En forbedret fremgangsmåte for fremstillingen av type I kollagen fra hud

Summary

Tradisjonelle prosedyrer for isolering av løselig type 1 kollagen (kol1) krever omtrent 10 dager fra start til slutt på grunn av lange buffer inkubasjoner og arbeidskrevende resuspensions av fibriller. Her beskriver vi et middel for å rense kol1 fra små dermal biopsier på mindre enn tre timer.

Abstract

Løselig type 1 kollagen (kol1) er mye brukt som et lim substrat for cellekulturer og som en mobil stillas for regenerativ applikasjoner. Klinisk, er dette proteinet mye brukt for kosmetisk kirurgi, dermal injeksjoner, bein pode, og rekonstruktiv kirurgi. Kildene til Kol1 for disse fremgangsmåter er vanligvis ikke-humant, noe som øker potensialet for betennelse eller avvisning samt xenobiotic sykdomsoverføring. I lys av dette, ville en fremgangsmåte til effektivt og raskt å rense Kol1 av begrensede mengder av autologously-avledet vev omgå mange av disse problemene, men vanlige isoleringsmetoder er omstendelige og krever ofte store mengder av collagenous vev. Her viser vi en effektiv col1 ekstraksjon metode som reduserer tiden som er nødvendig for å isolere og rense dette protein fra omtrent 10 dager til mindre enn 3 timer. Vi valgte dermis som vår vev kilde på grunn av sin tilgjengelighet under mange kirurgiske prosedyrer. Thans metode bruker tradisjonelle ekstraksjons buffere kombinert med kraftig omrøring og sentrifugal filtrering til å gi svært ren, oppløselig Kol1 fra små mengder av corium. Kort fortalt er dermal biopsier vaskes grundig i iskaldt dH ₂ O etter å fjerne fett, bindevev, og hår. Hudprøvene blir strippet for noncollagenous proteiner og polysakkarider ved bruk av 0,5 M natrium-acetat, og en høyhastighets benk-topp-homogenisator. Kollagen fra gjenværende faste stoffer ble deretter ekstrahert med en 0,075 M natrium-citrat-buffer ved hjelp av homogenisator. Disse ekstraktene er renset ved hjelp av 100 000 MW cut-off sentrifugale filtre som gir kol1 preparater av sammenlignbare eller overlegen kvalitet til kommersielle produkter eller de som ble oppnådd ved hjelp av tradisjonelle prosedyrer. Vi forventer denne metoden vil forenkle utnyttelsen av autologously-avledet kol1 for et mangfold av forskning og kliniske applikasjoner.

Introduction

I flere tiår har forskere og kommersielle leverandører isolert solubilisert Kol1 fra et utvalg av vevs-kilder, inkludert hud-og sene ved hjelp av en variant av en enkel syre ekstraksjon protokoll etterfulgt av nøytralisering, hvilket resulterer i en resuspensjon av en matriks av organiserte Kol1 fibriller som kan benyttes for en rekke biomedisinske applikasjoner ^1-4. Mens det er mange eksempler på kliniske applikasjoner for kol1, noen av disse benytter autologously-avledet kol1 fordi utarbeidelsen av dette proteinet krever lange utdrag tar dager eller uker å utføre ^5-7. Som et resultat av forsknings-forskere og leger generelt bruke dyre, kommersielle preparater av Kol1 som er fremstilt ved hjelp av ikke-humane vev som rotte, bovint eller porcint corium eller ved hjelp av huden fjernet fra kadavre eller etter male omskjæring. For regenerative applikasjoner, mange av disse produkter utstillings variabilitet med hensyn til deres evne til å danne et fastmatriser eller vev-konstruksjoner som er i stand til å støtte cellefesting og vekst. Det er derfor et klart behov for en ny standardisert metode utviklet for å raskt trekke kol1 fra tilgjengelige og rikelig autologe vevskilder.

