Citrobacter rodentium 小鼠模型：研究病原体与宿主在感染性结肠炎中的作用

摘要

Citrobacter rodentium 感染为研究小鼠肠道细菌感染、宿主免疫反应以及结肠炎提供了一个有价值的模型。本方案概述了屏障完整性的测定、病原体载量及组织学损伤的评估，从而能够全面表征病原体和宿主在小鼠感染性结肠炎中的作用。

摘要

本方案概述了建立感染性疾病和结肠炎可靠模型所需的步骤，以及用于表征小鼠感染Citrobacter rodentium的方法。C. rodentium是一种革兰氏阴性、小鼠特异性的细菌病原体，与临床上重要的致病性大肠杆菌（enteropathogenic E. coli）和肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic E. coli）密切相关。免疫功能健全的小鼠在感染C. rodentium后，会出现轻微且短暂的体重下降和腹泻。组织学上可观察到肠道隐窝延长、免疫细胞浸润以及杯状细胞减少。感染通常在3至4周后被清除。通过在感染后的不同时间点测定肠上皮屏障完整性、细菌载量和组织学损伤，可对易感小鼠品系进行表征。

细菌病原体在宿主肠道中定植的毒力机制，以及宿主防御此类感染的特异性免疫反应，目前仍不甚清楚。因此，C. rodentium 作为肠道细菌感染的模型，为我们理解这些过程提供了重要的研究工具。肠道细菌还与炎症性肠病（IBD）相关。有假说认为，在具有遗传易感性的个体中，肠道黏膜免疫系统对肠道细菌的异常暴露，可能导致IBD患者出现适应不良的慢性炎症反应。因此，对感染性结肠炎模型的研究在阐明宿主对肠道细菌潜在致病性反应方面具有重要意义。C. rodentium 诱导的结肠炎正是这样一种罕见的模型，可用于分析宿主对肠道细菌的免疫反应，进一步揭示IBD发病机制的潜在途径，这对于开发新型预防和治疗策略至关重要。

引言

肠道致病菌感染会引发胃肠道（GI）炎症以及肠道病理学和生理学改变，包括腹泻和肠道上皮屏障功能障碍。尽管细菌病原体在宿主胃肠道内定植的毒力机制，以及宿主抵抗此类感染的特异性应答机制尚不完全清楚，但近年来在模拟肠道细菌感染方面的进展已开始促进我们对这些过程的理解。肠道细菌还与炎症性肠病（IBD）相关。克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）是两种病因未明的复杂疾病，其特征为慢性肠道炎症和组织损伤。目前存在多种小鼠肠道炎症模型，包括通过基因修饰品系（如 IL10 -/- 小鼠）自发产生的炎症模型，以及使用化学物质（如葡聚糖硫酸钠（DSS）和二硝基苯磺酸（DNBS））诱导的化学刺激模型¹。有假说认为，IBD 患者体内存在的失调性慢性炎症反应，是在遗传易感个体中，肠道黏膜免疫系统异常接触肠道细菌后所引发的²，因此对感染性结肠炎模型的研究也为明确针对肠道细菌的潜在致病性宿主反应提供了重要机会。Citrobacter rodentium 诱导的结肠炎是少数已被充分表征的感染性结肠炎模型之一^1,3，可用于分析宿主对肠道细菌的应答，并进一步理解 IBD 发病机制的潜在途径；这是开发新型预防和治疗策略的关键步骤。

C. rodentium 是一种革兰氏阴性、具有附着和抹除（A/E）效应的鼠类特异性细菌病原体，与重要的人类病原体肠致病性大肠杆菌密切相关 E. coli （肠致病性大肠杆菌，EPEC）和肠出血性大肠杆菌 E. coli （肠出血性大肠杆菌）^3-8A/E类病原体家族紧密附着于盲肠和结肠上皮细胞的顶端宿主细胞膜，于宿主细胞上形成一种非侵袭性的、类似 pedestal 的结构。经口服攻击后 C. rodentium 10 中的⁸-10⁹ 生物体产生一种感染性结肠炎的稳健模型，其特征为结肠增生或隐窝延长、单核免疫细胞浸润以及杯状细胞减少^3,4感染后数小时内，最初的定植部位为盲肠斑，随后在感染2至3天后进展至远端结肠。³在免疫功能正常的小鼠品系中，病原体的清除通常在感染后3至4周内完成。^1,3,4然而，许多基因改造菌株， 即 基因缺陷型或基因敲除（-/-）小鼠被发现对感染的易感性增加，导致损伤加重和/或慢性感染与炎症^9-14在这些缺乏天然免疫信号蛋白的基因敲除品系中，利用该感染性结肠炎模型对于揭示多种在肠道感染和炎症消退过程中起关键作用的宿主蛋白至关重要。

