激光显微切割技术能够从微量的实质组织中分离特定细胞。本文描述了一种从手术标本中获取人胰腺胰岛用于转录组学研究的实验方案。该方案可增强人β细胞固有的自发荧光，从而便于其收集。
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摘要
摘要
激光显微切割（LMD）是一种能够从微量实质组织中分离特定细胞和组织的技术1,2。分离的细胞可用于多种研究，例如转录组学或蛋白质组学分析、DNA检测或染色体分析2,3。LMD的一项尤其具有挑战性的应用是转录组分析，由于RNA的不稳定性4，当从富含RNase的组织（如胰腺）中分离细胞时，这一问题尤为突出。在此情况下，必须采用一种能够快速识别和收集目标细胞的显微切割方案，以缩短组织处理时间，从而确保RNA的完整性得以保存。
本文介绍了一种从手术标本中获取人胰腺β细胞用于转录组学研究的实验方案5。从小块外观正常的胰腺切除组织中切取约0.5–1 cm3的胰腺组织，包埋于Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂中，立即浸入预冷的2-甲基丁烷中速冻，并在-80 °C保存直至切片。在-20 °C条件下，使用冷冻切片机连续切取40张厚度为10 μm的切片，每张切片单独转移至玻璃载片上，在冷冻切片机内干燥1–2分钟，随后于-80 °C保存。
在激光显微切割操作前，切片立即用冰上预冷的新鲜配制的70%乙醇固定30秒，随后在冰上预冷的DEPC处理水中浸洗5-6次，再依次用冰上预冷的100%乙醇孵育两次（每次1分钟）以及二甲苯（用于组织脱水）处理4分钟进行脱水；之后将组织切片在空气中干燥3-5分钟。重要的是，除二甲苯孵育步骤外，所有操作均使用冰上预冷的试剂——这是对先前描述的方案6的一项改进。使用冰上预冷的试剂显著增强了β细胞的内源性自发荧光，从而有助于其识别。每次进行显微切割时处理四张切片：其中两张置于铝箔包裹的50 ml离心管中，以防止组织受潮和荧光漂白；另外两张则立即进行显微切割。该操作使用PALM MicroBeam仪器（Zeiss）并采用自动激光压力弹射（AutoLPC）模式完成。从四张冷冻切片中完成β细胞/胰岛的切割不超过40-60分钟。收集的细胞被置于一个AdhesiveCap中，并用10 μl裂解缓冲液裂解。每次转录组分析所用的单个RNA样本均由10份显微切割获得的细胞样本合并后，再使用Pico Pure RNA分离试剂盒（Arcturus）提取RNA获得。该方案可增强人β细胞的内源性自发荧光，从而促进其快速而准确的识别与收集。对该方法的进一步优化有望实现表型不同的β细胞的分离，可能有助于更深入理解与2型糖尿病相关的变化。
方案
1. 人胰腺组织的冷冻
- 使用手术刀和镊子去除脂肪组织、血管、神经及非实质组织，将胰腺组织切成小块（约 0.5–1 cm 的立方体）。
- 将一块胰腺组织置于冷冻模具中央，完全覆盖冰冷的 Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂。将冷冻模具放入底部铺有预冷异戊烷（2-Methylbutane）的容器中，再在液氮中快速冷冻。将冷冻样品储存在 -80 °C 条件下。
2. 冷冻切片的制备
- 所有步骤中均需佩戴手套，以避免RNA降解。
- 用冷的100%乙醇和RNase Away清洁冷冻切片机刀片、样本架和画笔。将冷冻组织放入冷冻切片机内。
- 等待组织、刀片和刷子温度降至 -20 °C. 标记 SuperFrost Plus 载玻片，并在等待组织温度降至 -20 时将其预先冷却置于冷冻切片机腔室内 °C.