En slik metode vil spare både tid og penger i forskning setting der kol1 kunne hentes ut fra dyremodell av renter og benyttes for preklinisk testing av konstruerte vev montert på kollagen-baserte stillaser. På samme tid, vil ha mulighet for å bruke en hurtig-isolert, autologously-avledet col1 i klinikken øke den totale sikkerhet for pasientene som ellers ville motta allogeneiske eller xenogeneiske preparater. For pasienter som får en autogent forberedelser, ville dette strømlinjeformet metode sterkt redusere intervallet mellom biopsi innsamling og kollagen søknad. For disse grunner, forsøkte vi å forbedre et veletablert kol1 isolering og rensing metoden ved hjelp av høyhastighets agutfelling og størrelsesutelukkelses-sentrifugering. Denne metoden er enkel å utføre ved anvendelse av standardbuffere og utstyr som finnes i mange laboratorier. Ved å ansette høyhastighets agitasjon, reduserer vår protokoll nødvendig tid til å isolere løselig, dermal kol1 fra ca 10 dager til mindre enn tre timers ^åtte. Viktigere, kan denne metoden være lett utføres i klinisk setting for å forberede autologously-avledet kol1 for bruk hos pasienter under et enkelt sett med prosedyrer.

Protocol

Her vil vi demonstrere isolering av kol1 fra lammeskinn. Som skrevet, kan denne protokollen også bli brukt for å kunne isolere kol1 fra kanin og menneskelig hud.

En. Forbered Dermal Sample

1. Stabil alle reagenser til 4 ° C før bruk.
2. Skyll dermal prøve (25-50 g) i iskaldt dH ₂ O og fjerne ull, pels, eller hår med hårfjerningskrem.
3. Bruk en single-edge barberblad til å skrape prøven ren av bindevev og fett.
4. Skyll prøven i iskaldt dH ₂ O.
5. Skjær huden prøven inn 1 cm x 1 cm stykker med en enkelt kant barberblad.

2. Fjern Noncollagenous oppløseliggjøres Material

1. Vei opp 5 g prøve per 50 ml konisk rør og tilsett 30 ml iskald 0,5 M natriumacetat.
2. Bland rør i 1 min på 6 m / sek innstillingen med en 50 ml tube adapter i benken-top homogenisator.
3. Kast supernatant og gjenta for totalt syv natriumacetat vaskesykluser.
4. Skyll prøven i iskaldt dH ₂ O og bland gang for å fjerne gjenværende natriumacetat.
5. Bruk av en spatel for å komprimere prøven mot siden av røret for å fjerne overskytende væske og deretter overføres til en frisk 50 ml konisk rør.

Tre. Type I kollagen Extraction

1. Vask prøven to ganger i 2 ml / g 0,075 M natrium-citrat-buffer i 1 min ved 6 m / sek i benk-topp homogenisator komprimere prøven og kassering av supernatanten etter hver vask.
2. Til en frisk 2 ml / g alikvot av 0,075 M natrium-citrat-buffer til prøven.
3. Utfør seks sekvensiell en min, 6 m / sek benk-top homogenisator mix sykluser av agitasjon uten å fjerne buffer mellom hver syklus.
4. Overfør den tykke, klare supernatant til en oppsamlingsrøret.
5. Legg til en ekstra 1 ml / g 0.075 M natriumsitrarbuffer til prøven og utføre en siste benk-top homogenisator agitasyklusen.
6. Til denne endelige supernatant til en oppsamlingsrøret.
7. Sentrifuger oppsamlingsrøret ved 3200 xg i 10 min ved 4 ° C.
8. Overfør supernatanten til det øverste rommet fra et 100 000 molekylvekt cut off sentrifugalfilter enhet.
9. Sentrifuger ved 3200 x g i 30 min ved 4 ° C.
10. Overfør det rensede Kol1 fra det øvre kammer til et rent konisk rør og oppbevares ved 4 ° C.

