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方法文章

利用反相蛋白微阵列（RPPA）技术探究个体肾细胞癌内蛋白质表达差异

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DOI：

10.3791/50221

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2013年1月22日

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1Edinburgh Urological Cancer Group, University of Edinburgh, 2School of Medicine, University of St Andrews, 3Division of Pathology, University of Edinburgh, 4MRC Human Genetics Unit, MRC IGMM, University of Edinburgh, 5Department of Pathology, Western General Hospital, 6Breakthrough Breast Cancer Research Unit, University of Edinburgh, 7St Bartholomew's Cancer Institute, Experimental Cancer Medicine Centre, Queen Mary University of London

本文内容

摘要

反向蛋白相位阵列（RPPA）能够利用荧光标记的抗体，同时检测印迹在硝酸纤维素载玻片上的数百个样品的蛋白质表达水平。该技术已被应用于研究透明细胞肾癌中药物治疗反应的异质性。

摘要

目前，转移性透明细胞肾细胞癌尚无治愈性治疗方法，该类型是此疾病的最常见亚型。治疗耐药的一个关键因素被认为是疾病的分子复杂性1。靶向治疗药物如酪氨酸激酶抑制剂（TKI）舒尼替尼已被应用，但仅有40%的患者产生应答，且其中绝大多数患者在1年内复发2。因此，肾细胞癌患者中内在性与获得性耐药的问题具有重要意义3。

为了研究对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的耐药性，并最终开发出有效且个性化的治疗方案，需要在靶向治疗经过特定时间段后获取连续的组织样本，这一策略在慢性髓性白血病中已被证明是成功的4。然而，该策略在肾细胞癌中的应用受到肿瘤间和瘤内高度异质性的限制，这种异质性是肾细胞癌5,6以及其他实体瘤7的特征。即使在临床表现、肿瘤分期和分级相似的患者中，由于转录组和遗传差异所导致的肿瘤间异质性也已得到充分证实。此外，肾细胞癌（RCC）中存在显著的形态学（瘤内）异质性，这很可能反映了更为复杂的分子异质性。通过对肾细胞癌肿瘤进行形态学分析与Fuhrman分级相结合的详细绘图与分类，可筛选出具有代表性的区域用于蛋白质组学分析。

基于蛋白质的肾细胞癌（RCC）分析因其在病理学实验室中广泛可用而具有吸引力；然而，由于特异性抗体的供应有限，其应用可能面临问题8。由于反相蛋白质阵列（RPPA）具有点印迹的特点，抗体的特异性必须预先验证，因此所用抗体的严格质量控制至关重要9。尽管存在这一限制，点印迹格式仍可实现检测的小型化，从而能够在单张硝酸纤维素载玻片上打印数百个样本。打印后的载玻片可类似于Western印迹分析进行检测，使用靶标特异性的初级抗体和荧光标记的次级抗体，实现多重检测。通过比较荧光信号的相对强度，可同时分析载玻片上所有样本中蛋白质表达的差异，具有更高的成本效益和高通量优势。

方案

1. 形态学和分子肿瘤异质性的鉴定

  1. 从 -80 °C 冰箱中取出肿瘤组织，并置于干冰上保存。
  2. 将肿瘤组织分割成约 1 cm3 的小块。记录每块肿瘤组织之间的原始相对位置，并用唯一名称进行标记。将样本分别储存于 -80 °C 冻存管中，直至使用。
  3. 用 OCT 包埋样本，并在 -22 °C 下用冷冻切片机进行切片。
  4. 采用苏木精和伊红（Hematoxylin and Eosin）复染法对样本进行染色。
  5. 对冷冻切片进行显微镜分析，以确认其为 ccRCC 组织性质、具有活性的肿瘤组织，并进行分级（低级别、高级别或混合型低/高级别；在冷冻切片上区分 Fuhrman 1 至 4 级较为困难）。图 1 a&b （高级别、低级别及混合级别 H&E 染色结果）。
  6. 从每个肿瘤内形态学不同的区域中最多选取 4 个样本用于蛋白质提取。

