär struktur och förgrening morfogenes. Den genetiskt modifierade epitelial cellpopulation kan lätt övervakas med användning av standardmetoder fluorescensmikroskopi metoder, om fluorescens-märkta adenovirala konstruktioner används. Vävnaden rekombination som beskrivs här är för närvarande den mest effektiva och tillgängliga metod för transfektion av epitelceller med en vildtyp eller mutant vektor inom en komplex 3D vävnad konstruktion som inte kräver generering av transgena djur.

Protocol

Protokollet innehåller fyra stora steg, som visas i figur 1. Alla steg beskrivs i detalj. Adenovirus konstruktion och viral rening bör utföras i förväg om organstölder för användning i den genetiska transduktion av de dissekerade epiteliala grunderna. Alla standard BSL-2 försiktighetsåtgärder bör följas vid arbete med adenovirus.

1. Mus embryonala submandibulär Gland (SMG) Skörd och mikrodissektion

1. Avliva tidsinställda-gravida honmöss (utavlat stam CD-1 eller ICR) med CO ₂ narkos, följt av cervikal dislokation och stråkar skörd av musembryon vid embryonal dag 13 (E13, 3-5 epiteliala knoppar) Följande förfaranden som godkänts av den institutionella IACUC kommitté. Dagen för vaginala plugg upptäckt betecknas E0. Spottkörtlar kan också skördas och odlas i E12 skede när det finns en enda primär knopp och stjälk med klyftor precis börjatatt initiera. SMGs före detta stadium kräver olika odlingsbetingelser än de som anges här.
2. Överför embryo strängar i sterila 10 kultur cm vävnadsodlingsskålar fyllda med 25 ml DMEM / HAM 's F12 medium (F12) som saknar fenolrött (Life Technologies) och kompletterat med 100 U / ml penicillin, och 100 pg / ml streptomycin (pen-strep, Life Technologies).
3. Med en steril skalpell (# 11 blad) och pincett (# 5, Fine Science Tools, 11.252-20), ta bort embryon från säckar till en separat 10 cm skål innehållande 25 ml DMEM/F12 + Pen-Strep.
4. Sever embryot huvuden med en vinklad snitt strax under underkäken.
5. Isolera de nedre mandibler från huvudet under en stereo dissektionsmikroskop med en genomlysningsbas (Nikon SMZ645 eller motsvarande) med ett snitt under den övre käften. Placera vävnaderna ovanpå en extra bit av glas snarare än direkt på glaset komponent mikroskopets bas.
6. Samla de lägre mandibles i 3 ml DMEM/F12 + pen-strep i en steril 35 mm vävnadsodlingsplatta.
7. Placera en underkäke skiva på dissekera mikroskop scenen så att tungan är på botten av skivan, men pekar mot 12:00 klockan.
8. Använda en sida av två korslagda pincett i en scissoring rörelse, ta bort och kassera den undre ^{1/3: e} av underkäken skiva.
9. Vrid skivan 90 ° åt höger (om högerhänt) och med hjälp av en scissoring snitt med pincett, skär den övre delen av underkäken skiva (utan att skära tungan) halvvägs in i segmentet.
10. Skala överflödig vävnad bort och ta bort den för att exponera SMGs under. Det kommer att finnas en på vardera sidan nära basen av tungan.
11. Använda en pincett för att hålla nere vävnaden i tungan, använda de andra pincett för att retas SMG ifrån tungan. Upprepa för den andra körtel.
12. Samla microdissected spottkörtlar i 3 ml DMEM/F12 + pen-strep till en ny steril 35 mm vävnadkultur maträtt. Obs: de större submandibulära körtlar (3-5 epiteliala knoppar) tillsammans med den anslutna mindre sublinguala körtel (1 BUD) kan odlas intakt genom att hoppa till steg 4 och utför stegen 4,1, 4,3, och 4,4, som beskrivits tidigare ^2,8.