方案

1. 准备 柠檬酸杆菌 rodentium 接种物制备与小鼠口服灌胃

1. 制备LB（Luria Bertani）培养基并进行高压灭菌。
2. 从冻存的甘油菌种中取出有活性的 C. rodentium，使用无菌接种环或移液器吸头将其划线接种至LB琼脂平板上。于37 °C培养过夜。用接种环或移液器吸头挑取LB平板上的菌落，接种于含3 ml无菌LB液体培养基的Falcon培养管中。接种物的制备过程应采用无菌操作技术。
3. 将 C. rodentium 培养物置于37 °C恒温摇床中，以200 rpm振荡培养过夜，进行需氧培养。经 overnight 培养后，接种的LB液体培养基应呈现浑浊状态。
4. 使用连接1 ml注射器的球状头胃饲针，对每只小鼠进行100 μl过夜培养的 C. rodentium 菌液灌胃。操作时，用拇指和手指牢固抓住小鼠颈背部松弛的皮肤，轻轻固定其颈部；用食指向后轻拉小鼠头部，使其头部固定并伸直食道，以便插入胃饲针。
5. 保持小鼠直立姿势，将胃饲针的球状头沿其口腔侧边滑入，并越过舌面。轻柔地将针头沿上颚推进，进入食道。若在操作过程中感到阻力，应立即退出胃饲针并重新插入。
6. 缓慢注入100 μl细菌接种液，然后轻柔地取出胃饲针。将小鼠放回笼盒后，密切观察其呼吸频率和行为表现。

注意事项：

• 在步骤 2 和 3 中，还需使用无菌技术准备一支含有 3 ml 无菌 LB 肉汤的 Falcon 培养管，过夜培养以确保肉汤本身无细菌污染。LB 肉汤在过夜培养后应保持澄清。
• 在步骤 4 进行灌胃前，应轻轻振荡 Falcon 管中的培养物，以确保每只小鼠接受等量的细菌剂量。
• 若过夜培养接种时间超过 24 小时，则应弃置该培养物。
• 所有 C. rodentium 感染操作及感染动物的饲养均应在生物安全二级（Biosafety Level 2）设施中进行。

2. 测定C. rodentium感染小鼠结肠上皮屏障通透性

1. 在感染后的预定时间点测定屏障完整性。
2. 在检测当天，配制足够量的4 kDa荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖，用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解至浓度为80 mg ml^-1，用于每只小鼠灌胃150 μl，并用于制备标准曲线。
3. 用手固定小鼠颈部皮肤，进行150 μl FITC-葡聚糖灌胃。此时从小鼠笼中移除食物。
4. 灌胃后4小时将小鼠麻醉，并通过心脏穿刺尽可能采集血液（约450 μl）。将血液加入含终浓度为3%酸性柠檬酸葡萄糖的微量离心管中，以防止凝固。处死小鼠，并将结肠组织分别置于PBS中用于细菌计数（步骤3.1 - 3.5），以及置于10%福尔马林中用于组织固定，最终进行免疫荧光染色（步骤4.1 - 4.8）。
5. 将血液样本在4 °C下以1,000 × g离心12分钟。收集血清，并用PBS稀释至1/10和1/100。将每个样本在这两个稀释度下的100 μl等分试样以复孔形式加入96孔板中。
6. 为制备标准曲线，将用于灌胃小鼠的原始80 mg ml^-1 FITC-葡聚糖用PBS稀释成以下浓度：800、400、200、100、50、25、12.5、6.25和0 μg/ml。将每种浓度的溶液各100 μl以三复孔形式加入96孔板中。
7. 使用荧光计在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测定各样品的荧光强度。
8. 通过绘制标准曲线分析原始数据。将每个样品的原始数据代入由标准曲线生成的直线方程，以确定各样品中FITC-葡聚糖的浓度。