2. 从肿瘤样本中提取蛋白质

  1. 从OCT中切取肿瘤样本。
  2. 将50–75 mg组织放入含有990 μl裂解缓冲液［50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM EGTA（pH 8.5）、150 mM NaCl］的2 ml离心管中，并加入抑蛋白酶肽（Sigma A6279）（10 mg/ml）、磷酸酶抑制剂混合液2（Sigma, P5716）、磷酸酶抑制剂混合液3（Sigma, P0044）以及蛋白酶抑制剂混合液（Roche, 11836153001）。
  3. 向每根离心管中加入一个5 mm钢珠，使用TissueLyser在50 Hz条件下匀浆5分钟，重复两次，每次间隔检查匀浆程度。
  4. 用移液器将匀浆后的样品转移至新的2 ml离心管中，留下钢珠。
  5. 在每份样品中加入10 μl Triton X-100，然后在4 °C下以13,000 × g离心30分钟。
  6. 将上清液转移至新的微量离心管中。
  7. 使用BCA法测定蛋白浓度（图2）。
  8. 将蛋白浓度调整至1 mg/ml。

3. 抗体验证

  1. 准备蛋白样品（从合适的细胞系或组织中提取），进行 Western 印迹分析，并在 10% SDS-PAGE 凝胶上电泳。
  2. 在 4 °C 条件下，将样品过夜转至硝酸纤维素膜上。
  3. 使用 Li-Cor Odyssey 封闭缓冲液（以 PBS 按 50:50 比例稀释）在室温下封闭膜 1 小时。
  4. 按照生产商推荐的稀释比例（通常为 1:1,000），用 Li-Cor Odyssey 封闭缓冲液（以 PBS 按 50:50 比例稀释）稀释一抗。
  5. 在 4 °C 条件下，将膜与一抗孵育过夜。
  6. 配制 0.1% PBS-Tween20（PBS-T；1 ml Tween20 / 1 L PBS）。
  7. 在室温下用 PBS-T 洗涤膜 5 分钟（重复 3 次）。
  8. 用 Odyssey 封闭缓冲液（以 PBS 按 50:50 比例稀释）含 0.01% SDS，按 1:10,000 稀释比例（1.5 μl/15 ml）稀释荧光标记的二抗。
  9. 在室温下，将膜与二抗孵育 45 分钟，并轻轻振荡；在最终扫描前，必须始终避免光照膜。
  10. 在室温下用 PBS-T 洗涤膜 5 分钟（重复 3 次），并保持膜处于避光环境中。
  11. 在室温下用 PBS 洗涤膜 5 分钟（重复 3 次），以去除残留的 Tween20，过程中仍需保持避光。
  12. 将膜平放在一张滤纸上，避光自然晾干；干燥膜可能增强信号并降低背景，但会使膜无法用于 stripping 和重新探查。
  13. 使用 LiCor Odyssey 扫描仪扫描膜。在扫描完成前，始终保持膜处于避光状态。
  14. 仅选择在正确分子量处产生单一主条带的抗体。图 3 展示了适用于 RPPA 的合格与不合格抗体示例。

4. RPPA 点样

  1. 使用 MicroGrid II 机器人点样仪将蛋白质裂解液点样到硝酸纤维素包被的玻片（Fastslides-Whatman）上。所用玻片包含两个点样区域，每个区域点样相同的样本，本实验中为100个样本。其他可选规格包括1、8和16个点样区域的玻片。点样区域数量越多，每个区域可点样的样本数量就越少。
  2. 对每个样本进行连续五次两倍稀释，每个稀释样本再以三复孔形式点样（每个样本共产生15个点样点）。

