用于微生物单细胞分析的微流控 Picoliter 生物反应器：制造、系统设置和作

摘要

在该协议中，介绍了用于原核微生物单细胞分析的微流体皮升生物反应器 （PLBR） 的制造、设置和基本作。分析工业相关的微生物作为原理证明，从而可以深入了解某些时间段内的生长速率、形态和表型异质性，这在传统方法中几乎是不可能的。

摘要

在该协议中详细描述了最近引入的微流体皮升生物反应器 （PLBR） 的制造、实验设置和基本作。PLBR 可用于分析单个细菌和微菌落，以研究生物技术和微生物学相关问题，例如细胞生长、形态、应激反应以及单细胞水平上的代谢物或蛋白质产生。该设备具有连续的介质流，可为扰动研究提供恒定的环境条件，但此外还允许快速的介质更换以及振荡条件，以模拟任何所需的环境情况。为了制造一次性设备，包含亚微米尺寸 SU-8 结构的硅晶片用作快速聚二甲基硅氧烷铸造的复制模具。芯片被切割、组装、连接并设置到适用于延时成像的高分辨率全自动显微镜上，延时成像是时空细胞分析的强大工具。在这里，将生物技术平台生物谷氨酸棒状杆菌接种到 PLBR 中，并在数小时内跟踪细胞生长和细胞内荧光，揭示单细胞水平上时间依赖性的群体异质性，这是流式细胞术等传统分析方法无法实现的。除了深入了解设备制造外，还展示了细菌的预培养、加载、捕获以及单细胞和菌落的 PLBR 培养的准备工作。这些设备将为微生物学研究增加一个新的维度，以分析在严格环境控制下单个细菌的时间依赖性现象。由于制造过程简单且相对较短，该技术可以很容易地适应任何微流体实验室，并根据特定需求进行简单定制。

引言

延时显微镜是研究体内活细胞 ¹ 的强大工具。同时，包括热诱导焦点漂移补偿在内的市售全自动显微镜平台通常用于生物研究，以研究时间依赖性现象，从癌症和神经元细胞研究到组织工程以及单个酵母或细菌细胞的动态研究^2-6。

通常使用透明的孔板、琼脂垫或简单的显微镜载玻片在延时成像过程中提供细胞培养环境⁷。尽管适用于某些研究，但这些简单的系统对环境条件的控制非常有限，并且不允许更复杂的扰动或定义明确且快速的介质变化。通过大规模生产生产的一次性微流控芯片器件最近已推向市场，但主要是针对较大的真核细胞类型量身定制的⁴。尽管可以跟踪生长，但涉及精确细胞捕获、集落大小、生长方向和细胞去除能力等明确定义的生长研究是有限的。在处理单细胞水平的定量研究时，已经开发了^8-10 个细菌细胞在 3D 环境中培养的微流体栖息地和反应器存在缺点。虽然可以分析总体群体异质性，但由于生长不限于单细胞层，因此无法用单细胞分辨率准确确定许多细胞参数。

这种限制触发了微系统的发展，使细胞能够在明确的通道和栖息地中培养细胞，细胞以单细胞分辨率在平坦的单层中生长，特别是对培养基供应和环境条件的严格控制^6,11,12。用于培养细菌细胞的微流体系统的例子很少^12-14.细菌通常表现出非常快的生长速度，并且需要几微米及以下的微流体结构，尤其是当需要细胞单层进行显微镜检查时。Keymer 等人。证明大肠杆菌菌株在微加工景观中的生长和传播^15,16。由于他们对种群动态感兴趣，因此他们没有使用单细胞分辨率进行研究。

我们开发了皮升生物反应器 （PLBR）¹³，目前用于研究各种生物技术性能指标，例如单细胞水平的生长¹⁷ 和荧光偶联生产率分析^18,19。目前的微流体装置允许在大约 1 皮升的确定培养体积下进行环境反应器控制，并同时进行连续的单细胞观察。与开放式单层盒系统^11,14 相比，其中一侧或两侧对培养基供应通道开放，PLBR 允许受控的捕获和培养。该设计允许细菌的长期培养，而不会有几个相邻菌落形成一个大种群的风险。此外，该系统结合了 1 μm 高的培养区域 （按细胞直径的顺序），以限制细菌生长到细胞单层。相比之下，供气通道深 10 倍，以最大限度地减少液压阻力。

