一种用于定量测量大鼠脑区能量底物摄取的双示踪剂PET-MRI方案

摘要

小动物正电子发射断层扫描能够评估大脑的两种主要能量底物：葡萄糖和酮体。 在本方法中，依次向每只动物注射¹¹C-乙酰乙酸盐和¹⁸F-氟脱氧葡萄糖，并根据磁共振图像确定的特定脑区，定量测量它们的摄取情况。

摘要

我们提出一种用于比较大鼠脑内两种关键能量底物——葡萄糖和酮体（本研究中为乙酰乙酸盐 [AcAc]）摄取情况的方法。该方法是一种小动物正电子发射断层扫描（PET）方案，其中 ¹¹C-AcAc 和 ¹⁸F-氟脱氧葡萄糖（¹⁸F-FDG）被依次注射到每只动物体内。这种双示踪剂PET成像之所以可行，是因为F-FDG的半衰期较短， ¹¹C（20.4 分钟）。大鼠还在 PET 实验方案前 7 天接受磁共振成像（MRI）扫描。在图像分析之前，将 PET 与 MRI 图像进行配准，以实现对脑区摄取（皮层、海马、纹状体和小脑）的定量测量。一种定量指标的测量方法 ¹¹C-AcAc 和 ¹⁸通过使用图像衍生输入函数（IDIF）方法进行动力学建模，测定脑部对18F-FDG的摄取（脑代谢率，单位：μmol/100 g/min）。我们新建立的双示踪剂PET方案具有良好的稳健性和灵活性；所使用的两种示踪剂可替换为不同的放射性示踪剂，以评估脑内其他生理过程。此外，本方案适用于研究多种条件下的脑能量供应，包括正常衰老以及阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病。

引言

背景与原理

正电子发射断层扫描（PET）能够以微创方式研究大脑中的功能过程。葡萄糖是大脑主要的能量底物，但在葡萄糖缺乏的情况下，酮体（乙酰乙酸[AcAc]和β-羟丁酸）成为主要的替代性能量底物。大脑能量代谢已通过PET得到广泛研究，其中最常用的PET示踪剂为 ¹⁸F-氟脱氧葡萄糖（¹⁸F-FDG），一种葡萄糖类似物。我们课题组近期开发了一种新型放射性示踪剂—¹¹C-AcAc—用于测量大脑酮体代谢¹。磁共振成像（MRI）的空间分辨率远高于PET（平面内分辨率为0.1 mm × 0.1 mm），对于脑能量代谢区域PET分析中所需脑区的精确定位至关重要。

PET 数据通常以标准化摄取值（SUV）表示^2-6SUV 是组织放射性活度浓度经注射剂量百分比/单位体重校正后的标准化值，该方法最初于70多年前提出。⁷. 这些单位仍被广泛使用，因为它们所需的PET采集和图像分析方法较为简单。然而，一个重要局限在于SUV是相对单位而非绝对单位，这使得不同研究之间的结果难以进行比较。这种比较上的困难可能导致关于老年人脑葡萄糖摄取的文献中出现相互矛盾的发现。⁸.  因此，定量脑代谢率（CMR；μmol/100 g/min）具有特定优势^9-11生成心肌代谢率（CMR）值需要进行动态正电子发射断层扫描（PET）采集，并获取血浆放射性计数随时间变化的数据。 即 血浆时间-活性曲线（TAC）或输入函数。输入函数可通过在PET采集过程中进行多次血液采样获得^9,12 或通过图像衍生输入函数（IDIF）法，即在血池区域（心脏左心室或主要动脉）勾画感兴趣区^11,13-16.