2. SMG Epithelial rudiment Separation

1. Placera 5 (eller mer) spottkörtlar i ett glas-botten, 50 mm i diameter mikrobrunn skålen (Mattek Corporation, P50G-1.5-14-F) innehållande 200 | il av Hanks balanserade saltlösning (HBSS saknar Ca ^{+ +} eller Mg ^{+ +,} Life Technologies) innehållande 0,4% (volym / volym) dispas (Life Technologies, kat. nr. 17.105-041) och inkubera under 15 minuter vid 37 ° C.
2. Efter inkubationen med en steril 200 pl pipettspets, försiktigt aspirera ut dispas lösningen utan att störa körtlar. Omedelbart tillsätt 200 pl DMEM/F12 medium innehållande 5% (vikt / volym) BSA (DMEM/F12-BSA, försteriliserade med en 0,22 pm filter) för att neutralisera dispas.
<li> under ett dissektionsmikroskop med hjälp av ett pincett med fina spetsar (# 5 Dumostar, Fine Science Tools, 11.295-20), försiktigt separera lossade mesenkym från runt SMG epiteliala knoppar och kanaler, var noga med att lämna epitelet intakt .
3. Pre-wet en steril 200 ul pipettspets med DMEM/F12-BSA medier och försiktigt pipettera ut epiteliala grunderna till en ny 50 mm diameter mikrobrunnar skål innehållande 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep. Använd en hög kvalitet 200 ^ pipettspets med en mjuk kant.
4. I skålen som innehåller mesenkymet bitar, kasta en icke-mesenkymvävnad inklusive sublinguala körtlar och eventuella fristående submandibulära knoppar körtel.

3. Adenoviral infektion av epitel Elementära kunskaper

1. Gör 200 pl av virusinfektion media genom utspädning av adenovirus av intresse i DMEM/F12 + pen-strep i ​​ett mikrocentrifugrör, så att titern av den erhållna lösningen är 1x10 ⁸ -10 ⁹ PFU. Denoptimala titer som krävs för olika virus kan variera. Det är viktigt att använda cesiumklorid (CsCl)-renade virala preparat för optimal upptagning effektivitet.
2. Ta bort materialet från skålen innehåller fem epiteliala grunderna. Snabbt lägga 200 pl av infektionen mediet, håller grunderna våt vid alla tidpunkter. Vidta nödvändiga försiktighetsåtgärder vid hantering av viruset och bortskaffande av förorenade pipettspetsar. Desinficera alla virus kontaminerade ytor med 10% blekmedel.
3. Flytta epiteliala grunderna långt bort från varandra med pincett för att hindra dem från att fastna ihop och tillåta dem att sedimentera till botten av plattan. Inkubera rudiment i virala medium under 1 timme vid rumstemperatur. Under inkubationen separera grunderna, om de rör sig nära varandra. Överdriven gungande eller rörelser gör det möjligt för körtlar att klumpa ihop.
4. Efter inkubation försiktigt bort virus-innehållande media och kassera på lämpligt sätt, se till att inte störa rudiments. Tillsätt 200 pl DMEM/F12 + pen-strep. Upprepa detta tvätt minst två gånger och ersätt med 200 pl DMEM/F12 + Pen-Strep media. Dessa tvättar är kritiska för att avlägsna eventuella virus som inte är starkt kopplad till epitelet och förhindra infektion av mesenkymet.
5. Inkubera epiteliala grunderna med 200 ml DMEM/F12 innehållande 2% (volym / volym) Matrigel (BD Biosciences, 356.231) under 20 min. Vi finner att denna korta inkubation i Matrigel minimerar regression av befintliga klyftor under den inledande kultur period, men detta steg kan undvaras om exponering för Matrigel inte är önskvärd.

