传统的可溶性I型胶原蛋白（COL1）分离方法从开始到结束需要约10天时间，原因在于缓冲液孵育时间较长，且纤维的重悬过程繁琐耗时。本文中，我们描述了一种从小块皮肤活检组织中纯化COL1的方法，耗时不足3小时。
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摘要
摘要
可溶性I型胶原蛋白（COL1）被广泛用作细胞培养的黏附基质以及再生医学应用中的细胞支架。临床上，该蛋白常用于整形手术、皮肤注射、骨移植和重建手术。目前这些应用中所用的COL1通常来源于非人类动物，这增加了炎症反应、免疫排斥以及异源病原体传播的风险。因此，若能建立一种可从少量自体组织中高效快速纯化COL1的方法，将有望克服上述诸多问题；然而，传统的分离纯化方案耗时较长，且通常需要大量胶原组织。本文展示了一种高效的COL1提取方法，可将蛋白的分离与纯化时间从约10天缩短至3小时以内。我们选择真皮组织作为原料来源，因其在多种外科手术中均可获得。该方法结合传统提取缓冲液、剧烈震荡及离心过滤技术，从小量真皮组织中获得高纯度的可溶性COL1。简言之，皮肤活检组织首先在冰冻的dH₂O中充分清洗2去除脂肪、结缔组织和毛发后，使用 0.5 M 醋酸钠溶液和高速台式匀浆器去除皮肤样本中的非胶原蛋白和多糖。随后用 0.075 M 枸橼酸钠缓冲液通过匀浆器从残留固体中提取胶原蛋白。这些提取物使用 100,000 分子量截留的离心过滤器进行纯化，所得 I 型胶原（COL1）制备物的质量可媲美或优于商业产品或传统方法获得的产物。我们预计该方法将促进自体来源 COL1 在多种科研与临床应用中的使用。
引言
几十年来，研究人员和商业供应商一直采用某种形式的简单酸提取法，从皮肤和肌腱等多种组织来源中分离出可溶性的 COL1，随后进行中和，从而重新悬浮形成有序的 COL1 纤维网络，可用于多种生物医学应用1-4。 尽管 COL1 在临床上有诸多应用实例，但其中很少使用自体来源的 COL1，因为该蛋白的制备需要耗时数天甚至数周的提取过程5-7。因此，科研人员和临床医生通常依赖价格昂贵的商业化 COL1 制品，这些制品来源于非人类组织，如大鼠、牛或猪的真皮，或来自尸体或男性包皮环切术中切除的皮肤。在再生医学应用中，这些产品在形成能够支持细胞黏附和生长的固体基质或组织结构方面表现出较大的批次间差异。因此，迫切需要一种新的标准化方法，能够快速从易获取且来源丰富的自体组织中提取 COL1。
这种方法可在研究环境中节省时间和成本，即从感兴趣的动物模型中提取I型胶原蛋白（COL1），并用于基于胶原支架构建的工程化组织的临床前测试。同时，在临床应用中若能快速分离出自体来源的COL1，将提高患者的整体安全性，避免使用同种异体或异种来源的胶原制剂。对于接受自体胶原制剂的患者，该简化方法将显著缩短从活检取样到胶原应用之间的时间间隔。基于上述原因，我们致力于改进一种长期建立的COL1分离与纯化方法，采用高速振荡结合尺寸排阻离心技术。该方法操作简便，仅需使用许多实验室常见的标准缓冲液和设备即可完成。通过采用高速振荡，本方案将可溶性皮肤来源COL1的分离时间从约10天缩短至3小时以内8。 重要的是，该方法可在临床环境中便捷实施，从而在单次手术过程中完成自体来源COL1的制备并用于患者治疗。
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方案
本实验将演示从羔羊皮肤中分离 COL1 的过程。 按照本方案，同样可成功从兔和人皮肤中分离 COL1。
1. 准备皮肤样本
- 使用前将所有试剂平衡至 4 °C。
- 用预冷的去离子水（dH2O）冲洗皮肤样本（25–50 g），并用脱毛膏去除任何羊毛、毛发或绒毛。
- 使用单刃剃须刀片刮除样本上的结缔组织和脂肪，使其清洁干净。
- 用预冷的去离子水（dH2O）再次冲洗样本。
- 使用单刃剃须刀片将皮肤样本切成 1 cm × 1 cm 的小片。
2. 去除非胶原性可溶化物质
- 称取5 g样品放入50 ml锥形管中，加入30 ml预冷的0.5 M醋酸钠溶液。
- 使用台式均质器配备的50 ml管适配器，在6 m/sec 条件下混匀管内样品1分钟。
- 弃去上清液，并重复此步骤，共完成7次醋酸钠洗涤循环。
- 用预冷的去离子水（dH2O）冲洗样品，并混匀一次以去除残留的醋酸钠。
- 用刮勺将样品紧压在管壁上以去除多余液体，然后转移至新的50 ml锥形管中。
