反向蛋白相位阵列（RPPA）能够利用荧光标记的抗体，同时检测印迹在硝酸纤维素载玻片上的数百个样品的蛋白质表达水平。该技术已被应用于研究透明细胞肾癌中药物治疗反应的异质性。
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摘要
摘要
目前，转移性透明细胞肾细胞癌尚无治愈性治疗方法，该类型是此疾病的最常见亚型。治疗耐药的一个关键因素被认为是疾病的分子复杂性1。靶向治疗药物如酪氨酸激酶抑制剂（TKI）舒尼替尼已被应用，但仅有40%的患者产生应答，且其中绝大多数患者在1年内复发2。因此，肾细胞癌患者中内在性与获得性耐药的问题具有重要意义3。
为了研究对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的耐药性，并最终开发出有效且个性化的治疗方案，需要在靶向治疗经过特定时间段后获取连续的组织样本，这一策略在慢性髓性白血病中已被证明是成功的4。然而，该策略在肾细胞癌中的应用受到肿瘤间和瘤内高度异质性的限制，这种异质性是肾细胞癌5,6以及其他实体瘤7的特征。即使在临床表现、肿瘤分期和分级相似的患者中，由于转录组和遗传差异所导致的肿瘤间异质性也已得到充分证实。此外，肾细胞癌（RCC）中存在显著的形态学（瘤内）异质性，这很可能反映了更为复杂的分子异质性。通过对肾细胞癌肿瘤进行形态学分析与Fuhrman分级相结合的详细绘图与分类，可筛选出具有代表性的区域用于蛋白质组学分析。
基于蛋白质的肾细胞癌（RCC）分析因其在病理学实验室中广泛可用而具有吸引力；然而，由于特异性抗体的供应有限，其应用可能面临问题8。由于反相蛋白质阵列（RPPA）具有点印迹的特点，抗体的特异性必须预先验证，因此所用抗体的严格质量控制至关重要9。尽管存在这一限制，点印迹格式仍可实现检测的小型化，从而能够在单张硝酸纤维素载玻片上打印数百个样本。打印后的载玻片可类似于Western印迹分析进行检测，使用靶标特异性的初级抗体和荧光标记的次级抗体，实现多重检测。通过比较荧光信号的相对强度，可同时分析载玻片上所有样本中蛋白质表达的差异，具有更高的成本效益和高通量优势。
方案
1. 形态学和分子肿瘤异质性的鉴定
- 从 -80 °C 冰箱中取出肿瘤组织，并置于干冰上保存。
- 将肿瘤组织分割成约 1 cm3 的小块。记录每块肿瘤组织之间的原始相对位置，并用唯一名称进行标记。将样本分别储存于 -80 °C 冻存管中，直至使用。
- 用 OCT 包埋样本，并在 -22 °C 下用冷冻切片机进行切片。
- 采用苏木精和伊红（Hematoxylin and Eosin）复染法对样本进行染色。
- 对冷冻切片进行显微镜分析，以确认其为 ccRCC 组织性质、具有活性的肿瘤组织，并进行分级（低级别、高级别或混合型低/高级别；在冷冻切片上区分 Fuhrman 1 至 4 级较为困难）。图 1 a&b （高级别、低级别及混合级别 H&E 染色结果）。
- 从每个肿瘤内形态学不同的区域中最多选取 4 个样本用于蛋白质提取。
2. 从肿瘤样本中提取蛋白质
- 从OCT中切取肿瘤样本。
- 将50–75 mg组织放入含有990 μl裂解缓冲液［50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM EGTA（pH 8.5）、150 mM NaCl］的2 ml离心管中，并加入抑蛋白酶肽（Sigma A6279）（10 mg/ml）、磷酸酶抑制剂混合液2（Sigma, P....
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结果
在图4(i)中可以看到一张扫描后的RPPA芯片示例，其中同时显示了680 nm和800 nm两个通道。按波长分离图像后，图4(ii)可实现对RPPA芯片上每个点样区域的分析，并确定各个蛋白质的表达水平（图4(iii)）。如图4(iii)所示，不同样本中各蛋白质的表达模式具有特异性：Gelsolin在整个芯片上的表达水平较高，而cMYC的蛋白表达水平则明显较低，但仍可在所有检测样本中普遍检测到。相比之下，CD10表现出可变的表达模式，某些样本中表达水平较高，而其他样本中则几乎无法检测到表达信号。最后，pJAK2未能产生任何高于背景水平的可检测蛋白表达信号。从质量控制的角度来看，pJAK2的结果不可接受，而CD10的结果则可接受，因其在芯片上多个样本中检测到了明确的蛋白表达信号。图5展示了不同物种的一抗与二抗之间无交叉反应性的结果。用于计算单张RPPA芯片上各样本信号强度的Supercurve拟合曲线示例如图6所示。这些曲线用于生成基于相对.......
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讨论
本文介绍的反相蛋白微阵列（RPPA）方法是一种高通量的蛋白质分析技术，可作为广泛使用但通量相对较低的蛋白质印迹（Western blot）技术的替代方案。该方法能够对数百个样本进行半定量分析，并实现同时比较，从而直接评估多种细胞系和组织样本中关键蛋白质的表达差异。通过使用不同物种来源的抗体进行多重检测，可进一步提升该技术的检测能力，实现多种抗体的同时应用。本文展示的实例突出了RPPA在肿瘤异质性研究以及靶向治疗对异质性影响分析中的应用价值。
作为一种技术，反相蛋白微阵列（RPPA）包含多个关键步骤，其中抗体的选择至关重要。由于该技术具有点印迹（dot blot）的特性，在分析过程中无法确认抗体的特异性，因此必须在使用前完成验证。在本研究中，共对83种抗体进行了Western印迹验证，其中仅有58种通过验证（失败率约为30%）。在这58种抗体中，有55种在RPPA分析中获得了可接受的结果（成功率为95%）。其他关键步骤还包括选择用于在RPPA芯片上点样样本的蛋白浓度以及点样均匀性。较高的蛋白浓度可提高检测灵敏度，但可能因蛋白量不足而减少可点样的样本数量。能够提供足够蛋白用于RPPA点.......
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致谢
上述作者 FCO、DF、JN、DJH 和 GDS 的工作由首席科学家办公室资助，资助编号：ETM37，并得到英国癌症研究会实验癌症医学中心的支持。AL 的工作由爱丁堡皇家外科医学院罗伯逊信托基金、癌症护理与治愈梅尔维尔信托基金以及英国医学研究理事会资助。IO 获得由玛丽·居里行动计划和英国医学研究理事会共同资助的爱丁堡皇家学会苏格兰政府研究员项目的支持。作者谨此感谢 SCOTRRCC 项目的共同申请人及合作者就本文讨论的部分主题所提供的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抑蛋白酶肽 | Sigma | A6279 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 2 | Sigma | P5726 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 3 | Sigma | P0044 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey 封闭缓冲液 | Li-Cor | 927-40000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II 机器人点样仪 | Biorobotics | ||
| FastFrame' 四槽载玻片架 | Whatman | 10486001 | |
| FAST 载玻片 - 双垫 | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT 山羊抗小鼠 IgG | Licor | 926-68020 | |
| IRDye 800CW 山羊抗兔 IgG | Licor | 926-32211 |
参考文献
- Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al.
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重印与许可
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