Representative Results

Dette kol1 isolasjon protokollen krever ca 2 timer og 15 minutter å fullføre. Figur 1 viser et skjematisk diagram som beskriver de viktigste trinn i denne fremgangsmåten. Klargjøring av prøven og utføre de syv sykluser av høyhastighets agitations og skyller med natriumacetat tar ca 35 min (figur 1A-C). Utføre en agitasjon og skyll syklus med dH ₂ O tar ca 5 min (Tall 1D og 1E). Legge natriumcitrat og å underkaste prøven en agitering og skyllesyklusen, etterfulgt av 6 sykluser av omrøring tar omtrent 45 min (figurene 1F og 1G). Sentrifugering av gjenværende faste stoffer fra den flytende ekstrakt tar 15 minutter (figur 1 H). Til slutt overfører prøven til en filterenhet, og utfører en annen sentrifugeringstrinn for å konsentrere det rensede, solubilisert col1 og fjerne små proteinertar 30 min (Tall 1I og 1J). Det endelige produkt er en konsentrert, sterkt-ren fremstilling av oppløselig Kol1 som kan bli ytterligere polymeriseres ved tilsetning av Na ₂ HCO ₃ og inkubering ved 37 ° C. Fasekontrast mikroskopi-bilder av dette størknet produktet avslører Kol1 fibriller som kan tjene som et substrat for cellebinding til vevskulturplater eller brukes som et stillas for 3-D tissue tekniske anvendelser (figurene 2A og 2B).

Figur 1. Skjematisk oversikt over den forbedrede kol1 isolasjonsmetoden. A) i skiver dermis blir satt til en 50 ml konisk rør. B) 0,5 M natriumacetat tilsettes til prøven. C) Denprøven blir utsatt for syv sykluser med agitasjon med natriumacetatbuffer erstattes etter hver syklus. D) dH ₂ O blir tilsatt til huden prøven. E) Fremstillingen blir utsatt for en syklus med omrøring og dH ₂ O helles av. F) 0,075 M natrium-citrat tilsatt til prøven. G) Prøven blir utsatt for seks sykluser med omrøring. H) Prøven blir sentrifugert for å fjerne store partikler. I) Supernatanten overføres til en 100000 molekylvekt cut off sentrifugal filterenhet i et konisk rør. J) Denne enheten sentrifugert og den viskøse væske som forblir i toppseksjonen blir oppsamlet.

Figur 2. Rapid isolasjon from dermis, hvorved col1 polymeriseres inn fibriller. Oppløselig Kol1 ble nøytralisert ved tilsetning av Na ₂ HCO _3, og deretter inkubert ved 37 ° C. En fase kontrast bilde (A) og overføring elektronmikroskop (viser bevart d-banding) (B) av kol1 fibriller generert ved hjelp av vår raske isolasjonsmetoden. Scale barer = 10 mikrometer og 500 nm (henholdsvis). Klikk her for å se større bilde.

Discussion

En viktig komponent i denne metoden er at gjentatte effektiv sammentrykning av dermal prøve for å fjerne overskudd av væske. Det er viktig å fjerne så mye som mulig natriumacetat i trinn 2.5 ved å komprimere prøven. Vi benytter en spatel for å komprimere huden mot siden av røret, men osteklede, kan også anvendes, selv om dette ville nødvendiggjøre fjerning av prøven fra røret og øke den tid som kreves for å utføre denne fremgangsmåten. Likeledes er det viktig å komprimere prøven i trinn 3.1, slik at volumet av natriumcitrat er nøyaktig i de etterfølgende ekstraksjon trinn. Unnlatelse av å fjerne tilstrekkelig væske fra prøven i en hvilken som helst av disse trinnene vil ha en skadelig virkning på det endelige col1 utbytte. En annen viktig komponent til denne protokollen er å opprettholde alle reagenser ved 4 ° C. Dette sikrer effektiv ekstraksjon av syre solubilisert col1 og hindrer størkning av kollagen. Dessuten kan fremgangsmåten utføres ved hjelp av allesterile reagenser i et sterilt miljø. Dette vil være av særlig betydning for den som ønsker å anvende denne metode for å isolere Kol1 for anvendelse i mennesker. Mange kommersielle kilder til kol1 har blitt effektivt sterilisert ved gamma-bestråling. Dessverre er denne praksis i stor grad reduserer dens evne til å danne geler på grunn av protein fragmentering og denaturering ^9,10.