与小型化批量培养系统²⁰ 相比，由于连续的介质流动，目前的系统允许在恒定的环境参数下进行培养。此外，介质成分、温度、流速和气体交换等环境参数可以在几秒钟内轻松控制和更改。这允许对细胞对环境变化的反应进行具体研究，例如营养可用性或压力刺激。对减少培养基体积的需求，即仅在几微升的范围内，使研究人员能够进行新的研究，例如，在这些特定环境条件下，使用大规模实验的上清液进行延时成像过程中细胞的扰动，以揭示细胞反应¹⁷。皮升生物反应器为研究人员提供了一个强大的系统，该系统严格控制生物物理条件，并使用高精度注射泵和自动明场和荧光显微镜进行延时成像。在这里，我们报告了一个完整的协议，包括器件设计、制造和示例应用。

方案

1. 晶圆制造

1. 使用 CAD 软件设计包含入口、出口、主通道和 PLBR 的微流体装置（图 1A）。
2. 该方案中提出的设计（图 2）包括两个种子入口、一个用于混合两种不同底物的梯度发生器、一个出口和六个 PLBR 阵列。每个阵列包含 5 个 PLBR，在一个微流体设备内产生 30 个并行 PLBR。
3. 创建包含所需芯片布局的光刻光掩模（图 1B）。光掩模是通过电子束写入在内部生产的，具有亚微米级分辨率。使用的掩模由 5 合² 玻璃板上的铬层组成。
   注意：在洁净室 100 级或更好的条件下执行所有以下步骤（工艺流程图如图 3A 和 3B 所示）。
4. 用食人鱼（硫酸和过氧化氢的比例为 10：1）和氢氟酸清洁 4 英寸硅晶片几分钟（注意：危险化学品）。用去离子 （DI） 水冲洗约 10 秒。
在
5. 200 °C 下将晶圆脱水 20 分钟。
在
6. 晶圆（^第 1 层）上旋涂 1 μm SU-8 2000.5 光刻胶（4 ml 光刻胶，旋转 10 秒，v = 500 rpm，a = 100 rpm/秒，旋转 30 秒，v = 1,000 rpm 和 a = 300 rpm/秒）。
7. 将涂布的晶圆放在 95 °C 的热板上以去除多余的溶剂（65 °C 下 1.5 分钟，95 °C 下 1.5 分钟，65 °C 下 1 分钟;最好使用两个加热板）。
8. 在掩模对准器内插入^第 1 层光掩模（此处为皮升反应器的捕获区域）和晶圆，并将晶圆暴露在 350-400 nm 下（真空接触，64 mJ/cm²，t = 3 秒，I = 7 mW/cm²）。
在
9. 95 °C 的热板上进行曝光后烘烤以引发 SU-8 的聚合（65 °C 下 1 分钟，95 °C 下 1 分钟，65 °C 下 1 分钟）。注意：在此步骤之后，可以看到 SU-8 层中的结构。
10. 将晶片置于 SU-8 显影液槽中 1 分钟，然后将晶片转移到装有新鲜 SU-8 显影液的第二个容器中几秒钟。
11. 用异丙醇冲洗晶片以去除 SU-8 显影剂，并使用晶片旋转器的氮气流干燥晶片。
将
12. 晶片在 150 °C 下硬烤 10 分钟。
将
13. 9 μm SU-8 2010 光刻胶旋涂到晶圆（^第2 层）（分配 4 ml 光刻胶，以 v = 500 rpm，a = 100 rpm/秒旋转 10 秒，以 v = 4,000 rpm，a = 300 rpm/秒旋转 30 秒）。
14. 将含有 SU-8 的晶片放在 95 °C 的热板上以除去多余的溶剂（65 °C 下 15 分钟，95 °C 下 45-60 分钟，65 °C 下 10 分钟）。注意：必须注意皱纹和气泡。如果将晶片加热到 95 °C，蒸发的溶剂可能会封装在微小的气泡中。
15. 将具有所需布局的光掩模（此处为营养供应的主通道）和晶圆插入掩模对准器中，并暴露于 350-400 nm（硬接触，64 mJ/cm²，t = 10 秒，I = 7 mW/cm²）
在
16. 95 °C 的热板上进行曝光后烘烤以完成 SU-8 的聚合（65 °C 下 5 分钟，95 °C 下 3：30 分钟，65 °C 下 3 分钟）。注意：在此步骤之后，可以看到 SU-8 层中的结构。
17. 将晶片置于 SU-8 显影液槽中 45 秒，将晶片转移到装有新鲜 SU-8 显影液的第二个容器中，显影 60 秒。
18. 用异丙醇冲洗晶片 20 秒以去除任何 SU-8 显影剂残留物，并使用加压氮气干燥晶片。
19. 最后在 150 °C 下硬烘烤晶圆。结果获得了最终晶圆（图 1C），该晶圆将用作 PDMS 成型的主模。
20. 执行轮廓仪测量（图 3C）以验证 SU-8 结构高度。注意：结构高度的不准确可能导致细胞捕获效率低下或培养过程中细胞丢失。