- 在样本托上涂抹Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂，然后将冷冻组织置于其上。
- 待Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂完全冻结后，用剃刀片修整冷冻组织块，并切除多余的Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂。
- 总共连续切取40个10 μ从胰腺组织块中切取 m 片。此外，建议保留第一片和中间片，用于绘制胰腺切片的概览图，以在显微解剖过程中辅助识别各切片中的胰岛。
- 将切片从刀片转移至SuperFrost Plus载玻片中央，操作时用戴手套的手指轻触载玻片背面，仅使切片需粘附的区域受热。
- 在-20℃的冰冻切片机内干燥切片1-2分钟 °C，然后将它们放入置于干冰上的载玻片盒中。在-80℃下保存切片 °C.
- 必要时，用纸巾和冷的100%乙醇清洁刀片。
3. 冷冻切片的脱水
- 准备试剂：将 30 ml 新鲜配制的 70% 乙醇、30 ml DEPC 处理水、2×30 ml 100% 乙醇和 30 ml 二甲苯分别倒入 50 ml Cellstar 管（Falcons）中；除二甲苯外，所有试剂均需冰上预冷并保存。
- 用 100% 乙醇和 RNaseZAP 清洁通风橱内的工作区域。
- 按以下步骤处理两片冷冻切片：先在冰上预冷的 70% 乙醇中固定 30 秒，然后在冰上预冷的 DEPC 处理水中快速浸洗 5–6 次，再于冰上预冷的 100% 乙醇中脱水两次，每次 1 分钟，接着在室温（25 °C）下用二甲苯孵育 4 分钟，最后晾干 3–5 分钟。对另一对冷冻切片重复此步骤。
- 将两张干燥的冷冻切片背对背插入一个用铝箔包裹的 50 ml Cellstar 管中，以避免光照和湿气。
4. 使用 PALM MicroBeam（蔡司）进行β细胞的激光显微切割
- 使用 RNaseZAP 清洁显微镜，并将粘附帽安装到 RoboMover 上。
- 设置以下参数：滤光片组 09（激发波长：450–490 nm，发射波长 > 515 nm），AutoLPC 模式，50% 激光能量，65% 激光聚焦，100% 激光速度，AutoLPC 打点间距 5 μm，到线距离 6 μm，工作高度：-10,100。
- 将一张载玻片插入载物台。
- 在显微镜下（使用 5× 或 10× 物镜）定位自发荧光的β细胞。
- 切换至 40× 物镜，使用“自由手绘”选择工具选中β细胞，并用激光进行显微切割。
- 将四张脱水冷冻切片的组织收集至同一个粘附帽中。
注释 1：切割一张脱水冷冻切片中β细胞的时间不应超过 10–20 分钟，以避免组织切片重新水化，从而导致 RNA 降解。
注释 2：将载物台移至检查点后，通过目视检查确认显微切割是否成功。
5. 激光显微切割富集的β细胞组织的裂解
- 从 RoboMover 上取下 AdhesiveCap。
- 将 10 μl 提取缓冲液（XB，PicoPure RNA 提取试剂盒，Arcturus）加入 AdhesiveCap 的盖子中，倒置后于 42 °C 孵育 30 分钟。
- 在 10,000 x g 条件下离心，将裂解液置于干冰上。在进行 RNA 提取前，于 -80 °C 保存。
- 对所有其他切片重复步骤 3.) 至 5.)。
6. RNA 提取
- 将全部十个10 μl裂解液合并
- 按照Arcturus公司PicoPure RNA分离试剂盒的操作说明，在室温下进行RNA提取，使用1:1比例的提取缓冲液（XB）与70%乙醇（包括DNase处理步骤）。
7. RNA 分析
- 使用 1 μl RNA，通过 Agilent 2100 生物分析仪（PicoChip）分析其质量和数量。定量评估以芯片上平行加载的标准 RNA 为参照进行。
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结果
如图1所示，与先前发表的脱水方案相比，改进后的脱水方案提高了β细胞的自发荧光信号6。采用所述方案，每例39例手术获取的胰腺标本均制备了40张连续冷冻切片，平均每例胰腺标本获得31'544'704 μm3组织（范围：8'742'390 - 81'522'153 μm3），如表1所示。该体积相当于约18个直径为150 μm的胰岛，或约35,000个β细胞。组织平均来源于每例胰腺标本中的38个不同胰岛（范围：19 - 80个胰岛），每个胰岛通常在两个或更多连续切片中被观察到。不同标本间胰岛收获量的较大差异反映了组织来源的异质性，包括胰头或胰尾，同时也体现了操作者在每张切片10分钟的观察时间内对胰岛识别能力的逐步提升。
每份显微切割并裂解的组织中的总RNA使用Applied Biosystems的Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit进行纯化，并洗脱于 11 μl，按照制造商的说明书进行。随后 1 μl 使用 A...