5. RPPA 蛋白质检测

  1. 用过量的LiCor封闭缓冲液（按50:50比例用PBS稀释）润湿载玻片，在室温下于摇床上孵育1小时。
  2. 按所需浓度，将800 μl一抗加入LiCor封闭缓冲液（按50:50比例用PBS稀释）中配制，并置于冰上保存。
  3. 将载玻片安装至（i）单孔芯片夹或（ii）四孔“FastFrame”载玻片支架中，确保载玻片与孵育室之间形成紧密密封。
  4. 吸除各孔中残留缓冲液，向相应孔中加入600 μl一抗溶液。
  5. 将载玻片与孵育室放入密封湿盒中，于4 °C在摇床上过夜孵育。
  6. 配制0.1% PBS-Tween20（PBS-T；100 μl Tween 20 加入100 ml PBS中）。
  7. 从冷藏室取出载玻片，小心吸除各孔中的一抗溶液。
  8. 加入600 μl PBS-T，在室温下于摇床上洗涤5分钟，重复3次（×3）。
  9. 将荧光标记的二抗用Odyssey封闭缓冲液（按50:50比例用PBS稀释）含0.01% SDS的溶液稀释至1:2,000（首次使用建议为1 μl/2 ml）进行配制。
  10. 吸除孔中缓冲液，向各孔加入600 μl荧光标记的二抗溶液。室温下避光轻柔振荡孵育45分钟；在最终扫描前，必须始终保护膜免受光照。
  11. 吸除孔中二抗溶液，于室温下用600 μl PBS-T短暂洗涤3次（×3）。将载玻片从支架上取下，转移至合适的容器中，用过量PBS-T避光洗涤15分钟。
  12. 吸除PBS-T，再用PBS在室温下洗涤膜15分钟，以去除残留的Tween-20，过程中仍需保持膜避光。
  13. 将Fastslide置于50 °C烘箱中干燥10分钟，然后在Li-Cor Odyssey扫描仪上进行扫描。在扫描完成前，始终保持载玻片避光。
  14. 根据所使用的二抗，选择在680 nm和/或800 nm波长下扫描载玻片。进行双色检测时，应始终使用高度交叉吸附的二抗以最小化交叉反应。双色检测需谨慎选择一抗和二抗，其中最关键的是两种一抗应来自不同宿主物种（e.g. 兔和小鼠），以便通过抗兔和抗小鼠的二抗进行区分，这些二抗应标记具有明显不同发射光谱的荧光染料。
  15. 图像文件以.tiff格式保存。图4（扫描文件图像）。

6. 数据分析

  1. 启动 MicroVigene 软件（VigeneTech，Carlisle，MA，USA）。
  2. 打开包含 RPPA 芯片扫描图像的 .tiff 图像文件。
  3. 选择一个预定义的模板文件，该文件将包含一个可叠加在 RPPA 芯片图像上的网格。
  4. 点击 定义感兴趣区域（ROI）按钮，以调出网格。
  5. 将网格定位在 RPPA 点样区域上。图6a（网格覆盖图像示例）。
  6. 点击 全选 按钮以高亮所有 ROI。
  7. 点击 查找全部。MicroVigene 将自动识别 ROI，定位点样斑点，扣除背景，去除灰尘颗粒，并对斑点进行定量分析。
  8. 点击 查看稀释曲线 按钮，以显示 RPPA 芯片上所有样本的分析结果。
  9. 点击 保存稀释数据。
  10. 由于每个样本以三份重复形式在 5 个不同稀释梯度上打印，共产生 15 个数据点用于分析，从而降低了误差风险并提高了曲线拟合质量。MicroVigene 采用四参数 logistic-log 模型“超级曲线”算法（图6b），整合所有斑点数据生成反映抗原-抗体结合动力学的 S 形曲线。该方法假设每个样本点上均发生相同的抗体-抗原结合动力学，即使在不同样本之间亦如此；因此，利用芯片上所有斑点拟合一条共用响应曲线，可提高曲线拟合的可信度10,11
    Y = a + ((b - a) / (1 + e^(c * d - ln(x))))
    其中 x 为稀释倍数，Y 为信号强度。
    可通过 y0 值对样本进行比较分析，在本研究中，y0 表示将 x 值映射到超级曲线上后，其中间点对应的 y 值。
  11. 将数据导出至 Microsoft Excel，并以 y0 值作图，如 图7 所示。
  12. 在方差分析（ANOVA）框架下，分别计算未治疗患者与治疗后患者的瘤内蛋白变异度。通过 Mann-Whitney 检验（MWT）比较整合所有分析蛋白数据后的变异分布。对于单个蛋白的瘤内变异度，在满足正态性和方差齐性假设的前提下（分别通过 Lilliefors 检验和 Fligner 检验评估），采用 F 检验进行比较；同时应用错误发现率（FDR）校正12。针对每个蛋白，检验未治疗组与治疗组样本间的差异表达时，若满足正态性和方差齐性假设，则使用学生 t 检验，否则执行 MWT；FDR 校正应用于合并的 t 检验与 MWT 结果12。蛋白表达水平及其变异度的 Pearson 相关性显著性采用标准方法估算 [R reference]，并进行 FDR 校正12。