4. Ex vivo Kultur av rekombinerade SMGs

1. Placera varje rudiment, en i taget, med användning av en pre-våt 200 pl pipettspets, ovanpå en skårad (litet snitt) 13 mm, 0,1 | im Nuclepore Spår-Etch membranfilter (Whatman) flytande över 200 pl odlingsmedium ( 5 grunderna / filter) i en glasbottnad mikrobrunnsplattan. Odlingsmedietär: DMEM/F12 + pen-strep innehållande 50 ug / ml transferrin och 150 pg / ml askorbinsyra, såsom tidigare beskrivits ^2,8. Transferrin är känt för att stimulera överlevnad och förgrening morfogenes av spottkörtlarna och andra explantat organ ^9. Tillsats av askorbinsyra har visat sig stimulera SMG förgrening. Det är känt att verka som en kofaktor i många hydroxylering reaktioner av metaboliska vägar (såsom prolin hydroxylering vid kollagen fiberbildning ¹¹⁾ och stimulerar även fibronektin och laminin produktionen i andra organ explantat ^{10 12.}
2. Ta bort så mycket media på toppen av filtret som möjligt efter att lägga varje epitelial rudiment. För mycket material ovanpå filtret kan orsaka att filtret sjunka, medan mindre material gör placering av grunderna och mesenkym mycket lättare. Överskott medier kan tas bort antingen med en pipettspets eller genom att använda pincett för att gripa medierna mellan spetsarna.
3. Placera mesenkymceller bitar härleds tillbakam 03:57 körtlar på toppen och / eller runt varje epitelial rudiment. Ta bort eventuella extra material som omger körtlar för att undvika förflyttning av mesenkym från grunderna. Mesenkym härrör från flera körtlar är inte bra, men mindre kan vara skadligt för epitelial rudiment tillväxt.
4. Inkubera rekombinerade SMGs i en fuktad inkubator (95% luft / 5% CO ₂₎ vid 37 ° C under 48 -72 timmar, om så önskas.
5. Förvärva ljusfält och / eller fluorescerande bilder av levande körtlar vid 0 tim (om så önskas), 2 tim efter rekombination och varje 24 tim därefter en inverterad, upprätt, eller stereo ljusmikroskop utrustad med en digitalkamera med en 4X eller 5X förstoring mål att fånga hela rekombinerade körtel i en enda ram av vyn. Bilder av spottkörteln visar den bästa kontrasten med antingen brightfield inställningen eller lämplig fas ringen placeras en bit in i ljuset vägen (vilket inte är möjligt på helautomatiska mikroskop). Standard faskontrast intet nödvändigt eftersom körteln är tjock och skapar kontrast.
6. Vid önskade tidpunkter, kan rekombinerade SMGs fastställas för 20 minuter med fixeringslösning gjorda av 2% paraformaldehyd (PFA) i 1 x PBS innehållande 5% (vikt / volym) sackaros (för att bättre bevara inre cellstruktur genom att hålla cellerna i en isosmotisk tillstånd). Till skillnad 4% PFA, 2% PFA kommer att behålla en betydande mängd av GFP-signal om fixativet avlägsnas fullständigt efter fixering. Körtlar kan lagras i upp till 1 vecka i 1X PBS i mörker vid 4 ° C tills hela fäste immunocytokemi och konfokal avbildning sker, som tidigare rapporterats ^3,6,13-15. Helst ska immunocytokemi och avbildning utföras strax efter fixering att uppnå bästa bildkvalitet. Körtlar kan också lyseras i RIPA-buffert för SDS-PAGE följt av Western blotting-analys.

Representative Results

Flödet av de stora experimentella steg skisseras i Figur 1. Ett exempel på en intakt SMG, en isolerad epitelial rudiment, och dess motsvarande mesenkym visas i figur 2. Brightfield bilder av rekombinerade SMGs, som fortsätter att genomgå förgrening morfogenes när odlade ex vivo under de angivna tiderna, visas i figur 3. Rekombinerade körtlar odlas för 48 timmar uttrycker epitelial GFP visas i figur 4. Konfokala bilder av rekombinerade SMGs fasta och avbildas efter 72 h i odling, följt av immunocytokemi, visas i figur 5. Den epitelial markör, E-cadherin, avgränsar GFP-uttryckande epitelceller befolkning från den omgivande mesenkym. Detektion av basalmembranet proteinet, perlecan, lokaliserad vid periferin av epitelet visar åtminstone delvis rekonstituering av basalmembranet i rekombinerade körtlar. Figure 6. Parasympatiska submandibulär ganglier genomgår neuritutväxt och innerverar körtlar i rekombination kulturer som visas ovan. ¹⁹

Figur 1. (A) Flödesschema och (B) Schematisk visar de viktigaste experimentella steg.