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讨论
我们介绍一种从手术获取的胰腺标本中进行激光显微切割（LMD）分离人胰岛的可靠方法。只要有LMD显微镜，该方法可在任何开展部分胰腺切除术的研究机构中实施，从而增加获取来自非糖尿病和2型糖尿病受试者的胰岛组织的机会。这一点尤为重要，因为可用于胰岛分离的胰腺供体极为稀缺。与胶原酶消化法分离胰岛相比，LMD的优势在于组织离体后至胰岛处理用于RNA提取的时间更短7，β细胞富集度更高7，并且避免了剧烈的机械和酶处理过程8,9,10，这些操作可能改变基因表达谱。对于接受部分胰腺切除的患者，通常可获得比器官捐献者更丰富的临床和代谢信息。然而，通过LMD分离胰岛所获得的RNA量较少，RIN值较低，与胶原酶消化法相比存在差距，且无法提供可用于功能研究的活胰岛。此外，导致手术的胰腺疾病本身可能影响胰岛的表达谱。对这些优缺点的全面评估，将依赖于在器官捐献者或部分胰腺切除患者中，通过胶原酶消化法与LMD进行的大规模胰岛分离比较研究来实现，例如目前正在进行的多中心创新药物计划糖尿病项目（IMIDIA），其目标为“改善糖尿病治疗中β细胞功能并鉴定用于治疗监测的诊断生物标志物”（
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢所有同事在本项目各个阶段提供的帮助、建议和关键性意见。本视频文章的制作得到了IMIDIA基金的资助。http://www.imidia.org），德国教育与研究部（BMBF）向德国糖尿病研究中心（DZD， http://www.dzd-ev.de）以及德累斯顿工业大学德累斯顿大学医院卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯。本出版物所涉及的研究工作已获得创新药物计划联合企业（Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking）在第 n 号资助协议下的支持 ° 155005（IMIDIA），其资源由欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）的财政资助以及欧洲制药工业协会联合会（EFPIA）企业提供的实物贡献组成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-甲基丁烷（异戊烷） | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap（不透明，500 μl） | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar 离心管（50 ml） | greiner bio-one | 210 261 | 带支撑裙边 |
| Cellstar 离心管（50 ml） | greiner bio-one | 227.261 | |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | SIGMA | D 5758 | |
| 干冰 | |||
| 无水乙醇 | VWR | 20821.310 | |
| 液氮 | |||
| 画笔 | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way 包埋模具（截角型），12 × 12 mm | ProSciTech | RR12 | 顶部内径 22×22 mm，深度 21 mm |
| Arcturus PicoPure 冷冻 RNA 提取试剂盒 | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| 塑料夹子 | |||
| 剃刀 | |||
| 无 RNase 的 DNase 试剂盒 | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| 手术刀/外科刀片 | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus 粘附性显微镜载玻片 | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25×75×1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura | 4583 或 0807000022 | |
| 镊子 | BRAUN | BD168R | |
| 二甲苯 | VWR | 28975.291 |
参考文献
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- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962(2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415(2012).
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重印与许可