3. I型胶原蛋白提取
- 在台式匀浆器中，以每克样品加入2 ml 0.075 M柠檬酸钠缓冲液，以6 m/sec的速度清洗样品两次，每次1分钟，每次清洗后压缩样品并弃去上清液。
- 向样品中加入新鲜的每克2 ml 0.075 M柠檬酸钠缓冲液。
- 在不更换缓冲液的情况下，连续进行6次台式匀浆器混合循环，每次1分钟，速度为6 m/sec。
- 将浓稠且澄清的上清液转移至收集管中。
- 向样品中额外加入每克1 ml 0.075 M柠檬酸钠缓冲液，并进行最后一次台式匀浆器振荡循环。
- 将此次得到的上清液加入收集管中。
- 在4 °C条件下，以3,200 x g离心10分钟 。
- 将上清液转移至分子量截留为100,000的离心过滤装置的上层室中。
- 在4 °C条件下，以3,200 x g离心30分钟 。
- 将纯化后的COL1从上层室转移至洁净的锥形管中，并在4 °C下保存。
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结果
该COL1分离方案总共需要约2小时15分钟完成。图1展示了本实验主要步骤的示意图。样品准备以及使用醋酸钠进行7次高速振荡和洗涤，耗时约35分钟(图1A-C)。使用dH2O进行一次振荡和洗涤循环，耗时约5分钟(图1D和1E)。加入柠檬酸钠后，进行一次振荡和洗涤循环，随后进行6次振荡循环，耗时约45分钟(图1F和1G)。将液体提取物中的剩余固体进行离心，耗时15分钟(图1H)。最后，将样品转移至滤膜装置，并进行另一次离心以浓缩纯化且已溶解的COL1并去除小分子蛋白，耗时30分钟(图1I和1J)。最终产物为高浓度、高纯度的可溶性COL1，可通过添加Na2HCO3并在37°C下孵育进一步聚合。该固相化产物的相差显微镜图像显示了COL1纤维结构，可用于细胞在组织培养板上的贴附，或作为三维组织工程应用的支架材料
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讨论
该方法的一个关键步骤是对真皮样本进行反复高效地挤压，以去除多余的液体。在步骤2.5中，必须通过挤压样本尽可能去除醋酸钠。我们使用刮勺将皮肤紧压在离心管壁上；不过，也可使用纱布进行挤压，但这样需将样本从管中取出，从而增加操作时间。同样，在步骤3.1中挤压样本也至关重要，以确保后续提取步骤中柠檬酸钠的体积准确。若在上述任一步骤中未能充分去除样本中的液体，将对最终I型胶原蛋白（COL1）的得率产生不利影响。本实验方案的另一个关键点是所有试剂均需保持在4 °C。这有助于高效提取酸溶性COL1，并防止胶原蛋白凝固。 此外，该操作也可在无菌环境下使用全部无菌试剂完成。 对于希望将本方法所提取的COL1用于人体的研究者而言，这一点尤为重要。 许多商业来源的COL1通过γ射线辐照实现了有效灭菌。 然而，这种处理方式会导致蛋白质断裂和变性，显著降低其形成凝胶的能力9,10。
本方案代表了根据大量实验所确定的胶原蛋白1型（COL1）提取的最佳条件，这些实验旨在建立皮肤样本与缓冲液体积之间的理想比例。当研究者希望将本方案用于更大尺寸的...
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披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院研究基金（HL068915，授予 DBC）、Thrasher 研究基金新研究者奖（授予 CAP）、美国心脏协会资助援助项目（12GRNT11910008，授予 DBC）、儿童心脏基金会研究基金（授予 DBC）、波士顿儿童医院心脏传导基金的捐赠、Ryan 家族基金以及 David Pullman 的捐赠支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FastPrep-24 系统 | MP Biomedicals | 116004500 | |
| 离心机 | Beckman | J6-MI | 配备可容纳 50 ml 离心管的摆桶转子，离心力为 3,200 × g。 |
参考文献
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重印与许可
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