注意事项：

• 从第4步开始，将血液样本置于冰上并尽量减少光照暴露。
• 在检测上皮屏障完整性时，选择感染后7天内或7天前的时间点为最佳，因为此后将发生严重的组织损伤。在严重损伤发生前检测屏障完整性，可使您确定不同小鼠品系在 C. rodentium 感染期间通透性的最大差异。
• 确保同时检测未感染的对照组小鼠的上皮屏障完整性。

3. 测定C. rodentium感染小鼠组织中的细菌载量

1. 采用无菌操作技术，向一个圆底的 2 ml 离心管中加入 1 ml 无菌 PBS 和一颗已灭菌的金属珠。从每只动物采集的独立组织样本应分别放入不同的 PBS 管中。在加入组织前，先称量各离心管的质量。
2. 从小鼠体内取出盲肠和结肠。将盲肠与结肠分离，并用镊子挤出肠腔内容物，将内容物加入 PBS 管中。从远端结肠和盲肠各截取 0.5 cm 的组织段用于 10% 甲醛固定后，将剩余的结肠和盲肠沿纵轴剪开，并用无菌 PBS 冲洗，再将组织放入离心管中。
3. 称量加入组织后的 PBS 管质量，然后使用珠磨匀浆器在 30 Hz 条件下匀浆 6 分钟。
4. 采用无菌操作技术，向 96 孔板的每个孔中加入 180 μl 无菌 PBS。将每种匀浆样本各取 20 μl 加入每行的第一个孔中。充分混匀后进行连续梯度稀释，从每个前一孔中取 20 μl 加入下一孔，获得从 10^-1（第一孔）到 10^-6 的系列稀释液。将每个样本各稀释度的 10 μl 分别以每稀释度三重复点样于带网格的方形底 LB 培养皿上。在 37 °C 下培养过夜。
5. 计数菌落形成单位（CFU），取三个重复孔的平均值，并记录每个样本计数时对应的稀释倍数。将平均 CFU 值乘以 50（因原始 1 ml 样本中取了 20 μl），再乘以计数时对应的稀释倍数，得到 CFU/ml。最后除以组织重量，计算出 CFU/g。

4. 感染结肠组织的组织学评估与免疫荧光染色

1. 按照步骤3.2收集组织。将组织在福尔马林中固定过夜，然后用70%乙醇洗涤。将组织包埋于石蜡中，并切取5 μm厚的切片用于染色。使用苏木精和伊红进行组织学评估，并按以下步骤进行免疫荧光染色。
2. 染色前进行脱蜡处理：将载玻片放入科柏林染色缸中，置于65 °C水浴中10分钟。随后将载玻片依次浸入二甲苯中，每次2分钟，共洗涤四次。接着用100%乙醇洗涤两次，每次5分钟，再依次在95%乙醇、75%乙醇和dH₂O中各洗涤5分钟。上述操作应在通风橱中进行，以避免接触有害蒸气。
3. 将载玻片放入盛有预热的柠檬酸钠缓冲液的科柏林染色缸中，然后置于蒸锅中加热30分钟，之后静置冷却30分钟。该步骤可破坏福尔马林固定所形成的蛋白质交联，从而暴露潜在的抗原位点。
4. 用含叠氮化钠的PBS缓冲液洗涤5分钟，重复三次。擦干载玻片，并使用PAP笔在组织周围画圈，形成疏水屏障，使染色试剂局限于组织区域。
5. 在免疫组化湿盒中，室温下用封闭缓冲液（e.g. α-山羊血清）封闭组织1小时。
6. 使用抗体稀释缓冲液将一抗稀释至所需浓度。吸去封闭液，向组织上加入50–100 μl一抗。4 °C孵育过夜，或室温孵育2小时。
7. 用含叠氮化钠的PBS缓冲液洗涤5分钟，重复三次。向组织上加入50–100 μl用抗体稀释缓冲液稀释的二抗，室温避光孵育1小时。再用dH₂O洗涤5分钟，重复三次。
8. 脱水载玻片，滴加DAPI Prolong Gold封片剂，盖上盖玻片。在荧光显微镜下观察载玻片。