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结果

在图4(i)中可以看到一张扫描后的RPPA芯片示例，其中同时显示了680 nm和800 nm两个通道。按波长分离图像后，图4(ii)可实现对RPPA芯片上每个点样区域的分析，并确定各个蛋白质的表达水平（图4(iii)）。如图4(iii)所示，不同样本中各蛋白质的表达模式具有特异性：Gelsolin在整个芯片上的表达水平较高，而cMYC的蛋白表达水平则明显较低，但仍可在所有检测样本中普遍检测到。相比之下，CD10表现出可变的表达模式，某些样本中表达水平较高，而其他样本中则几乎无法检测到表达信号。最后，pJAK2未能产生任何高于背景水平的可检测蛋白表达信号。从质量控制的角度来看，pJAK2的结果不可接受，而CD10的结果则可接受，因其在芯片上多个样本中检测到了明确的蛋白表达信号。图5展示了不同物种的一抗与二抗之间无交叉反应性的结果。用于计算单张RPPA芯片上各样本信号强度的Supercurve拟合曲线示例如图6所示。这些曲线用于生成基于相对...

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讨论

本文介绍的反相蛋白微阵列（RPPA）方法是一种高通量的蛋白质分析技术，可作为广泛使用但通量相对较低的蛋白质印迹（Western blot）技术的替代方案。该方法能够对数百个样本进行半定量分析，并实现同时比较，从而直接评估多种细胞系和组织样本中关键蛋白质的表达差异。通过使用不同物种来源的抗体进行多重检测，可进一步提升该技术的检测能力，实现多种抗体的同时应用。本文展示的实例突出了RPPA在肿瘤异质性研究以及靶向治疗对异质性影响分析中的应用价值。

作为一种技术，反相蛋白微阵列（RPPA）包含多个关键步骤，其中抗体的选择至关重要。由于该技术具有点印迹（dot blot）的特性，在分析过程中无法确认抗体的特异性，因此必须在使用前完成验证。在本研究中，共对83种抗体进行了Western印迹验证，其中仅有58种通过验证（失败率约为30%）。在这58种抗体中，有55种在RPPA分析中获得了可接受的结果（成功率为95%）。其他关键步骤还包括选择用于在RPPA芯片上点样样本的蛋白浓度以及点样均匀性。较高的蛋白浓度可提高检测灵敏度，但可能因蛋白量不足而减少可点样的样本数量。能够提供足够蛋白用于RPPA点...

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致谢

上述作者 FCO、DF、JN、DJH 和 GDS 的工作由首席科学家办公室资助，资助编号：ETM37，并得到英国癌症研究会实验癌症医学中心的支持。AL 的工作由爱丁堡皇家外科医学院罗伯逊信托基金、癌症护理与治愈梅尔维尔信托基金以及英国医学研究理事会资助。IO 获得由玛丽·居里行动计划和英国医学研究理事会共同资助的爱丁堡皇家学会苏格兰政府研究员项目的支持。作者谨此感谢 SCOTRRCC 项目的共同申请人及合作者就本文讨论的部分主题所提供的有益讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抑蛋白酶肽SigmaA6279
磷酸酶抑制剂混合物 2SigmaP5726
磷酸酶抑制剂混合物 3SigmaP0044
蛋白酶抑制剂混合物Roche11836153001
Triton X-100Triton-XT8787
Li-Cor Odyssey 封闭缓冲液Li-Cor927-40000
TissueLyserQiagen85600
MicroGrid II 机器人点样仪Biorobotics
FastFrame' 四槽载玻片架Whatman10486001
FAST 载玻片 - 双垫Whatman10485317
IRDye 680LT 山羊抗小鼠 IgGLicor926-68020
IRDye 800CW 山羊抗兔 IgGLicor926-32211

参考文献

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