2. 聚二甲基硅氧烷芯片制造

注意：理想情况下，以下所有步骤都应在层流条件下进行，以防止灰尘颗粒干扰制造过程（工艺流程图如图 4 所示）。

1. 以 10：1 的比例制备聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 碱和固化剂的混合物。小心混合，直到获得看起来不透明的均匀溶液。准备所需层高所需的量（此处为 3 毫米）。
2. 在轻微真空下对 PDMS 混合物脱气约 30 分钟，直到所有气泡消失。
3. 用适当的 SU-8 晶片准备成型装置（或培养皿），并将 PDMS 混合物倒入其中（图 1D）。
4. 在烘箱中以 80 °C 的温度烘烤 PDMS 3 小时。
5. 小心地从晶圆上剥离 PDMS 板。使用干净锋利的手术刀将板切成单片。
6. 在正戊烷浴中清洗芯片 90 分钟，然后进行两次丙酮清洗浴（每次 90 分钟）。将木片干燥过夜以去除任何溶剂残留物。注意：在通风橱下进行 PDMS 清洗。注意：在正戊烷洗涤过程中，单体和二聚体从固化的 PDMS 中去除，并且在洗涤过程中芯片大小可能会暂时增加一倍。
7. 将微流体 PDMS 芯片储存在密闭容器中，直到最终实验。
8. 在实验之前，使用直径略小于用于连接管道与 PDMS 芯片的连接器的针（或打孔器）将入口和出口孔打入 PDMS 芯片。
9. 用异丙醇仔细清洁微流体 PDMS 芯片，并使用透明胶带去除可能粘在结构化 PDMS 侧的任何灰尘颗粒。使用透明胶带数次，直到芯片上看不到颗粒。
10. 先后用丙酮和异丙醇清洁 170 μm 薄载玻片。最后用去离子水清洗，然后用加压氮气干燥。
11. 在等离子体活化之前，预热等离子体清洁器并运行等离子体约 300 秒。等离子氧化载玻片和 PDMS 芯片（功率 50 W，时间 = 25 秒，氧气流速 = 20 sccm）。
12. 键合前对齐 PDMS 和玻璃芯片。最后，小心地将 PDMS 芯片放在载玻片上（图 1E）。PDMS 和玻璃将在几秒钟内粘合。注意：在键合过程中，请勿用镊子推到 PDMS 芯片的顶部。这可能导致通道和小型结构的屋顶坍塌。
13. 为了加强粘合力，将最终的 PDMS 玻璃芯片在 80 °C 下烘烤 10 秒。