Figur 2. Brightfield bilder av (A) en hel embryonal dag 13 (E13) spottkörteln visar den sublinguala körtel epitel (SL Epi) och den submandibulära körteln epitel (SMG Epi) omgiven av mesenkym (mes). (B) isolerad epitelial rudiment, och (C) Separerad mesenkym. Skala barer = 100 um.

i-page = "alltid">
Figur 3. Brightfield bilder av epiteliala grunderna (beskrivs av vita streckade linjer) omgivna av mesenkymceller bitar odlas i ex vivo-odling under de angivna tiderna. Epitelceller genomgår förgrening morfogenes och mesenkymala kondens är uppenbart så tidigt som 24 timmar i kultur. Skala barer = 100 fim

Figur 4. Brightfield (A), fluorescerande (B) och överlagrade (C) bilder av rekombinerade SMGs där endast epitelcellerna (beskrivs i vita streckade linjer) infekterades med GFP-uttryckande adenovirus och odlade ex vivo under 48 timmar. Skala barer = 100 um.

highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50060/50060fig5.jpg "/>
Figur 5. Konfokala bilder eller brightfield bilder (BF) för rekombinerade SMGs märkta med (A) kärnor (DAPI, blå), adenovirus GFP (grönt), den epiteliala markör. E-cadherin (röd), skala barer = 250 nm, eller, (B) kärnor (DAPI, blå), adenovirus GFP (grönt), den epiteliala markören E-cadherin (röd) och basalmembranet markör, perlecan ( cyan), skala barer = 50 um. Streckad vita linjer kontur epitel. Klicka här för att se större bild .

Figur 6. Parasympatisk submandibulär ganglier genomgår neuritutväxt och innerverar körtlar i rekombination kulturer, skala barer = 250 nm.

Discussion

Ex vivo epitel-mesenkymala rekombinationsteknik publicerades först på submandibulära spottkörtlar 1981 ^16. I detta protokoll utöka vi på den ursprungliga metoden, med hjälp av adenoviral infektion för att manipulera epitelial uttryck cell genen inom ramen för en rekombinerad körtel. Vi visar att en andel av de epiteliala cellerna infekteras med adenovirus, medan procentandelen av celler som är infekterade beror på egenskaperna hos den virala promotorn, viral titer, och viral renhet. Vi har funnit att det är nödvändigt att använda CsCl gradient-renade virus för effektiv transduktion epitelial, rening av som inte beskrivs här. Eftersom vi har också kunnat infektera mesenkymceller före rekombination (data ej visade), är oberoende genetisk manipulation av den mesenkymala befolkningen också möjligt. Vi använde nyligen denna adenovirala transfektion / vävnad rekombination metod för att identifiera en rollför polariteten proteinet, PAR-1b, i kontrollen av placeringen av basalmembranet genom epitelet för att utveckla spottkörtlar. Kinas-död PAR-1b adenovirus och vild-typ PAR-1b adenovirus var båda användes i denna studie ¹³ för att infektera epitelceller grunderna och rekombineras med E13 mesenchymes. Möjligheten att använda mutanta virus att förhöra funktioner specifika molekyler ökar i hög grad användbarheten av denna metod.

Det finns för närvarande en brist på effektiva verktyg för att rikta specifika molekyler inom epitelceller befolkningen i intakta embryonala spottkörtlarna utan att påverka mesenkymala facket. Även om flera studier har använt farmakologiska hämmare för att manipulera signaltransduktion i intakta organ kulturer, dessa inhibitorer påverkar både epitel och mesenkym. Att direkt utvärdera effekterna av inhibitorer på epitelet, måste epiteliala grunderna odlas i frånvaro av mesenkym i antingen Matrigel Or laminin-111 geler ^6,7. Små inhiberande RNA (siRNA) är en effektiv metod för att nedreglera epitelial genuttryck eftersom siRNA är företrädesvis tas upp av epitelcellerna i närvaro av de flesta lipidbärare ^13,14,17,18. Emellertid, ingen av dessa metoder för att störa protein nivåer eller funktion tillåter överexpression av en vild-typ eller mutant gen. Försök till traditionella (icke-virala) transfektion av embryonala hela SMG kulturer har haft begränsad framgång i att endast ett litet antal epitelceller kan riktas kan (ML, opublicerade data). I jämförelse, representerar adenoviral transduktion en effektiv metod för att specifikt transfektera saliv epitelceller.