注意事项：

• 从第4步开始，为防止洗涤液中细菌生长，可用新鲜配制的PBS替代含叠氮化钠的PBS。

结果

在标准感染实验中，通过灌胃给予小鼠约 2.5 × 10⁸ CFU 的 100 μl 过夜培养的 C. rodentium 菌液进行感染。C57BL/6 小鼠感染 C. rodentium 后通常出现轻微且短暂的体重下降和腹泻。尽管在 C57BL/6 小鼠中较为罕见，但个别动物仍可能发病并需要实施安乐死。因此，应密切监测小鼠的体重下降程度以及诸如毛发竖立、蜷缩姿势等痛苦症状，以评估不同菌株感染对小鼠造成的影响程度。

图 1 至 4 所示结果代表了使用从冻存甘油菌种复苏的过夜培养物进行感染的实验。感染后第 7 天，对小鼠实施麻醉，并通过心脏穿刺采集血液。图 1 显示了在 C57BL/6 小鼠以及 Toll 样受体 2（TLR2）基因敲除小鼠血清中检测到的 FITC-葡聚糖水平；后者在既往研究中已被发现感染期间肠上皮屏障完整性受损⁹。在肠上皮屏障完整的情况下，4 kDa 的 FITC-葡聚糖难以透过该屏障，因...

讨论

Citrobacter rodentium 感染为研究小鼠的感染性疾病和结肠炎提供了有价值的模型。该独特模型可用于表征宿主反应以及细菌的致病特性。本方案中概述的步骤详细说明了该模型的成功应用。

在诱导结肠炎及分析反应时，本方案中有若干关键步骤需要注意。首先，必须使用LB肉汤新鲜制备过夜的C. rodentium接种物，以确保小鼠感染成功。由于大多数小鼠品系需要10⁸-10⁹个微生物的剂量才能建立感染，若接种物在摇床或室温下长时间放置，培养物中存活的微生物数量将不足以在感染后诱发结肠炎。此外，在将细菌接种物装入注射器前必须充分振荡混匀，以确保每只小鼠接受等量的细菌。在感染结束时采集组织样本时，必须将结肠组织完全浸没于足量的10%福尔马林溶液中，以实现充分的组织固定。建议将组织置于5 ml小瓶中固定，而非微量离心管，因推荐固定液体积与组织体积之比为10:1。充分固定对后续的组织学分析以及这些组织的免疫荧光染色至关重要。还需注意，不同的基因敲除小鼠品系在诱导C. rodentium结肠炎时可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Luria肉汤	ABM	G247	将25 g LB培养基粉末加入1 L水中，使用前进行高压灭菌。
带网格的平底板	Fisher	08-757-11A
Falcon培养管	Sarstedt	62.515.006
球头胃饲针	Fine Science Tools	18060-20
1 ml 注射器	BD 生物科学	309659
4 kDa FITC-葡聚糖	Sigma	FD-4
柠檬酸	Sigma	C7129
柠檬酸钠	Fisher	S279-500
葡萄糖	Fisher	D16.1
酸性柠檬酸葡萄糖			20 mM 柠檬酸，110 mM 柠檬酸钠，5 mM 葡萄糖
黑色96孔板	Fisher	07-200-762
金属珠（5 mm）	Qiagen	69989
10% 甲醛	Fisher	5F93-4
5 ml 小瓶	DiaMed	STK3205
苏木精	Fisher	H345-23
伊红	Fisher	E511-100
二甲苯	Fisher	HC700-1GAL
Tween 20	Sigma	P5927
考普林染色缸	VWR	47751-792
柠檬酸钠缓冲液			10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0
防蜡笔	Cedarlane	Mu22
山羊血清	Sigma	G902-3
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Sigma	T8532
叠氮化钠	Sigma	SZ002
封闭缓冲液			2% 山羊血清，1% BSA，0.1% Triton X-100，0.05% Tween 20，0.05% 叠氮化钠，0.01 M PBS，pH 7.2，混合 && 储存于 4 °C.
抗体稀释缓冲液			0.1% Triton X-100，0.1% BSA，0.05% 叠氮化钠，0.04% EDTA
封闭缓冲液 &和用于 tir 的抗体稀释缓冲液			与上述配方相同，但不添加去垢剂（Triton X-100 和 Tween 20）
含DAPI的Prolong Gold抗荧光淬灭试剂	Invitrogen	P-36931
盖玻片	Fisher	12.54SE
台式孵育摇床	Barnstead 实验室线	Max Q4000
荧光计	Perkin Elmer	Victor2D
冷藏离心机	贝克曼库尔特	Microfuge 22R
蒸锅	Black & Decker
荧光显微镜	蔡司	Axio Image.Z1