3. 细菌培养物的制备

注意：所有培养物都应在无菌过滤培养基中制备，以防止不需要的颗粒积累，这可能会干扰培养过程中。

1. 使用含有所需生物体的琼脂平板（此处为谷氨酸梭菌 ATCC 13032），将一个菌落接种到 20 ml 新鲜 BHI 培养基中，在 30 °C 下在旋转振荡器 （120 rpm） 上孵育过夜（≈ 8-14 小时）。
2. 将 10 μl 预培养物转移到所需的培养基（此处为 CGXII²¹）中，该培养基将在微流体培养期间使用，并让细胞在 30 °C 下在旋转振荡器 （120 rpm） 上生长过夜。
3. 将所需量的细胞悬液（10-500 μl，取决于实验的开始）转移到所需的培养基（此处为 CGXII²¹）中，该培养基将在微流控细胞培养期间使用。注意：最好的是使用早期对数期的细胞进行接种。对于谷氨酸梭菌培养物，接种的最佳光密度 （OD₆₀₀） 在 0.5-2 之间。
4. 将 1 ml 细菌培养物转移到无菌的 2 ml 管中。注意：这应在组装微流体 PDMS 芯片后立即完成，以最大限度地减少摇瓶和微流体培养之间的转移时间。通常，转移时间约为 15 分钟，应尽可能缩短，以防止氧气限制和温度变化对代谢造成影响。

4. 实验设置

注意：所有步骤均使用倒置显微镜进行。

在
1. 实验前 2 小时启动显微镜培养箱以预热系统。注意：显微镜应配备全尺寸培养箱以控制温度，如果需要，还可以控制气体流量。不需要额外的湿度控制，因为芯片系统不断注入介质。
2. 打开培养箱系统，选择所需的物镜，如果需要，在物镜上添加浸油。
3. 将芯片安装在芯片座内。如果需要，请用胶带固定玻璃板，以避免在载物台作过程中碎屑移动。
4. 将样品放在显微镜的中心并聚焦到 PLBR 阵列上。
5. 用适当的管道连接入口和出口（图 1F）。将管路连接到废液槽。图 4D 中可以看到一个具有代表性的芯片。
6. 将注射器插入泵中并开始介质流动。使用培养基、缓冲液或必要时的涂层溶液，冲洗微流体通道约 1 小时。注意：涂层溶液用于涂层通道壁，以防止非特异性细胞粘附。
7. 对于大肠杆菌，使用 0.1% BSA 溶液涂覆通道壁。对于 C. glutamicum 不需要涂层。包被程序后，在细胞接种前用培养基冲洗芯片。
8. 在细胞接种和培养之前，检查是否没有发生泄漏并且温度是否恒定。

5. 将细菌细胞接种到微流体装置中

1. 确保所需的细菌溶液装在连接到管道的适当注射器中。
2. 断开缓冲液或涂层溶液，并将细胞悬液连接到芯片上。为了最大限度地减少死亡体积、不需要的气泡并缩短实验时间，请更换完整的针头和管路，而不仅仅是注射器。
3. 以 200 nl/min 的体积流速将细胞悬液注入通道中，直到大多数 PLBR 充满所需数量的细胞（图 5A）。注意：最佳接种结果取决于细菌菌株、OD₆₀₀ 和预培养物的生长培养基。必须调整这些参数以提高捕获效率和时间，直到足够数量的电池被捕获在反应器结构中。对于谷氨酸梭菌，通常使用 OD₆₀₀ 0.5-2 的细胞悬液;对于大肠杆菌，OD₆₀₀ 在 0.5-1 之间。
4. 如果仅填充少量 PLBR，则将流速增加到 800-1,200 nl/min。
5. 断开细胞悬液并将生长培养基连接到芯片（图 5B）。确保在介质更换过程中没有气泡。以 100 nl/min 的速度灌注新鲜生长培养基。

6. 延时成像

1. 选择特定的 PLBR 进行延时成像。通常，在实验开始时选择包含单个母细胞的 PLBR。一次实验中可以研究的感兴趣区域的数量取决于所需的帧速率和微观设置。
2. 根据 PLBR 的数量选择合适的帧速率。确保显微镜可以在延时间隔内处理所需数量的 ROI。
3. 选择适当的过滤器集（此处为 YFP）。在载物台移动期间和每次延时测量后自动关闭快门，以防止发色团漂白。
4. 配置延时显微镜序列并开始实验。
5. 在所有 PLBR 都过度生长后，可以停止实验，丢弃微流体 PDMS 芯片并评估实验。