目标

本方法旨在首次利用正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI）在啮齿类动物中对大脑两种关键能量底物——葡萄糖和酮体的摄取进行定量比较。 ¹¹C-AcAc 和 ¹⁸F-FDG 在同一动物体内依次使用。该方案旨在清晰地测量在 MR 图像中可明确识别的不同相关脑区（皮层、海马、纹状体和小脑）的局部摄取情况。该方案还特别设计用于实现对示踪剂脑摄取的定量分析。 即 心脏磁共振成像（CMR） ¹⁸F-FDG 和 ¹¹C-AcAc。尽管本实验方案旨在研究脑能量底物，但我们所使用的放射性示踪剂可替换为其他示踪剂，且相同的方法学也可用于研究不同的脑功能过程。

相较于现有方法的优势

PET 和 MRI 无需在数据采集后处死动物，因此可以进行治疗的随访研究。这样可以在同一动物体内先后获取基线数据和实验条件下的数据，从而减少生物变异性以及所需的动物数量。我们这种双示踪剂 PET 方案的一个关键优势是，能够在同一成像过程中，在相同的生理条件下，于同一只动物体内比较两种示踪剂的摄取情况，从而进一步降低生物变异性和系统性差异。该双示踪剂 PET 方案之所以可行，主要得益于 ¹¹C 的较短物理半衰期（20.4 分钟）以及 ¹¹C-AcAc 快速的生物清除率，这使得在使用 ¹⁸F-FDG 进行第二次采集时，体内残留的 ¹¹C 放射性极低。MRI 扫描是本方案的重要组成部分，因为它能够使示踪剂在特定脑区的摄取情况得到研究。此外，该方法能够实现对脑组织示踪剂摄取的绝对定量测量，而不同于 SUV 方法所获得的相对单位。最后，由于生理条件下脑组织对 AcAc 的摄取相对较低，¹¹C-AcAc 图像的信噪比较低，这使得自动化的 ¹¹C-AcAc 与 MR 图像配准具有挑战性。因此，由于 ¹¹C-AcAc 与 ¹⁸F-FDG 的采集是连续进行的（动物无移动），可将 ¹⁸F-FDG 与 MRI 的配准结果应用于 ¹¹C-AcAc 图像。

该方案已被应用的关键论文

我们在一项涉及年轻大鼠禁食状态与生酮饮食（KD）比较的研究中采用了双示踪剂PET方案²。结果显示，禁食和生酮饮食均显著增加大脑对¹¹C-AcAc和¹⁸F-FDG的摄取。然而，这些结果并非定量数据，因为当时未采用动态PET成像和示踪剂动力学建模方法。随后，我们开展了一项针对老年大鼠脑代谢的区域性和定量研究，评估了衰老及生酮饮食对大脑¹¹C-AcAc和¹⁸F-FDG摄取的影响¹¹。我们还发现，¹¹C-AcAc与¹⁸F-FDG在脑区间的分布百分比存在差异。此外，在生酮饮食的老年大鼠中，不仅全脑而且纹状体的¹¹C-AcAc脑代谢率（CMR）升高，¹⁸F-FDG的脑代谢率也升高。

方案

所有实验均按照舍布鲁克大学动物护理与使用委员会以及加拿大动物护理委员会的规定完成。实验方案已获机构动物研究伦理审查委员会批准（方案编号 #011-09）。

1. 通过 MRI 观察脑解剖结构

1. 在开始实验方案前，让大鼠在动物房中适应环境至少7天。在双示踪剂PET实验方案前1至2周进行脑部MRI扫描，以确保大鼠从麻醉中完全恢复。
2. 将大鼠置于诱导麻醉室中进行麻醉。整个实验过程中使用2%异氟烷和1.5 L/min的氧气进行麻醉。通过夹捏后肢确认动物已完全麻醉。注意：吸入异氟烷在某些情况下可能导致头痛、头晕或意识丧失；应始终在通风良好的房间内，并在配备空气交换系统的条件下使用。
3. 将大鼠以头先进俯卧位放置于MRI检查台上，连接异氟烷鼻罩。安放呼吸和直肠温度探头。实验期间持续监测呼吸频率，并使用自动空气加温系统将体温维持在37 °C。
4. 采用快速自旋回波脉冲序列获取T₂加权MR图像，采集参数参照先前文献¹¹。麻醉恢复期间将大鼠置于加热垫上。