Denne prosedyren representerer de optimale forhold for kol1 utvinning som bestemmes fra mange eksperimenter utført for å etablere den ideelle andel av dermal prøve å buffer volum. Tilsetningen av flere rør er antydet ved undersøkeren ønsker å anvende denne fremgangsmåten for større hudprøver. Basert på vår erfaring, er det ikke tilrådelig å legge til mer sample eller buffer enn angitt for hvert rør. Det er også verdt å merke seg at perlene består av silisiumoksyd, keramiske, granat, aluminiumoksyd, silisium-karbid eller zirkonium-oksyd, som vanligvis brukes i forbindelse med bench-topp homogenizers, er utelatt fra vår prosedyre. De seks sekvensielle 1 min agitasjon sykluser som er beskrevet i trinn 3.3 er nødvendig på grunn av begrensningen som vår omrøring utstyr. Vi kan bare agitere prøven for en total av 60 sek i en tid, etter som maskinen krever en stopp. Hvis man har utstyr som kan settes i 6 min rett, ville det sannsynligvis være greit å bytte til ett, seks-minutters syklus. Vi gjør imidlertid foreslå streng overholdelse av prøvevekt og buffervolum som er beskrevet.

Vi har funnet dette preparatet metoden effektivt isolerer løselig kol1 fra lam, kanin, og menneske dermal prøver ^åtte. På den annen side er denne protokollen var ikke vellykket i å rense Kol1 fra svin hudprøver. Selv med store modifikasjoner av fremgangsmåten, svin dermis produserte en urimelig mengde av skummet på grunn av gjenværende lipider og fett som resulterer i ineffektiv col1 ekstraksjon. Omvendt kan kol1 bli renset fra hele rottehalereller isolert rottehale sener med en litt modifisert forberedelse som omfatter lyseres matriseperler. Dette har tidligere blitt beskrevet i detalj ^8..

For forskere, den potensielle bruker av den endelige syre-solubilisert Kol1 produkt erholdt ved hjelp av denne fremgangsmåten omfatter: a) å tilveiebringe en klebende substrat for kulturplater for å støtte cellebinding og proliferasjon, b) mikro fordelingen av overflater for 2 - eller 3 - dimensjonal (2 - eller 3-D-celler), og c) opprettelse av 3-D-stillaser for vev tekniske anvendelser. Mens en liten mengde av masse-til-mange variasjoner er å forvente fra en hvilken som helst rensemetode, har vi funnet at disse flytende col1 preparater er gjennomgående i stand til å kombineres med forskjellige cellepopulasjoner og støpt i former. Etter nøytralisering av pH og oppvarmingen, er resultatet en størknet konstruert vev konstruere med romlig orienterte celler fordelt jevnt gjennom hele grunnmassen. Avhengig av formen av demold, kan disse konstruerer gjøres i nesten hvilken som helst form og størrelse ^3,4,11-14.

Oppsummert er det vår oppfatning at den mest overbevisende grunn til å benytte denne metoden er at den dramatisk reduserer tiden og innsatsen som kreves for å isolere svært ren, løselig kol1 fra en autolog vev kilde, for eksempel små hud biopsier. Fremgangsmåten er basert på veletablert prosedyrer og gir et produkt som oppfyller eller overstiger kvaliteten av kostbare kommersielle preparater med hensyn til col1 renhet og evnen til å danne stabile 3-D-vev. På samme tid, tillater denne forenklede fremgangsmåte en effektiv og hurtig isolering av autologously-avledet col1 som trygt kan brukes for en rekke kliniske formål.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FastPrep-24 System	MP Biomedicals	116004500
Centrifuge	Beckman	J6-MI	Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g.