7. 分析

注意：以下步骤或部分程序可以手动执行，也可以通过图像分析程序（如 ImageJ 等）执行。

1. 确定培养满足所有所需标准的目标 PLBR，例如母细胞的数量、母细胞的位置等。
2. 要确定一个微菌落的生长速率，请计算每个时间范围内的细胞数。
3. 通过绘制时间与 ln（细胞数）的关系来计算最大生长速率。该图的斜率表示以 [1/hr] 为单位的增长率（参见图 6）。
4. 荧光数据分析在很大程度上取决于所进行的实验。在本报告中，选择了一个例子来说明不同同基因微菌落之间的菌落间和细胞间异质性（见图 7）。

结果

器件制造

微流体 PLBR 系统由一层 PDMS 粘合到适用于高分辨率显微镜的薄玻璃芯片上制造。制造包括两个主要步骤：首先是复制母版的制造（图 1A、1B 和 1C），其次是芯片制造（图 1D、1E 和 1F）。根据该协议，使用标准的光刻微纳加工技术来创建母模。没有洁净室设施的实验室可以获得市售的定制 SU-8 母模。使用重复的 PDMS 成型（图 1A、1B 和 1C），可以生产数百个一次性芯片。PDMS 成型和芯片组装可以在任何实验室进行，不需要洁净室设施，但是，层流工作场所是有利的。

该过程从微流控芯片系统的设计开始。通常使用 CAD 软件来设计微流体芯片（图 1A）。在 CAD 之后，由具有亚微米分辨率的 e 光束写入器（图 1B）生成掩模。在本研究中，创造了一种 5 in 铬掩模，用于 SU-8 晶圆光刻。最终的硅 — SU—8 晶圆用于 PDMS 成型（图 1D）。经过烘烤步骤后，PDMS 板被切成芯片，这些芯片不可逆地粘合到载玻片上（图 1E）。最后，连接管子（图 1F）。

图 2 详细显示了微流体系统的设计。它由两个接种入口、一个用于混合不同底物或培养基的梯度发生器和一个出口组成。主通道的尺寸为 50 μm x 10 μm（宽 x 高）。每个器件由 6 个 PLBR 阵列组成，每个阵列包含 5 个 PLBR。这导致一个微流体设备内有 30 个并联反应器。

图 3 说明了复制主服务器生产。如协议中详细描述的，第一层 SU-8 是通过 SU-8 光刻制造的（图 3A）。类似的程序适用于第二层（图 3B）。为了检查通道的几何形状，我们使用轮廓仪研究了 PLBR 和主通道的高度。在图 3C 所示的示例中，测量了第一层（培养层）。这里该层显示出 1,200 nm 的一致高度，适合在 BHI 培养基中培养谷氨酸梭菌。

图 4 说明了 PDMS 成型程序，从 PDMS 混合开始（图 4A），然后是成型过程（图 4B），最后是粘合步骤（图 4C）。图 4D 显示了最终的微流体芯片，其中包含 170 μm 厚的玻璃板、带有入口和出口的 PDMS 芯片（高 3 mm）以及连接到管道的钢针。实验结束后，芯片可以被丢弃，无需大量清洁。此外，它易于组装和处理。不需要复杂和困难的填充程序。

Device 原理

图 5 显示了反应器系统的工作原理。细胞被注入微流体装置中，单个细胞仅通过细胞壁相互作用就被困在 PLBR 内。由于通道和 PLBR 的流体动力阻力不同，PLBR 内部只发生极小的流量。接种 PLBR 后（图 5A），从细菌溶液更改为生长培养基（图 5B），开始生长和观察阶段。在 PLBR 过度生长后（图 5C），实验通常会停止并可以分析延时图像。有关 PLBR 中的捕获机制和流动剖面，读者可参考 Grünberger 等人。¹³ 了解更多详情。

