隔离和幼稚的CD4 T细胞的Th17细胞分化

CD4 + T淋巴细胞（T细胞）在与感染性微生物的免疫系统介导的防御中发挥至关重要的作用。相反，T细胞还密切与自身免疫性疾病如1型糖尿病，系统性红斑狼疮，类风湿关节炎的发病和进展相关。 CD4 + T淋巴细胞成为通过T细胞受体（TCR）与同源抗原/主要组织相容性复合体II（MHCII）的分子相互作用的结合活性，并与B7.1/B7.2的CD28受体相互作用的配体^15。除了提供TCR刺激和CD28共刺激的，抗原呈递细胞还提供一种细胞因子环境，这就决定了T淋巴细胞的分化状态，从而指示该T淋巴细胞的反应，给定抗原。不同的病原体/抗原呈递细胞相互作用创造独特的细胞因子环境，这歪斜T淋巴细胞向下聚焦于ELI不同的途径税款发起病原体。不幸的是，T淋巴细胞效应的途径，原本旨在消除入侵的病原体，可错误地针对自身组织^15。因此，更好地了解每个不同的CD4 + T细胞亚群的分化状态的是我们如何来调节消除病原体和宽容自我之间的平衡的理解是至关重要的。

除了TH1，TH2，以及诱导型调节性T细胞的分化途径，幼稚T淋巴细胞还可以通过细​​胞因子向下的Th17通路驱动。而Th1细胞战斗细胞内的病原体，Th2细胞消除细胞外的病原体，调节性T细胞（Treg细胞）减少炎症反应的^1，16; Th17细胞在消除胞外细菌和真菌中发挥重要作用。 Th17细胞是通常用的谱系特异性转录因子RORγT和产生IL的表达-17A，促进巨噬细胞和嗜中性粒^1,7的激活。

Th17细胞有牵连的一些自身免疫性疾病，以及它们相关的啮齿类动物模型。例如，已经证明了IL-23（它是必需的，以维持Th17细胞表型），而不是IL-12，是在中央的罪魁祸首在实验性自身免疫性脑炎（EAE），用于MS的啮齿动物的疾病模型。它随后被显示，减少的IL-17的产生是相关的，以预防EAE ^{2，6，17。}此外，Th17细胞已与其他自身免疫性疾病，包括关节炎和系统性红斑狼疮（SLE）的^10，16相关联。 IL-23缺陷的p19 ^{- / -}小鼠显示出具有非常低的数字Th17细胞，并具有耐显影不仅EAE，而且胶原诱导的关节炎，型号为风湿性关节炎^10，18。此外，小鼠中和IL-17A抗体治疗船尾呃胶原诱导的关节炎的发病中也发现有关节损伤¹⁸号决议。应当指出的是Th17细胞在自身免疫性疾病的进展中的作用仍有待表征为最近的研究还表明Th17细胞在1型糖尿病^9,11和肠道炎症¹⁴的保护作用。这些研究证实Th17细胞分化的自体免疫的重要性。

体外 Th17细胞分化为T细胞研究的一个必要方法，因为有至少两个需要进一步调查令人困惑的问题:1）究竟如何IL-6的调节Treg细胞和Th17细胞分化之间的平衡，以及2）什么是确切机制IL-17诱导的炎性疾病背后？我们的方法使用的CD4 + CD25-T细胞从C57BL / 6小鼠的脾和淋巴结。要注意的是很重要的，虽然有可能使用不纯的诱导Th17细胞分化人群中，获得至少80％纯的CD4 + CD25-T细胞群否定任何污染的忧虑，并确保更成功的Th17细胞分化的结果。为了实现正确的Th17分化，CD4 + CD25-T细胞在抗-CD3和抗-CD28，提供活化信号，1和2分别存在下，与IL-6和TGF-β。虽然已经报道了IL-23单独使用，可用于实现Th17细胞分化，但后来被证明IL-23是必要的Th17细胞的细胞群的稳定性，但IL-6和TGF-β对Th17细胞分化所必需^{3，18，19。}鼠的研究表明，该IL-23受体表达于CD4 + T细胞，他们已经被刺激的IL-6和^{TGF-β13，18}之后。此外，Th17细胞将成功地在IL-23阻断性抗体的存在下培养，只要IL-6和TGF-β的存在^18,19。因此，本Th17的分化方案省IDES在适当的条件下，成功地诱导Th17细胞分化。开发更好的了解相关Th17细胞分化和IL-17的产生提供了机会为更好的治疗目的是自身免疫性疾病¹³发展的机制。

所有动物使用是根据批准的机构动物护理和使用委员会的协议进行的。

1。混音及媒体的制备

1. 无菌PBS pH值:7.3（1升）
   0.23克_磷酸二氢钠
   1.15克的Na ₂ HPO ₄
   9.0克氯化钠
   占用体积去离子水。消毒用高压锅。
2. 细胞培养基（100毫升）
   89毫升RPMI
   10毫升10％FBS的
   1毫升抗生素抗真菌素（ABAM）100微克50-巯基乙醇（3.5微克股票2 - 巯基乙醇为96.5微克PBS）
3. 在无菌PBS 缓冲液FACS（荧光激活细胞分选）（将在流式细胞术中使用）2％FBS
4. iTh17混合 （根据样品数量，确定所需的所有混合和媒体音量）
   1.5微克/毫升抗-CD28
   20纳克/毫升的IL-6
   5毫微克/毫升TGF-β的

2。细胞将一式三份在下列条件下进行电镀

1. 板结合的抗CD3，抗-CD28（这是起动控制的混合）。
2. iTH17:板结合的抗CD3，抗CD28，IL-6，TGF-β。

3。板结合的抗CD3（10微克/毫升）

建议制备板结合的抗CD3板先于细胞将被添加到板的时间进行至少4小时。

1. 加入30微升抗CD3到井（抗-CD3稀释在无菌PBS），一个新的96孔U型底微量测试组织培养板中，挖掘板块的两侧，以确保该井的均匀覆盖。在37℃下4小时，然后冷藏，直到它是时间的混合和细胞添加到板上。

4。小鼠解剖

1. 此协议的基础上，利用C57BL / 6麦克风E，3-8个月的年龄，并从杰克逊实验室（缅因州巴港）购买。
2. 使用CO ₂窒息牺牲的鼠标，并确认死亡，随后颈椎脱位。
3. 消毒小鼠解剖工具和切口面积用70％乙醇，并开始清扫。
4. 从腹面观，抓住皮肤，先于尿道口，并开始用剪刀剪了腹中线，直到达到下巴部位。采取预防措施，避免撕裂或剪切到腹膜壁衬里。
5. 向后拉动皮肤和牵制，使搬迁过程中方便地访问到淋巴结。
6. 收集淋巴结和脾中都将用钳子取出，并放置在含有5ml autoMACS电泳缓冲液自Miltenyi Biotec公司购买的（参见图2和图3为淋巴结和脾切除的图）的无菌培养皿中。
   1. 拧下腋窝淋巴结靠近腋窝（腋下）每只小鼠的胸肌后面找到。
   2. 除去存在于位于每个腋窝附近的结缔组织的肱淋巴结。
   3. 除去在每只小鼠的颈中发现的颈浅淋巴结。
   4. 除去位于髋部地区在3个血管一起腹股沟淋巴结。
   5. 以访问肠系膜淋巴结，通过腹膜衬里向上腹侧中线切开。肠系膜淋巴结中发现保存肠内在一起的结缔组织。他们普遍认为在4-8节点的字符串，可能会显示为"珍珠串"。请务必拔出整个字符串。
   6. 脾脏位于腹部，胃和肠的后面。从胰腺拉动和分离它删除它。
7. 磨下使用2磨砂载玻片无菌罩器官。放置在淋巴结或脾脏1显微镜载玻片，并与第二滑动，直到解体的磨砂边擦的磨砂面。重复，直到所有的淋巴结和脾脏已经接地。

注:建议先从淋巴结和完成具有健脾，因为血液会让人很难看到autoMACs缓冲区中剩余的淋巴结。

9. 要过滤地面器官成单细胞悬液，通过折叠一块40微米的尼龙材料数次，置15ml离心管的顶部开始。尼龙材料应大致3 x 3英寸
10. 用5毫升注射器和21号针头抽吸中的5毫升autoMACs的电泳缓冲液和地下器官。慢慢地分装到折叠的尼龙材料。注意避免刺破材料用针。

注意:一旦单细胞悬液实现，解决方案应该显示为面色苍白，一致的解决方案，没有visib勒个坚实的组织。如果固体残留，再吸入和排出通过一个新的折叠一块尼龙放置在一个新的15ml离心管。

11. 始终保持细胞在冰上在不使用时。

5。细胞分离

1. 为了达到最佳效果，获得至少80％的通过利用MACS CD4 + CD25 +调节性T细胞分离试剂盒，鼠标autoMACS临细胞分离纯的CD4 + CD25-细胞群。通过美天旎生物技术公司获得的协议进行的CD4 + CD25-细胞群的负保持。

6。 Th17细胞分化

1. 分离与autoMACS Pro的细胞分离后收集的CD4 + CD25-细胞群。
2. 计数细胞稀释1:1000的比例用锥虫蓝使用血细胞计数。
3. 一旦浓度已经确定从细胞计数，稀释细胞悬液，以1×10 ⁶个细胞/细胞培养基毫升。
4. 取出96孔板板4小时后绑定的抗CD3。
5. 用200微升PBS洗抗-CD3-包被的孔。重复2次。
   1. 洗加200微升无菌PBS中的抗CD3-包被的孔，并除去PBS到废物容器中。
6. 加入100μliTh17组合或激活控制组合（见点＃2）的井，一式三份。
7. 加入100微升细胞的每个孔中，无论是Th17细胞混合物或激活控制组合已被放置。
8. 孵育细胞至少72小时或5天（Th17细胞可以分化后72小时或5天后获得。）
9. Th17细胞分化可通过细胞内染色和流式细胞术分析，ELISA或定量PCR来评估

7。细胞激活 （仅在细胞内染色）

1. 从培养箱取出96孔板，无论是72小时或5天结束
   1. 回想一下，Th17细胞differentiation可以后，无论是72小时或5天来实现。
2. 每个条件（ 例如起动控制或iTh17），转移细胞，一式三份在24孔细胞培养板的一个孔中。细胞的一个条件现在已汇集成24孔培养板的一个孔，而不是作为一式三份于96孔U型底培养板。
3. 的每个孔中的24孔细胞培养板的总体积是现在600微升。提高每一个的体积以及到1ml的细胞培养基。
4. 加入PMA（佛波酯）（50毫微克/毫升），离子霉素（1微米），BFA（布雷菲尔德菌素-A）（10微克/毫升），每孔在24孔细胞培养板在上市的浓度。
5. 在37℃保温4小时。

8。细胞内染色

1. 染色的细胞具有所需胞外和胞内标记物的流式细胞术分析。为了检测存在øf IL-17，细胞内染色，是用抗-IL-17A抗体。推荐外表面标志物包括CD4，CD8和CD25。
   1. 使用内细胞因子染色入门套件 - 鼠标自BD Bioscience公司的IL-17的细胞内染色。
   2. 对于每个样品，沉淀细胞，除去上清液，并在200μlFACS缓冲液（2％FBS的PBS）中重悬细胞沉淀。
   3. 转移重悬细胞至96孔细胞流式细胞仪检测板。
   4. 自旋向下的细胞为5分钟1200转，弃上清。
   5. 加入200μl的PBS缓冲液流式细胞仪，离心5分钟1200转，弃上清。
   6. 重悬细胞于100μlFACS缓冲液，并应用100微升细胞外抗体（抗体）的混合物（细胞外抗体的混合物是在FACS缓冲液）。孵育15分钟，在室温下，用铝箔纸覆盖。
   7. 重复步骤8.1.4。
   8. 重复步骤8.1.5 2倍。
   9. 重悬在100μlBD Cytofix / Cytoperm缓冲的细胞。 Incub吃了20分钟在室温下，用铝箔纸覆盖。
   10. 加入100μl的1×BD烫发/洗涤缓冲液，离心5分钟1200转，弃上清。重复。
   11. 加入50微升的细胞内抗体的混合物。 （细胞内抗体的混合物是在1X BD彼尔姆/冲）孵育15分钟在室温下，用铝箔纸覆盖。
   12. 重复步骤8.1.10。
   13. 重悬在200μlBD染色缓冲液中的细胞。
   14. 将重悬细胞成流式细胞含200微升BD染色缓冲液（终体积为400微升）管。
   15. 储存于4°C，直到样品准备好被读取。

9。流式细胞仪分析

1. 门活细胞群。
2. 从活细胞群，对CD4 + CD8人口大门。
3. 从CD4 + CD8-的人口，对IL-17A +人口的大门。
   1. 根据我们以前的实验结果，白细胞介素-17A +人口的100％将是CD25 +。

*总绝对细胞计数池的样品一式三份后得到
* CD4 + CD25 + IL-17A +细胞的绝对数量通过由活门百分比和总细胞轴承谱系特异性标志物CD4，CD25和IL-17A的百分比，细胞的总数乘以所确定通过流式细胞仪检测。

10。定量PCR和ELISA法

1. 不用于流式细胞术分析细胞的地方在1.5ml Eppendorf管中，离心分离机以13,000 rpm离心5-10分钟。在离心后的细胞沉淀物中发现的细胞，将用于定量PCR分析。使用PTC-200珀尔帖热循环仪（Biorad公司）进行定量PCR分析。
2. 从离心管的ELISA收集上清液。 IL-17A ELISA试剂盒采用双抗体TC11-18H10（捕获，目录号555068）进行，TC11-8H4生物素（检测，目录号555067）购自BD公司。 IL-17A ELISA站ndards购自eBioscience公司（目录号14-8171-80）获得。
3. 除去上清液后，重悬，以用于定量PCR在175微升的RNA裂解缓冲液（立即用于RNA提取，cDNA合成，并定量PCR，或储存于-80℃以备后用）的剩余细胞。
   1. 参照表II为对IL-17A和肌动蛋白（持家基因）的引物序列

这Th17细胞分化的协议始于切除脾脏及腋窝，上臂，肠系膜，颈和腹股沟淋巴结肿大。每个位置的表示可以在图2和图3中找到。图1和5都提供在本协议中所述的方法的可视化表示。

此协议的Th17着重从CD4 + CD25-T淋巴细胞种群分化。要注意的是如何有效的autoMACS临细胞分离富集从总汇集淋巴结和脾（ 图4）我们所期望的CD4 + CD25-群体是重要的。未分级分离，汇集淋巴结和脾细胞，并在autoMACS分离的馏分进行染色antiCD4和antiCD25抗体随后通过流式细胞术分析（ 图4）。图4A示出的CD4 + CD25 +的百分比代表更新和CD4 + CD25-细胞中存在的未分级的，汇集淋巴结和脾脏通过流式细胞术。分离过程还提供了一个富集CD4 + CD25 +调节性T细胞群体从它可以在另外的实验中（ 图4B）被使用C57BL / 6小鼠。 图4C示出了期望的细胞的富集，人口即84％的CD4 + CD25 - T细胞，与CD4 + CD25 +调节性T细胞的绝大多数删除。我们始终有一个小的非淋巴样细胞群体存在于富集的CD4 + CD25-，但它不与分化过程（ 图4C）干扰。我们丰富的CD4 + CD25-T细胞群体，有助于确保一个更成功的Th17细胞分化。

图5示出了Th17细胞分化过程的示意图。我们的富集的CD4 + CD25-群体要么是Th17细胞分化的条件下培养（抗CD3，抗CD28，IL-6，TGF-β）或对照（抗CD3，抗-CD28）。它可以在图6中可以看出，而CD4 + CD25-T细胞用抗-CD3，抗-CD28，连续5天，得到CD25 + T淋巴细胞，Th17细胞诱导条件下培养的温育产生的IL17产生的CD4 + CD25 +淋巴细胞的子集。请后iTh17条件下保持5天的潜伏期参考表1的CD4 + CD25 + IL-17A的例子+细胞的绝对数量产量。

Th17细胞分化状态可以进一步通过荧光定量PCR和ELISA法进行评估。 图7显示了从控制或Th17细胞诱导条件下培养富集的CD4 + CD25-T淋巴细胞数据。 Th17细胞条件下培养的CD4 + CD25-T细胞上调IL17A，这可以通过定量PCR（ 图7A）和酶联免疫吸附（ 图7B）来确定。在Th17细胞特异性转录因子RORγT也上调由CD4 + CD25-T细胞Th17细胞诱导条件下培养，并且可以THR来确定ough定量PCR（ 图7A）。

图1。 Th17细胞分化的原理图。 1，外套U形底96孔板用抗CD3（10微克/毫升）稀释在PBS的孔中。2。板放置在培养箱中培养4小时，在37°C。虽然板孵化，解剖淋巴结（LN）和脾的鼠标。磨器官和过滤，得到单细胞悬浮液。使用CD4 + CD25 +调节性T细胞分离试剂盒及美天旎autoMACS临分离器分离出的CD4 + CD25-T细胞。 CD4 + CD25-细胞，应稀释至1×10 6细胞/ ml。3，一旦 96孔板的4小时培养结束后，用PBS（200μl/孔）3×4，洗井。加入100微升的CD4 + CD25 - T细胞与板结合（PB）的抗-CD3涂覆的孔中。5。加入100μl抗-CD28或100微升iTh17 COC在37℃下ktail（antiCD28，TGF-β和IL-6）。6。孵育板为3或5天孵育后通过细胞内染色，定量PCR和/或ELISA评估分化。

图2。 LN解剖指南。 A）1肱淋巴结可以在位于鼠标。 乙各腋窝（腋下）附近结缔组织），发现1腋窝淋巴结可以在每个腋下发现，胸肌。C）肠系膜淋巴结位于后面肠子的结缔组织。他们像一串珍珠项链D）4颈浅淋巴结被发现在鼠标的脖子E）2腹股沟淋巴结肿大（前后各1个），可位于臀部区域在哪里3血管相交的位置。

。内页="总是">
图3。脾切除引导 。小鼠脾脏被发现在胃和肠道后面身体的左侧。简单地拉动和镊子分离去除。

图4。之前和autoMACS临分离A）LN和脾细胞后从汇集LN细胞部分和脾细胞进行染色， 离体，以建立基线细胞群分离前。以下分离，CD4 + CD25 +（B）和CD4 + CD25-（C）组分进行染色分别评估CD4 + CD25 +和CD4 + CD25-T细胞群体的纯度。所有样品均用CD4 +和CD25 +抗体和流式细胞仪分析。

图6。 Th17分化，评估通过流式细胞仪 。 CD4 + CD25-T细胞接种于培养板结合的抗CD3的存在下，抗-CD28，IL-6和TGF-β（iTh17）或板结合的抗CD3和抗CD28单独（对照）为5天。然后将细胞用PMA和伊屋诺霉素，在37℃下活化4小时以下的活化，细胞用抗CD4，抗CD8，抗CD25和抗-IL-17A抗体的流式细胞术分析来评估Th17细胞的分化。 iTh17 = Th17细胞诱导çonditions。

图7。 Th17分化，从C57BL / 6小鼠进行评估通过qPCR和ELISA法。淋巴细胞进行分类的CD4 + CD25 - T细胞中孵育的板结合的抗CD3（10微克/毫升），抗CD28（1.5微克/毫升的存在），IL-6（20纳克/毫升），和转化生长因子-β（5毫微克/毫升）或板结合的抗CD3和抗CD28单独（对 ​​照）5天。 甲）然后将细胞收获，以评估RORγT并通过定量PCR:B IL-17A消息表达式）收集上清液，用ELISA法确定IL-17A蛋白的表达。

没有披露声明。