Citrobacter rodentium 感染为研究小鼠肠道细菌感染、宿主免疫反应以及结肠炎提供了一个有价值的模型。本方案概述了屏障完整性的测定、病原体载量及组织学损伤的评估，从而能够全面表征病原体和宿主在小鼠感染性结肠炎中的作用。
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摘要
摘要
本方案概述了建立感染性疾病和结肠炎可靠模型所需的步骤，以及用于表征小鼠感染Citrobacter rodentium的方法。C. rodentium是一种革兰氏阴性、小鼠特异性的细菌病原体，与临床上重要的致病性大肠杆菌（enteropathogenic E. coli）和肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic E. coli）密切相关。免疫功能健全的小鼠在感染C. rodentium后，会出现轻微且短暂的体重下降和腹泻。组织学上可观察到肠道隐窝延长、免疫细胞浸润以及杯状细胞减少。感染通常在3至4周后被清除。通过在感染后的不同时间点测定肠上皮屏障完整性、细菌载量和组织学损伤，可对易感小鼠品系进行表征。
细菌病原体在宿主肠道中定植的毒力机制，以及宿主防御此类感染的特异性免疫反应，目前仍不甚清楚。因此，C. rodentium 作为肠道细菌感染的模型，为我们理解这些过程提供了重要的研究工具。肠道细菌还与炎症性肠病（IBD）相关。有假说认为，在具有遗传易感性的个体中，肠道黏膜免疫系统对肠道细菌的异常暴露，可能导致IBD患者出现适应不良的慢性炎症反应。因此，对感染性结肠炎模型的研究在阐明宿主对肠道细菌潜在致病性反应方面具有重要意义。C. rodentium 诱导的结肠炎正是这样一种罕见的模型，可用于分析宿主对肠道细菌的免疫反应，进一步揭示IBD发病机制的潜在途径，这对于开发新型预防和治疗策略至关重要。
引言
肠道致病菌感染会引发胃肠道（GI）炎症以及肠道病理学和生理学改变，包括腹泻和肠道上皮屏障功能障碍。尽管细菌病原体在宿主胃肠道内定植的毒力机制，以及宿主抵抗此类感染的特异性应答机制尚不完全清楚，但近年来在模拟肠道细菌感染方面的进展已开始促进我们对这些过程的理解。肠道细菌还与炎症性肠病（IBD）相关。克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）是两种病因未明的复杂疾病，其特征为慢性肠道炎症和组织损伤。目前存在多种小鼠肠道炎症模型，包括通过基因修饰品系（如 IL10 -/- 小鼠）自发产生的炎症模型，以及使用化学物质（如葡聚糖硫酸钠（DSS）和二硝基苯磺酸（DNBS））诱导的化学刺激模型1。有假说认为，IBD 患者体内存在的失调性慢性炎症反应，是在遗传易感个体中，肠道黏膜免疫系统异常接触肠道细菌后所引发的2，因此对感染性结肠炎模型的研究也为明确针对肠道细菌的潜在致病性宿主反应提供了重要机会。Citrobacter rodentium 诱导的结肠炎是少数已被充分表征的感染性结肠炎模型之一1,3，可用于分析宿主对肠道细菌的应答，并进一步理解 IBD 发病机制的潜在途径；这是开发新型预防和治疗策略的关键步骤。
C. rodentium 是一种革兰氏阴性、具有附着和抹除（A/E）效应的鼠类特异性细菌病原体，与重要的人类病原体肠致病性大肠杆菌密切相关 E. coli （肠致病性大....
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方案
1. 准备 柠檬酸杆菌 rodentium 接种物制备与小鼠口服灌胃
- 制备LB（Luria Bertani）培养基并进行高压灭菌。
- 从冻存的甘油菌种中取出有活性的 C. rodentium，使用无菌接种环或移液器吸头将其划线接种至LB琼脂平板上。于37 °C培养过夜。用接种环或移液器吸头挑取LB平板上的菌落，接种于含3 ml无菌LB液体培养基的Falcon培养管中。接种物的制备过程应采用无菌操作技术。
- 将 C. rodentium 培养物置于37 °C恒温摇床中，以200 rpm振荡培养过夜，进行需氧培养。经 overnight 培养后，接种的LB液体培养基应呈现浑浊状态。
- 使用连接1 ml注射器的球状头胃饲针，对每只小鼠进行100 μl过夜培养的 C. rodentium 菌液灌胃。操作时，用拇指和手指牢固抓住小鼠颈背部松弛的皮肤，轻轻固定其颈部；用食指向后轻拉小鼠头部，使其头部固定并伸直食道，以便插入胃饲针。
- 保持小鼠直立姿势，将胃饲针的球状头沿其口腔侧边滑入，并越过舌面。轻柔地将针头沿上颚推进，进入食道。若在操作过程中感到阻力，应立即退出胃饲针并重新插入。
- 缓慢注入100 μl细菌接种液，然后轻柔地取出胃饲针。将小鼠放回笼盒后，密切观察其呼吸频率和行为表现。
注意事项：....