增长率分析

本系统可用于研究各种细菌种类的不同生物参数，如生长、形态或荧光信号。在第一个例子 C. glutamicum 中，在标准培养条件下（T=30 °C，CGXII 培养基²¹）培养工业相关的生产生物体。图 6A 显示了来自三个同基因微菌落的生长曲线。保持指数增长，直到 PLBR 充满，表明没有营养限制发生。图 6B 显示了生长的谷氨酸 C. 菌落的四个 DIC 延时显微镜图像。

荧光分析

对于单细胞荧光显微镜检查，研究人员通常使用特定的荧光蛋白，例如 GFP 或衍生物，将感兴趣的特定表型与可测量的输出（荧光信号）耦合。为了证明 PBLR 在基于荧光的延时研究中的适用性，我们研究了在 Ptac 启动子 （pEKEx2-yfp-tetR） 的控制下产生质粒编码的 YFP-TetR 融合蛋白的谷氨酸梭菌菌株的荧光发射^18,22。在低诱导剂 （IPTG） 浓度存在下，已知 Ptac 的表达会导致同基因细菌种群的显着细胞间变异。从一个预培养开始，跟踪几个同基因微菌落的生长和单细胞荧光。如图 7 所示，我们观察到不同微菌落之间的表型异质性以及从一个母细胞开始的菌落内单细胞水平的异质性。一个菌落 （图 7B，PLBR 1） 显示几乎没有荧光发射，而 PLBR 2 细胞由于 Ptac 启动子的基础 yfp-tetR 表达而表现出低荧光发射。在 PLBR 3 中，与其他菌落相比，荧光发射相当强，并且观察到种群分布广泛。本例证明了 PBLR 在延时荧光显微镜研究中的适用性。与流式细胞术相比，流式细胞术可以在一个时间点测定单细胞的荧光，而目前的系统允许跟踪细胞和实时研究多代细胞的单细胞荧光。

图 1.PLBR 芯片生产过程概述。主模具制造：从 （A） 设计开始，（B） 光刻掩模制造，以及 （C） 晶圆生产。PDMS 玻璃芯片生产：从 （D） PDMS 成型开始，然后是 （E） 玻璃和 PDMS 键合，以及 （F） 最终芯片组装。

图 2. PLBR 芯片的设计。（A） 整个微流控芯片的 CAD 图纸;（B） 所选版图位置的放大倍率：版图包含两个中等入口 （a1）、一个带混合通道的梯度发生器 （a2） 和 6 个并行 PLBR 阵列 （b1）。 b2 显示了一个 PLBR，它嵌入了宽度为 100 μm 的流体通道中。PLBR 的内径为 40 μm，营养通道宽度为 2 μm。接种入口的长度为 40 μm。粉红色代表第一层（诱捕和培养区域），蓝色代表第二层（流体传输）。

图 3.两层晶圆制造工艺的图示。（A） 制造包含捕获结构的第一层;（B） 制造包含流体通道、入口和出口的第二层;（C） 第一层的代表性表面轮廓。在这种情况下，第一层的高度为 1,200 nm，用于在复杂培养基中培养谷氨酸梭菌。

图 4.器件制造和代表性芯片。PDMS 成型工艺图示：（A） PDMS 混合和脱气;（B） PDMS 成型;（三）脱模、切割和切屑粘接。最终芯片（经英国皇家化学学会¹³ 许可转载）：（D） 具有 2 个入口和 1 个出口的 PDMS 芯片的照片;（E） 六个平行阵列的 CAD 图像，每个阵列包含 5 个 PLBR;（F） 一个 PLBR 的 SEM 图像。

图 5.PLBR 系统的工作原理。 （A） 播种阶段;（B） 细菌微菌落的生长期;（C） 溢流阶段。经英国皇家化学学会许可转载13。http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H。

图 6.C. glutamicum WT 微菌落的生长速率测定。（A） 三种 PLBR 培养物的生长曲线和产生的指数曲线（经英国皇家化学学会许可复制的部分）13。http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H。（B） 不断增长的 C. glutamicum 菌落的延时图像。

图 7.基于 PBLR 的种群异质性分析。所示为在不存在诱导剂 IPTG 的情况下，在 Ptac 启动子 （pEKEx2-yfp-tetR） 的控制下表达 yfp-tetR 融合的谷氨酸梭菌。（A） 实验工作流程;（B） 三个同基因微菌落，显示菌落间异质性和细胞间异质性;（C） 单细胞荧光在相应微菌落内的分布。