2. 双示踪剂PET采集

1. 使用配备雪崩光电二极管探测器、轴向视野约为 7.5 cm、各向同性空间分辨率为 1.2 mm¹⁷ 的小动物 PET 扫描仪。由于其物理半衰期较短，每次实验前需在回旋加速器上通过质子轰击天然氮气（经由¹⁴N(ρ,α)¹¹C 核反应）现场制备¹¹C。
2. 在 PET 扫描前使大鼠禁食 18 小时。禁食可提高¹¹C-AcAc 和¹⁸F-FDG 在脑组织中的摄取，从而改善信噪比。
3. 在诱导室中对大鼠进行麻醉，随后将其转移至带有异氟烷鼻罩的加热垫上。此时开始¹¹C-AcAc 的合成。合成过程自轰击结束起需 18 分钟，具体方法如前所述¹。
4. 将大鼠侧卧放置。准备一根充满肝素化 0.9% 氯化钠溶液（生理盐水）的 PE50 聚乙烯导管，并将其插入尾静脉用于示踪剂注射。另在尾腹侧中段动脉插入第二根导管，用于整个采集过程中的血液采样。
5. 迅速将大鼠以头先进俯卧位转移至扫描仪载物台，并连接异氟烷鼻罩。安放呼吸和直肠探头。实验期间监测呼吸频率，并通过自动温控加热系统维持体温在 37 °C。将扫描仪载物台向前推进至扫描仪内，确保同时对脑部和心脏进行适当成像。以解剖标志为准，借助激光线将视野边缘对准大鼠眼睛位置。
6. 使用高浓度¹¹C-AcAc 溶液（约 1 GBq/ml），准备一支含约 50 MBq 放射性活度的注射器（可接受范围为 45–55 MBq）。用生理盐水将体积调整至 300 μl。注意：放射性物质可能对人体有害，操作时必须在铅屏蔽后进行。实验人员应佩戴全身及指环剂量计，实验过程中应开启盖革计数器。
7. 将注射器安装在注射泵上。以 1 ml/min 的速率开始¹¹C-AcAc 的团注注射（注射持续时间约 19 秒）。在另一台泵上，¹¹C-AcAc 注射结束后立即以 1 ml/min 的速率注射 300 μl 生理盐水，这对将示踪剂充分注入血液循环至关重要。
8. 在团注开始前 30 秒启动动态 PET 数据采集，总采集时长为 20.5 分钟。示踪剂注射前的 30 秒采集数据用于测定环境本底，后续将从 PET 数据中扣除。设置常规采样模式，能量窗设为 250–650 keV。
9. 在¹¹C-AcAc 注射开始后约 15 和 18 分钟时各采集一份 200 μl 的血液样本。每次采样后向导管内注入肝素化生理盐水以防止血液凝固。记录每次采血的起止时间，并取平均时间作为采样时间点。以 6,000 RPM 离心 5 分钟后收集血浆。使用经 PET 扫描仪校准的γ计数器测量血浆中的放射性计数。
10. 完成¹¹C-AcAc 扫描后，等待 20 分钟以确保大部分放射性已衰减。等待时间可在 15–30 分钟范围内调整。此期间不得移动扫描床，且大鼠应持续处于异氟烷麻醉状态。
11. 在此期间，使用高浓度¹⁸F-FDG 溶液（约 5.5 GBq/μl），准备一支含约 50 MBq 的注射器。操作步骤完全参照第 2.6 和 2.7 步进行。启动总时长为 40.5 分钟的动态采集（包括注射前 30 秒）。在¹⁸F-FDG 注射开始后约 30 和 35 分钟时各采集一份 200 μl 血液样本。
12. 在¹⁸F-FDG 采集结束后，再采集最后一份 200 μl 血液样本。离心后收集血浆，并将血浆样本保存于 -80 °C，用于后续葡萄糖和乙酰乙酸（AcAc）分析。
13. 最后，在大鼠苏醒期间将其置于加热垫上。可选择继续进行纵向随访，或处死大鼠以获取脑组织样本并开展进一步的生化研究。
14. 按照以下时间帧序列重建 PET 图像：1 × 30 秒；12 × 5 秒；8 × 30 秒；以及 n × 300 秒，其中¹¹C-AcAc 采集时 n = 3，¹⁸F-FDG 采集时 n = 7。

3. 血浆葡萄糖与乙酰乙酸分析

1. 使用临床化学分析仪测定血浆葡萄糖和乙酰乙酸（AcAc）。为尽量减少乙酰乙酸脱羧转化为丙酮，应在采血后48小时内完成检测。葡萄糖浓度使用DF40试剂盒测定，方法如前所述¹⁸；乙酰乙酸则通过开放通道法测定²。此类分析仪比试纸法更准确（精确度达0.1 μM），且检测范围更广。

4. 定量PET分析

1. 使用 PMOD 软件或类似的小动物 PET 图像分析系统。
2. 血浆时间-放射性活度曲线（TAC）
   1. 加载 ¹⁸F-FDG 数据。对注射后前 60 秒的图像帧进行求和（此时示踪剂主要存在于血液中）。
   2. 使用手动绘图工具，在左心室腔血池区域（图像底部中央较大的区域）绘制感兴趣体积（VOI）。将 VOI 绘制在血池边缘内约 1 mm 处（红色体素），以确保不包含组织，并避免组织放射性渗入血池（图 1A）。将该 VOI 复制到整个动态图像序列中，并生成放射性活度随时间变化的曲线（TAC）。
   3. 在电子表格中，利用采集期间采集的两份血浆样本的放射性计数，校正血浆 TAC（图 1B）。使用以下公式：
      
      可对血浆 TAC 进行一定程度的平滑处理。
   4. 验证在 ¹⁸F-FDG 扫描前 30 秒内是否残留有 ¹¹C-AcAc 的放射性，若存在，则从 TAC 后续所有时间帧中减去以下因子：
      ，
      其中 R 为残留放射性，t_1/2 为 ¹¹C 的半衰期（20.4 分钟），T 为时间帧^2,13。在等待 20 分钟后，¹¹C-AcAc 的残留放射性最高可达最大 ¹⁸F-FDG 计数的 1.5%。
3. ¹⁸F-FDG/MRI 图像配准
   1. 将 ¹⁸F-FDG 图像获得的配准结果应用于 ¹¹C-AcAc 图像。这是必要的，因为 ¹¹C-AcAc 图像信噪比较低，难以实现自动配准。
   2. 加载相应的 MRI 数据。以与 MR 图像相同的方向（三个轴向上）加载全部 28 个 ¹⁸F-FDG 时间帧。
   3. 计算 28 个时间帧的 ¹⁸F-FDG 总和图像。该图像具有更高的计数，因此比单个图像帧更便于与 MRI 进行配准。
   4. 对 ¹⁸F-FDG 总和图像与 MR 图像进行自动配准（图 2）。将所得变换应用于所有单个 ¹⁸F-FDG 图像帧，并保存该变换，后续将用于 ¹¹C-AcAc 图像的配准。
4. 感兴趣体积（VOIs）
   1. 使用如 PMOD 等分割软件，选择 MRI 数据并选择合适的平面进行手动绘制。根据脑区大小和图像对比度选择手动或半自动绘图工具。依据标准大鼠脑图谱¹⁹定位脑结构。
   2. 绘制 VOIs。如 图 3 所示，可分割全脑、皮层、海马、纹状体和小脑等区域，也可选择其他区域。保存 VOIs，后续将应用于配准后的 ¹⁸F-FDG 和 ¹¹C-AcAc 图像。
   3. 将 VOIs 应用于配准后的 ¹⁸F-FDG 图像。选择 VOI 统计功能以可视化脑部 TAC。如有需要，通过从后续所有时间帧中减去衰变校正后的前 30 秒平均放射性来校正 TAC。
5. 脑代谢率计算
   1. 加载脑部和相应血浆的 TAC。
   2. 选择 Patlak 图动力学模型^20,21。将加权常数（lumped constant）设为 0.48²²，并输入相应的血浆葡萄糖浓度（图 4B）。将 Patlak 图的最大相对偏差设为 5%。将数据拟合至该模型。
6. ¹¹C-AcAc 图像处理
   1. 计算前 24 个时间帧的 ¹⁸F-FDG 总和图像，使其帧数与 ¹¹C-AcAc 扫描一致，否则 ¹¹C-AcAc/MRI 配准将失败。对 ¹⁸F-FDG 与 MRI 进行自动配准，并保存该变换过程，后续将用于 ¹¹C-AcAc 图像的配准。
   2. 对 ¹¹C-AcAc 图像重复步骤 4.2 和 4.3。在步骤 4.6.1 中使用 ¹⁸F-FDG 的变换，并将其应用于所有单个 ¹¹C-AcAc 图像帧。重复步骤 4.4 和 4.5，并使用已保存的 ¹⁸F-FDG VOIs。将加权常数设为 1。

结果

如图2所示，¹¹C-AcAc在脑组织内的摄取量较低。如前所述，短期禁食时大脑对酮体的消耗非常低。¹¹C-AcAc在舌部和颊肌中的摄取量较高。事实上，酮体可被大鼠骨骼肌迅速摄取²³。相比之下，¹⁸F-FDG的摄取主要集中在脑部和颊肌。图2显示，在图像共配准过程中，MR图像保持固定，而PET图像由于在轴向平面上进行对齐而发生移动。

我们采用Patlak动力学模型^20,21来确定脑部摄取率，该模型此前已被用于¹¹C-酮体和¹⁸F-FDG的动力学建模^9,12,24,25。该模型使用公式1，将测得的PET放射性活度（C_Tissue）除以血浆活度（C_P），并在标准化时间点进行绘图。其中变量Κ代表脑部摄取速率，V代表示踪剂的分布容积。当脑部摄取达到稳态后，曲线呈现为一条直线（<...

讨论

关键步骤

该双示踪剂PET方案中的一个关键步骤是能够同时对心脏左心室和大脑进行成像。这需要具备足够轴向扫描长度的PET扫描仪。 即 至少7.5厘米。需要进行几次测试扫描以确定扫描仪载物台的精确位置（x、y和z） 值），其中对大脑和心脏的扫描是准确的。

示踪剂注射也是成功进行PET采集的关键环节。导管必须正确插入静脉，肝素化生理盐水应顺畅流入静脉，且不发生血液凝固。为了定量测量脑部摄取，准确的血浆时间-活度曲线（TAC）至关重要。在左心室血液区域绘制感兴趣体积（VOI）时，应尽可能减少包含的组织像素。血液样本对于校正从PET图像获得的血浆TAC也极为关键。事实上，如图1B所示，血浆样本中的放射性活度可能与图像衍生输入函数（IDIF）存在差异。这主要是由于在后期时间帧中存在溢入效应（邻近组织辐射对血液信号的污染）²⁶，从而影响IDIF的准确性。脑部MR图像对于区域脑分析必不可少。在完成图像配准后，应逐层检查PET与MR图像的对齐情况，以确保后续的PET区...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磁共振成像仪	Varian		7 特斯拉
小动物正电子发射断层扫描仪	Gamma Medica		Lab-PET/-Triumph
加热垫	Sunbeam	PN 143937
加热系统	SA Instruments	761 100 Rev B
呼吸门控系统	SA Instruments	SAII's P-resp
临床化学分析仪	Siemens Healthcare Diagnosis	765000.931	Dimension Xpand Plus
聚乙烯管 50	Becton Dickinson	427411
注射泵	KD Scientific	Model 210
γ计数器	GMI	Packard Cobra II
离心机	Thermo Scientific	75002416	Heraeus Pico 21
PMOD 软件	PMOD Technologies		PMOD 3.2 版本
盖革计数器	Fluke Biomedical	ASM-990	Advanced Survey Meter
试剂
异氟烷	Abbott Laboratories, Ltd	B506
0.9% NaCl 溶液	Hospira	4888010
肝素	Sandoz	1004336
乙酸异丙烯酯	Aldrich	11778	99%
甲基锂	Aldrich	197343	1.6 M
四氢呋喃（THF）	Aldrich	87371
Flex 试剂盒葡萄糖	Siemens Healthcare Diagnosis	DF40
Trizma 基础缓冲液	Sigma	T6066-500G	配制 100 mM pH 7.0 的 Tris 缓冲液
草氨酸钠	Sigma	O2751	20 mM
NADH	Roche	10128015001	0.15 mM
β-羟基丁酸脱氢酶	Toyobo	HBD-301	1 U/ml