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结果
在标准感染实验中，通过灌胃方式给予小鼠约 2.5 × 108 CFU 的 100 μl 过夜培养的 C. rodentium 菌液以建立感染。C57BL/6 小鼠感染 C. rodentium 后通常表现为轻度且短暂的体重下降和腹泻。尽管在 C57BL/6 小鼠中严重病情较为罕见，但个别动物仍可能发病并需要实施安乐死。因此，应密切监测小鼠的体重下降程度以及竖毛、蜷缩姿势等痛苦症状，以评估不同菌株对感染的敏感性差异。
图 1 至 4 所示结果代表了使用从冻存甘油菌种中复苏的过夜培养物进行感染的典型实验。感染后第7天，小鼠经麻醉后通过心脏穿刺采集血液。图 1 显示了在 C57BL/6 小鼠以及 Toll 样受体 2（TLR2）基因敲除小鼠血清中检测到的 FITC-葡聚糖水平；已有研究发现，TLR2 基因敲除小鼠在感染期间表现出肠上皮屏障完整性的受损9。在肠上皮屏障完整的情况下，4 kDa 的 FITC-葡聚.......
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讨论
Citrobacter rodentium 感染为研究小鼠的感染性疾病和结肠炎提供了有价值的模型。该独特模型可用于表征宿主反应以及细菌的致病特性。本方案中概述的步骤详细说明了该模型的成功应用。
在诱导结肠炎及分析反应时，本方案中有若干关键步骤需要注意。首先，必须使用LB肉汤新鲜制备过夜的C. rodentium接种物，以确保小鼠感染成功。由于大多数小鼠品系需要108-109个微生物的剂量才能建立感染，若接种物在摇床或室温下长时间放置，培养物中存活的微生物数量将不足以在感染后诱发结肠炎。此外，在将细菌接种物装入注射器前必须充分振荡混匀，以确保每只小鼠接受等量的细菌。在感染结束时采集组织样本时，必须将结肠组织完全浸没于足量的10%福尔马林溶液中，以实现充分的组织固定。建议将组织置于5 ml小瓶中固定，而非微量离心管，因推荐固定液体积与组织体积之比为10:1。充分固定对后续的组织学分析以及这些组织的免疫荧光染色至关重要。还需注意，不同的基因敲除小鼠品系在诱导C. rodentium结肠炎时可.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究得到了加拿大克罗恩病和结肠炎基金会（CCFC）及加拿大卫生研究院（CIHR）向 BAV 提供的运营资助。GB 获得了 CIHR 研究生奖学金的资助。BAV 担任儿童肠道与肝脏疾病（CHILD）基金会小儿炎症性肠病研究讲席及加拿大研究讲席小儿胃肠病学教授。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Luria肉汤 | ABM | G247 | 将25 g LB培养基粉末加入1 L水中，使用前进行高压灭菌。 |
| 带网格的平底板 | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon培养管 | Sarstedt | 62.515.006 | |
| 球头胃饲针 | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml 注射器 | BD 生物科学 | 309659 | |
| 4 kDa FITC-葡聚糖 | Sigma | FD-4 | |
| 柠檬酸 | Sigma | C7129 | |
| 柠檬酸钠 | Fisher | S279-500 | |
| 葡萄糖 | Fisher | D16.1 | |
| 酸性柠檬酸葡萄糖 | 20 mM 柠檬酸，110 mM 柠檬酸钠，5 mM 葡萄糖 | ||
| 黑色96孔板 | Fisher | 07-200-762 | |
| 金属珠（5 mm） | Qiagen | 69989 | |
| 10% 甲醛 | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml 小瓶 | DiaMed | STK3205 | |
| 苏木精 | Fisher | H345-23 | |
| 伊红 | Fisher | E511-100 | |
| 二甲苯 | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| 考普林染色缸 | VWR | 47751-792 | |
| 柠檬酸钠缓冲液 | 10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0 | ||
| 防蜡笔 | Cedarlane | Mu22 | |
| 山羊血清 | Sigma | G902-3 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| 叠氮化钠 | Sigma | SZ002 | |
| 封闭缓冲液 | 2% 山羊血清，1% BSA，0.1% Triton X-100，0.05% Tween 20，0.05% 叠氮化钠，0.01 M PBS，pH 7.2，混合 && 储存于 4 °C. | ||
| 抗体稀释缓冲液 | 0.1% Triton X-100，0.1% BSA，0.05% 叠氮化钠，0.04% EDTA | ||
| 封闭缓冲液 &和用于 tir 的抗体稀释缓冲液 | 与上述配方相同，但不添加去垢剂（Triton X-100 和 Tween 20） | ||
| 含DAPI的Prolong Gold抗荧光淬灭试剂 | Invitrogen | P-36931 | |
| 盖玻片 | Fisher | 12.54SE | |
| 台式孵育摇床 | Barnstead 实验室线 | Max Q4000 | |
| 荧光计 | Perkin Elmer | Victor2D | |
| 冷藏离心机 | 贝克曼库尔特 | Microfuge 22R | |
| 蒸锅 | Black & Decker | ||
| 荧光显微镜 | 蔡司 | Axio Image.Z1 |
参考文献
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel D....
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重印与许可