图 8.不同 PLBR 的扫描电子图像。SEM 图像显示了用于优化捕获效率的晶种入口。（A） 贮藏啤酒播种入口 （B） 较小的播种入口 （C） 较大的"开放式"播种入口 （D） 两个播种入口。

<表格 border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276"> 步 问题 可能的原因 溶液 晶圆制造 软烘烤过程中 SU-8 中残留的气泡 升温快 在 95 °C 和 65 °C 下烘烤数次 晶圆制造 消失和破损的 SU-8 结构 不是最佳制造程序;SU-8 结构中的机械应力 优化烘焙时间、曝光时间等参数 晶圆制造 SU-8 层到低或高或不均匀的层厚 旋涂过程中的问题 检查旋涂机参数和晶圆卡盘 芯片键合和组装 折叠 PLBR PDMS 键合参数不是最佳 调整功率、等离子曝光时间。和粘合后的烘烤时间 芯片键合和组装 PLBR 中的脏结构和颗粒 芯片未正确清洁 使用透明胶带进行表面清洁 芯片键合和组装 PDMS 玻璃粘合不足 粘接参数不是最佳或清洁不足 检查氧等离子体的设置 微流体实验 液体泄漏 入口/出口孔未正确冲孔 优化冲孔工艺 微流体实验 灌装过程中有许多小的 PDMS 颗粒 孔未正确打孔 优化冲孔工艺 < 高度="40"> 微流控实验，生物学方面 无细胞生长 清洁程序中的溶剂残留 在细胞加载之前更广泛地冲洗芯片，或在键合前让溶剂蒸发 微流控实验，生物学方面 不断变化的增长率 各种原因 检查预培养和温度 微流控实验，生物学方面 培养过程中细胞形态的变化 营养限制或温度变化 检查培养箱和流量 微流体实验，技术方面 延时显微镜检查期间的位置漂移 温度波动 在实验前检查温度曲线，直到没有振荡 微流体实验，技术方面 培养过程中的细胞损失 反应器高度略高 优化反应器高度 微流体实验，技术方面 无陷印 反应器高度过低 优化反应器高度

表 1.故障排除。 下表总结了实验工作中的关键方面、常见错误和可能的解决方案。

讨论

我们已经描述了一种包含多个（PLBR）的微流体PDMS装置的制造，实验设置和相关作程序，用于细菌的单细胞分析。

使用软光刻技术进行微加工可以快速调整各种尺寸和细菌形态的设备尺寸。目前，我们正在优化皮升生物反应器，以培养不同的微生物和培养通量。为了提高捕集效率，反应器几何形状也在优化中。 图 8 显示了目前正在验证的四个新 PLBR 设备。在所有图中，播种通道在宽度和形状方面都进行了重新设计。在实践中，这似乎对被捕获的细胞数量有影响，但需要进一步研究。通过加入额外的溢流通道，导致通过反应器的对流流量更高，并捕获更多的细胞，也实现了捕获效率的显着提高。然而，与此同时，人们会增加培养过程中洗掉细胞的风险。

该设备是宏观培养的有趣替代方案，几十年来一直用于研究单细胞水平的生长和生产过程。然而，它有一些重要的要求：对于多个皮升生物反应器的并行监测，必须采用具有焦点漂移补偿的高分辨率和全电动显微镜装置。此外，还需要一个孵育系统来在整个测量过程中保持所需的培养温度恒定。

我们在设备制造方面实现了 95% 的成功率。主要问题与PDMS玻璃粘合效率低下、PDMS屋顶塌陷或流体泄漏有关（大多数问题的故障排除见 表1 ）。尽管实验工作部分是在非无菌条件下完成的，但由于流体系统封闭，我们在实验过程中很少看到污染。PDMS微流控器件在光学上是透明的，因此可用于高分辨率的 体内 成像。尽管PDMS似乎非常适合该应用，但它对疏水分子具有很高的亲和力，使得在全细胞生物催化过程中广泛使用的溶剂的使用受到限制。然而，可以使用合适的涂层来使协议适应这些类型的应用。

所提出的PLBR非常适合对各种细菌的细胞甚至亚细胞事件进行时空分析。与传统方法相比，目前方法的一个主要优点在于能够直接量化微菌落生长。此外，PLBR 允许在规定和恒定的条件下培养。由于该系统便于使用少量试剂或材料，因此具有廉价、可定制和适合高通量的优点。在传统方法中，在分析微生物培养时考虑了整个种群的平均值。此外，现有方法需要手动采样，这可能导致样品降解，从而导致测量误差。PLBR为微生物学中的生物过程开发和群体异质性分析提供了新的视角。PLBR 是生物工艺开发中各种应用的有前途的工具，可应用于各个研究领域， 例如细胞间异质性分析、细胞谱系内特定细胞簇分析、微生物生产菌株筛选和细胞表型的实时研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅片直径 100 mm，P/BOR <100>	Si-MAT，硅材料，德国
光刻胶 SU-8 2000.5	Micro Resist Technology GmbH，德国
光刻胶 SU-8 2010	Micro Resist Technology GmbH，德国
SU-8 开发商 mr DEV- 600	Micro Resist Technology GmbH，德国
聚二甲基硅氧烷 （PDMS） Sylgard 184 有机硅弹性体套件	道康宁;Farnell GmbH， 德国
分配针头 精密尖端  27 克;内径 = 0.2 毫米，外径 = 0.42 毫米	诺信 EFD 德国，德国
玻璃板 D263 T eco，30 毫米 x 25 毫米 x 0.17 毫米	Schott AG，德国
孔机 AKA 5130-B-90	Harris 单芯
管 Tygon S-54-HL，内径 = 0.25 毫米，外径 = 0.76 毫米	圣戈班;VWR International GmbH， 德国
一次性注射器 –Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo， 1 ml	B. Braun Melsungen AG， Germany	552-183143
注射器，1 ml 无菌玻璃注射器	INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH （ILS）， Germany
Chemicals
（NH4）2SO4	Carl Roth GmbH + Co. KG， 德国
Urea	Carl Roth GmbH + Co.KG， 德国
KH2PO4	Carl Roth GmbH + Co. KG， 德国
K2HPO4	Carl Roth GmbH + Co. KG， 德国
MgSO4•7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG， 德国
MOPS	Carl Roth GmbH + Co. KG， 德国
FeSO4•7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG， 德国
MnSO4•H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG， 德国
ZnSO4•7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG， 德国
CuSO4	Carl Roth GmbH + Co. KG， 德国
NiCl2•6H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG，德国
CaCl2	Carl Roth GmbH + Co. KG，德国
生物素	Carl Roth GmbH + Co. KG，德国
儿茶酸	Carl Roth GmbH + Co. KG，德国
-一水合	物 Carl Roth GmbH + Co. KG，德国
BHI	Becton， Dickinson
Cells
谷氨酸棒状杆菌 ATTC 13032	DSMZ;莱布尼茨研究所 DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， Germany
Escherichia coli MG 1655	DSMZ;莱布尼茨研究所 DSMZ - 德国 Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH<
清洗机 SSEC 3300	固态设备有限责任
旋涂机 SPIN150 -NPP	SPS Europe B.V.
面罩对准器 MA-6	Karl Suess
热板 HP30A - 2	Torrey Pines 科学
实验室烘箱 Memmert UN 200	Memmert
等离子清洗机 FEMTO	Diener Electronics，德国
neMESYS 注射泵	Cetoni GmbH，德国
磁力搅拌器 CB 162	Stuart	VWR 442-0304
显微镜 Nikon Eclipse Ti	Nikon 显微镜
显微镜 孵化器	Pecon GmbH，德国
离心机 minispin plus "黑线"	Eppendorf	9776501
光度计 生物光度计 plus	Eppendorf	6132000008
摇瓶摇床/培养箱 3031	GFL - Gesellschaft für Labortechnik mbH， 德国
轮廓仪， Dektak 150 Stylus Profiler	Veeco