普遍存在的第二信使 c-di-GMP 调控多种细菌的生长和行为。我们开发了一种基于捕获化合物质谱技术的新方法，可用于在几乎所有细菌物种中生化鉴定和表征 c-di-GMP 结合蛋白。
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摘要
摘要
在过去十年中，针对参与第二信使c-di-GMP合成（二鸟苷酸环化酶）和降解（磷酸二酯酶）的酶类，其鉴定与表征已取得显著进展。相比之下，关于该信号分子通过何种分子机制和细胞组分调控多种多样的细胞过程，目前仍缺乏相关信息。大多数已知的效应蛋白属于PilZ家族，或为失去催化功能而转为发挥效应功能的退化型二鸟苷酸环化酶或磷酸二酯酶。因此，为了更全面地定义多种细菌中的细胞内c-di-GMP调控网络，迫切需要实验方法来鉴定并验证那些无法通过可靠的in silico预测识别的新型效应蛋白。
我们近期开发了一种基于捕获化合物质谱法（Capture Compound Mass Spectrometry, CCMS）的新技术，作为生化鉴定和表征环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）结合蛋白的有力工具。该技术此前已被报道适用于多种生物体1。本文详细描述了我们用于研究此类信号组分的实验方案。以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为例，该菌是一种机会性病原体，其中c-di-GMP在毒力和生物膜调控中发挥关键作用。CCMS鉴定了已知或预测的c-di-GMP调控网络组分中的74%（38/51）。本研究详尽阐述了CCMS的操作流程，并确立其作为一种强大且多功能的工具，可用于鉴定参与小分子信号传导的新组分。
引言
c-di-GMP 是大多数细菌用来调控其生长和行为多个方面的关键第二信使。例如，c-di-GMP 调控细胞周期进程、运动性以及胞外多糖和表面黏附素的表达2-4。通过协调这些过程，c-di-GMP 促进生物膜的形成，而这一过程与多种致病菌的慢性感染相关5。c-di-GMP 由称为二鸟苷酸环化酶（DGCs）的酶合成，这些酶含有催化性的 GGDEF 结构域4。一些 DGCs 具有一个抑制性位点，当结合 c-di-GMP 后可下调环化酶活性。c-di-GMP 的降解由两类不同的磷酸二酯酶（PDEs）催化，这些酶分别含有催化性的 EAL 或 HD-GYP 结构域6,7。
目前已知的直接结合 c-di-GMP 的效应蛋白绝大多数属于三类蛋白之一：无催化活性的 GGDEF 或 EAL 结构域以及 PilZ 结构域，这些是小分子开关，在结合 c-di-GMP 后会发生构象变化8。DGCs、PDEs 和 PilZ 蛋白已被充分表征，其结构域可通过生物信息学方法相对可靠地预测。in silico 目前的研究重点集中在发现新的 c-di-GMP 效应蛋白类别。最近已报道了一些具有不同结合基序的 c-di-GMP 效应蛋白，例如在 Burkholderia cenocepacia 中的 CRP/FNR 蛋白家族成员 Bcam1349，以及 P. a....
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方案
1. 裂解液制备
- 培养 P. aeruginosa 在LB培养基中将细胞培养至所需的OD值。
注意：请参考使用 ≈ 100 ml 用于静止期培养物的培养/样品 ≈ 500 ml 对数期培养物/样品（OD600 nm = 0.5). - 5,000 × g 离心 20 分钟以形成沉淀 g.
- 将0.5–1 g沉淀重悬于1 ml裂解缓冲液（6.7 mM MES，6.7 mM HEPES，200 mM NaCl，6.7 mM KAc，1 mM DDT，pH 7.5）中，并加入蛋白酶抑制剂（complete mini，无EDTA）以及DNase I。
- 使用高压细胞破碎仪（French pressure cell），在20,000 psi条件下反复通过3次以裂解细胞（参见材料列表）。
- 超速离心细胞裂解液，100,000 x g g 4℃孵育1小时 °C.
- 保存上清液（进入步骤2）。
- 用移液器吸取1 ml 1×裂解缓冲液上下吹打重悬沉淀。
- 以 100,000 x g 超速离心 g 4℃孵育1小时 °C.
- 将沉淀物在液氮中速冻，并于-20℃保存 °C，直至用于膜蛋白捕获（见步骤3）。
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结果
为了在P. aeruginosa中鉴定新的环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）效应因子，我们系统地采用共价交联质谱法（CCMS）分析了对数生长期培养的P. aeruginosa菌株PAO1（OD600 = 0.5）的可溶性组分和膜组分。本文总结并讨论了此次“分子捕获”实验的代表性结果。实验共使用了四个独立的生物学重复。每次实验采用两种不同浓度的cdG-CC（5 µM和10 µM）。为验证结合特异性，实验分别在有或无1 mM c-di-GMP作为竞争物的条件下进行，最后还设置了磁珠对照（即不含cdG-CC）（表1）。
按照上述详细描述的方法（图2），我们获得了以 Scaffold 格式列出的捕获蛋白清单，并去除了可能的污染物，包括核糖体蛋白、链霉亲和素、胰蛋白酶、血清白蛋白、角蛋白及其他人源蛋白。通过 Scaffold 软件将蛋白鉴定的错误发现率（FDR）设定为1%，并将数据导出至 Excel。Scaffold 提供的登录号可通过 Excel .......
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讨论
在实验方案的多个步骤中需格外注意。蛋白浓度是一个关键参数，当细胞在特定培养条件下生长时，很难达到10 mg/ml的浓度。例如 生物膜或小菌落变体）。因此，沉淀重悬应使用少量裂解缓冲液进行。蛋白质浓度可降低至8 mg/ml。与Nesper发表的方法相比 等.1，我们在捕获反应中添加了多种核苷酸，以尽量减少对核苷酸结合蛋白的非特异性捕获。尽管添加核苷酸提高了特异性，但同时也可能阻止在相同位点结合不同核苷酸的蛋白质被捕获。例如效应蛋白FleQ，最近研究表明其可结合ATP和c-di-GMP18 在我们之前的实验中，是在无ATP条件下特异性钓取的1，但在本实验所呈现的数据中，由于存在过量ATP，该现象不再出现。
cdG-CC 应避光保存。尽管环境光中仅含有少量紫外线，仍建议将捕获化合物的储备液用铝箔包裹，并在紫外线照射活化前将捕获混合物也进行同样处理。由于被捕获的蛋白质已与 cdG-CC 共价结合，后续的洗涤步骤可较为严格，以提高特异性。在进行 LC-MS/MS 分析时，实验应在无角蛋白污染.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Alberto Reinders 在优化铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的 CCMS 条件方面所做的工作。同时感谢 Pablo Manfredi 对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）蛋白质的注释。本研究由瑞士国家科学基金会（SNF）Sinergia 项目（资助号：CRSII3_127433）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | 配备冷却功能的96孔板冷却块耦合紫外灯，用于光激活 |
| caproMag | caprotec bioanalytics | 包含在CCMS启动试剂盒中 | 用于磁性颗粒的简便操作，无需移液 |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | 按需提供 | 该试剂盒包含c-di-GMP捕获化合物、c-di-GMP（用于竞争性对照）、链霉亲和素包被的磁珠、捕获缓冲液和洗涤缓冲液 |
| 一次性PD-10脱盐柱 | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12联PCR管条 | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v超声波破碎仪配VialTweeter | Hielscher超声波技术公司 | UIS250v和VialTweeter | |
| 微型French高压细胞破碎仪 | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
参考文献
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Na....
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重印与许可