Parasympatiska nerver har nyligen visat sig vara kritisk för normal spottkörtel förgrening genom att upprätthålla en keratin 5-populationen progenitorceller ^19. En fördel med denna vävnad rekombination metod över meddeenchyme-fri epitelial rudiment odlingsmetod är att den parasympatiska ganglion kan upprätthållas i rekombination odlingssystemet. Genom att hålla noggrann koll på den ungefärliga placeringen av parasympatiska ganglion, som ligger i mesenkymet intill den primära epitel kanalen ^19, är det möjligt att säkerställa att varje rudiment hamnar är förknippad med ett ganglion. Men finner vi att genom att kombinera 3-4 körtlar värde av mesenchymes med varje epitelial rudiment är varje rudiment associerad med en ganglion är tillräcklig för att innerverar knopparna till viss del (Figur 6), men inte alltid till samma som i den intakta omodifierade körtlar.

Det finns alternativa metoder för att infektera epitelet i samband med den intakta körteln. Vi rapporterade tidigare att mikroinjektion kan användas för att införa adenovirus in epitelceller i intakta körtlar ^20,21. Emellertid är mikroinjektion svårt att CONTRol, kan fysiskt skada körtlar, och leder typiskt till infektion av endast en lokal underuppsättning av celler ^20. Adeno-associerade virus (AAV) har visat sig vara användbara för transfektion av distinkta cellpopulationer inom ramen för intakta SMG organ explantat ^22. Serotyp scAAV2 visade sig vara väsentligt mer effektiv vid specifik transduktion av epitelet av intakta SMGs över andra rekombinanta AAV-vektorer ^23. Eftersom AAVs är inte allmänt kommersiellt tillgängliga, inte heller kompetens att förbereda AAV finns i de flesta laboratorier, förutsatt att adenovirala transduktion och vävnad rekombination protokoll här är mer allmänt tillgänglig för de flesta laboratorier än att använda AAV vektorer.

Medan denna vävnad rekombination metod rekapitulerar epitel-mesenkymala interaktioner i viss mån, är det också möjligt att infektera epitelet med adenovirus och sedan växa epitelet utanför dess naturliga sammanhang.Som tidigare nämnts, infekterade vi intakta saliv epiteliala grunderna med adenovirus och växte kulturer i Matrigel med exogent tillsatta tillväxtfaktorer ^17,20,21. Spottkörtel organ explantat kan också odlas på nanofiber ställningar, även om dessa ställningar inte rekapitulera hela funktion mesenkym i sin nuvarande form ^15. Även ingen av dessa metoder rekapitulerar den inhemska mesenkymceller, sådana metoder medger imitation av specifika egenskaper hos mesenkym i ex vivo kultur.

Varje ex vivo kultur metod har sina fördelar och nackdelar, men är tillämpbar för att ta itu specifika vetenskapliga frågor. Medan de rekombinerade körtlar inte genomgår lika mycket förgrening morfogenes som gör intakta saliv explantat körtel orgel, orgel explantat i allmänhet endast rekapitulera in vivo förgrening morfogenes för ett par dagar. En lösning på detta problem är naturligtvis att skapaåt transgena djur som innehåller riktad genuttryck i epiteliala facket. Eftersom det finns en brist på kända promotorer som aktiveras specifikt i början utveckla SMG epitel och transgen teknik fortfarande betydligt dyrare än de beskrivna metoderna, de vävnader rekombinationsexperiment beskrivs här utgör en genomförbar modell för att studera både epitel och mesenkymala celler signalering i tidigt utveckla spottkörtel celler i deras vävnad sammanhang.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red	Life Technologies	21041-025
Penicillin and Streptomycin	Life Technologies	15070-163	10X stock
Dispase	Life Technologies	17105-041	Freeze single use aliquots at -20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraction V, low endotoxin
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay.
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v)
1X Phosphate-buffered saline (PBS)	Life Technologies	70011-044	Prepared from 10X stock
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red
Transferrin	Sigma	T8158	25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	Sigma	A4403	75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C
Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol.
10 cm sterile plastic dishes	Corning	430167	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo dissecting microscope with transmitted light base	Nikon	SMZ645	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
35 mm tissue culture dishes	Falcon	353001	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm diameter microwell dishes	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch membrane filters	Whatman	110405	13 mm diameter, 0.1 mm pore size
Widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR	Charles River Labs		Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0).
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm	Fine Science Tools	11252-20	Ideal for harvesting glands from embryos
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm	Fine Science Tools	11295-20	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol.