初始CD4 T淋巴细胞的分离与Th17分化

摘要

Th17细胞的效应功能与其他T细胞亚群不同，其在炎症性自身免疫疾病中具有核心作用。本体外Th17细胞分化方案提供了一种方法，用于确定初始CD4+ T淋巴细胞是否可分化为Th17细胞，并进一步研究其在自身免疫和宿主应答中的作用。

摘要

Th17 细胞是一类独特的 T 细胞亚群，能够产生白细胞介素 17（IL-17），其功能不同于其他 T 细胞亚群，如 Th1、Th2 和调节性 T 细胞。Th17 细胞已被证实是多种自身免疫性疾病中过度炎症免疫反应的核心致病因素。本方法中，我们从小鼠 C57BL/6 的脾脏和淋巴结中纯化 T 淋巴细胞，并在对照环境和 Th17 诱导环境下刺激纯化的 CD4+ T 细胞。Th17 诱导环境包括在抗 CD3 和抗 CD28 抗体、IL-6 以及 TGF-β 存在下进行刺激。在 37 °C 下孵育至少 72 小时，最长可达五天后，通过流式细胞术、qPCR 和 ELISA 检测细胞产生 IL-17 的能力。所获得的 Th17 分化 CD4+CD25- T 细胞可用于进一步阐明 Th17 细胞在自身免疫疾病发生与发展以及宿主防御中的作用。此外，利用不同基因敲除小鼠或疾病模型来源的 CD4+CD25- 淋巴细胞进行 Th17 分化研究，有助于加深我们对细胞命运可塑性的理解。

引言

CD4+ T 淋巴细胞（T 细胞）在免疫系统介导的抗感染微生物防御中发挥关键作用。相反，T 细胞也与 1 型糖尿病、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发病和进展密切相关。CD4+ T 淋巴细胞的活化依赖于 T 细胞受体（TCR）与同源抗原/主要组织相容性复合物 II 类（MHCII）分子的相互作用，以及 CD28 受体与 B7.1/B7.2 配体的相互作用¹⁵。除了 TCR 刺激和 CD28 共刺激外，抗原呈递细胞还提供一种细胞因子环境，该环境决定 T 淋巴细胞的分化状态，从而引导 T 淋巴细胞对特定抗原的应答。不同的病原体/抗原呈递细胞相互作用产生不同的细胞因子环境，使 T 淋巴细胞偏向不同的分化通路，以清除初始病原体。然而，T 淋巴细胞效应通路原本用于清除入侵病原体，却可能被错误地导向自身组织¹⁵。因此，深入理解每种特定 CD4+ T 细胞亚群的分化状态，对于阐明如何调节清除病原体与自身耐受之间的平衡至关重要。

除了 Th1、Th2 和可诱导的调节性 T 细胞分化途径外，初始 T 淋巴细胞还可由细胞因子驱动进入 Th17 分化途径。Th1 细胞可对抗胞内病原体，Th2 细胞清除胞外病原体，调节性 T 细胞（Tregs）则抑制炎症反应^{1, 16}；而 Th17 细胞在清除胞外细菌和真菌方面发挥重要作用。Th17 细胞通常以表达谱系特异性转录因子 RORγT 以及产生 IL-17A 为特征，后者可促....

方案

所有动物使用均按照机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

1. 混合液与培养基的制备

1. 无菌 PBS，pH：7.3（1 L）
   0.23 g NaH₂PO₄
   1.15 g Na₂HPO₄
   9.0 g NaCl
   用去离子水定容。高压灭菌处理。
2. 细胞培养基（100 ml）
   89 ml RPMI
   10 ml 10% FBS
   1 ml 抗生素-抗真菌素（ABAM）100 μg 50 mM 2-巯基乙醇（将 3.5 μg 储存液 2-巯基乙醇加入 96.5 μg PBS 中）
3. FACS 缓冲液（荧光激活细胞分选）（流式细胞术中使用）含 2% FBS 的无菌 PBS
4. iTh17 混合液（根据样本数量确定所有混合液及培养基所需体积）
   1.5 μg/ml 抗-CD28
   20 ng/ml IL-6
   5 ng/ml TGF-β

2. 细胞将在以....

结果

该 Th17 分化实验方案首先摘除脾脏以及腋窝、臂部、肠系膜、颈部和腹股沟淋巴结。各淋巴结位置示意图见于 图2 和 3. 图1 和 5 均提供了本实验方案中所述方法的可视化展示。

该 Th17 细胞分化方案专注于从 CD4+CD25- T 淋巴细胞群体中进行诱导分化。值得注意的是，autoMACS Pro 细胞分选系统能够高效地从合并的淋巴结和脾脏组织中富集我们目标的 CD4+CD25- 细胞群体（图4）。未分选的合并淋巴结与脾细胞，以及经 autoMACS 分选后的各组分均使用抗CD4和抗CD25抗体染色，并进行流式细胞术分析（图4）。图4A 展示了通过流式细胞术检测未分选合并淋巴结和脾脏中 CD4+CD25+ 与 CD4+CD25- 淋巴细胞百分比的代表性图谱。该分离方法还可从 C57BL/6 小鼠中获得富集的 CD4+CD25+ 调节性T细胞（Treg）群体，可用于其他实.......

讨论

在此，我们描述了实现该目标的实验方案 体外 Th17分化。研究Th17分化具有重要意义，因为T淋巴细胞向Th17亚群的分化对于有效清除人类病原体至关重要。¹³相反，IL17的产生与自身免疫性疾病的发展进程相关¹³Th17细胞分化方法适用于多种研究场景，因其可应用于众多不同的小鼠免疫调节与自身免疫疾病模型。该方法有助于解答关于T淋巴细胞分化为Th17细胞的能力问题，本实验方案中以IL-17A的产生及转录因子RORγT的表达作为Th17细胞分化的标志。此外，已有研究证实，Th17细胞还可通过产生IL-17F、IL-22和GM-CSF进行鉴定。 ^{8, 12}该方案相较于其他已知的T淋巴细胞分化方案（如Th1或Th2分化）具有重要意义，因其可用于补充这些方案，从而更深入地理解T淋巴细胞效应功能与免疫系统运作之间的关系。

进行这些实验时，有几个关键步骤需要考虑。Th17 细胞的分化可以通过纯度不高的 CD4+CD25- 细胞群体实现，但为了获得最有效且可靠的结果，建议 CD4+CD25- 细胞群体的纯度至少达到.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂/材料
无菌聚酯培养皿	Fisher Scientific	0875713A	60 mm × 15 mm
autoMACS 运行缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-221
优质显微镜载玻片，磨砂面	Fisher Scientific	12-544-3	3" × 1"1 mm
5 ml 21G1 无乳胶注射器及针头	BD生物科学	309632
Corning 15 ml 离心管	Sigma-Aldrich	CLS430791
尼龙 40 微米	迈阿密水产养殖	尼龙 40/26
96孔U型底微量组织培养板	BD生物科学	35-3077
康宁科斯特24孔细胞培养板	Sigma-Aldrich	CL3524
Eppendorf管 1.5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
纯化的NA/LE仓鼠抗小鼠CD3e	BD 生物科学	553057
纯化的NA/LE仓鼠抗小鼠CD28	BD 生物科学	553294
小鼠 IL-6 重组蛋白	eBioscience	14-8061-62
TGFβ	R&D Systems	240-B-002
0.4% 台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	66H2364
Pac Blue 大鼠抗小鼠 CD4	BD生物科学	558107
APC 标记的抗小鼠 CD8a 大鼠抗体	BD 生物科学	553035
PE标记的抗小鼠CD25抗体	eBioscience	E01155-516
Alexa Fluor 700 大鼠抗小鼠 IL-17	BD 生物科学	560820
小鼠细胞内细胞因子染色初学者试剂盒	BD Biosciences	51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ 调节性T细胞分离试剂盒，小鼠	Miltenyi Biotec	130-091-221
ABAM	Cellgro	30-004-CI
RPMI	康宁，赛尔格罗	10-040-CM
B 2-巯基乙醇–乙醇	MP Biomedical	194834	有害的
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）
钙离子霉素（Ionomycin Calcium Salt）	Sigma-Aldrich	13909-1ML	危险的
布雷菲德菌素A（BFA）	MP Biomedicals	159027
ELISA IL-17A 捕获单抗	BD 生物科学	555068
ELISA IL-17A 检测单克隆抗体	BD 生物科学	555067
ELISA IL-17A 标准品	eBioscience	14-8171-80
IL-2 ELISA 试剂盒	BD 生物科学	555148
TMB 底物试剂盒	BD 生物科学	555214
<强>仪器设备
autoMACS Pro 细胞分离仪	Miltenyi Biotec	130-092-545
Sorvall Legend RT+ 离心机	赛默飞世尔科技
Napco 系列 8000 WJ CO2 培养箱	赛默飞世尔科技
PTC-200 帕尔帖热循环仪	伯乐（Bio-Rad）