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方法文章

捕获化合物质谱法——一种鉴定新型环二鸟苷酸效应蛋白的强大工具

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DOI：

10.3791/51404

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2015年3月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum of the University of Basel, 2Proteomics Core Facility, Biozentrum of the University of Basel

本文内容

摘要

普遍存在的第二信使 c-di-GMP 调控多种细菌的生长和行为。我们开发了一种基于捕获化合物质谱技术的新方法，可用于在几乎所有细菌物种中生化鉴定和表征 c-di-GMP 结合蛋白。

摘要

在过去十年中，针对参与第二信使c-di-GMP合成（二鸟苷酸环化酶）和降解（磷酸二酯酶）的酶类，其鉴定与表征已取得显著进展。相比之下，关于该信号分子通过何种分子机制和细胞组分调控多种多样的细胞过程，目前仍缺乏相关信息。大多数已知的效应蛋白属于PilZ家族，或为失去催化功能而转为发挥效应功能的退化型二鸟苷酸环化酶或磷酸二酯酶。因此，为了更全面地定义多种细菌中的细胞内c-di-GMP调控网络，迫切需要实验方法来鉴定并验证那些无法通过可靠的in silico预测识别的新型效应蛋白。

我们近期开发了一种基于捕获化合物质谱法（Capture Compound Mass Spectrometry, CCMS）的新技术，作为生化鉴定和表征环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）结合蛋白的有力工具。该技术此前已被报道适用于多种生物体1。本文详细描述了我们用于研究此类信号组分的实验方案。以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为例，该菌是一种机会性病原体，其中c-di-GMP在毒力和生物膜调控中发挥关键作用。CCMS鉴定了已知或预测的c-di-GMP调控网络组分中的74%（38/51）。本研究详尽阐述了CCMS的操作流程，并确立其作为一种强大且多功能的工具，可用于鉴定参与小分子信号传导的新组分。

引言

c-di-GMP 是大多数细菌用来调控其生长和行为多个方面的关键第二信使。例如，c-di-GMP 调控细胞周期进程、运动性以及胞外多糖和表面黏附素的表达2-4。通过协调这些过程，c-di-GMP 促进生物膜的形成，而这一过程与多种致病菌的慢性感染相关5。c-di-GMP 由称为二鸟苷酸环化酶（DGCs）的酶合成，这些酶含有催化性的 GGDEF 结构域4。一些 DGCs 具有一个抑制性位点，当结合 c-di-GMP 后可下调环化酶活性。c-di-GMP 的降解由两类不同的磷酸二酯酶（PDEs）催化，这些酶分别含有催化性的 EAL 或 HD-GYP 结构域6,7。

目前已知的直接结合 c-di-GMP 的效应蛋白绝大多数属于三类蛋白之一：无催化活性的 GGDEF 或 EAL 结构域以及 PilZ 结构域，这些是小分子开关，在结合 c-di-GMP 后会发生构象变化8。DGCs、PDEs 和 PilZ 蛋白已被充分表征，其结构域可通过生物信息学方法相对可靠地预测。in silico 目前的研究重点集中在发现新的 c-di-GMP 效应蛋白类别。最近已报道了一些具有不同结合基序的 c-di-GMP 效应蛋白，例如在 Burkholderia cenocepacia 中的 CRP/FNR 蛋白家族成员 Bcam1349，以及 P. aeruginosa 中的转录调控因子 FleQ9,10。此外，最近还鉴定出特异性结合 c-di-GMP 的核糖开关，并证实其以 c-di-GMP 依赖的方式调控基因表达11。不同效应蛋白的 c-di-GMP 结合基序保守性较低，使得通过生物信息学方法预测这类蛋白十分困难。为解决这一问题，我们开发了一种生化方法，该方法基于使用特异性结合 c-di-GMP 的捕获化合物（Capture Compound），并结合质谱分析技术1,12,13。

我们最近设计了一种新型的三价c-di-GMP捕获化合物（cdG-CC，图1）1。该化学骨架包含以下部分：1）以c-di-GMP为诱饵，用于捕获c-di-GMP结合蛋白；2）一个紫外光活化的反应基团，用于将cdG-CC与结合的蛋白交联；3）一个生物素基团，用于通过链霉亲和素包被的磁珠分离捕获的蛋白。cdG-CC可用于直接且特异性地从复杂的生物大分子混合物（如细胞裂解液）中捕获c-di-GMP效应蛋白。基于捕获化合物和化学蛋白质组学的方法此前已被报道适用于多种生物体，例如 Caulobacter crescentus、Salmonella enterica 血清型 typhimurium 和 P. aeruginosa1,14。

在本方法学论文中，我们以铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的提取物为例，深入描述了CCMS实验流程。本研究确立了CCMS作为一种强大且多功能的工具，可用于在生化层面鉴定参与小分子信号传导的新组分。

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方案

1. 裂解液制备

  1. 培养 P. aeruginosa 在LB培养基中将细胞培养至所需的OD值。
    注意：请参考使用 ≈ 100 ml 用于静止期培养物的培养/样品 ≈ 500 ml 对数期培养物/样品（OD600 nm = 0.5).
  2. 5,000 × g 离心 20 分钟以形成沉淀 g.
  3. 将0.5–1 g沉淀重悬于1 ml裂解缓冲液（6.7 mM MES，6.7 mM HEPES，200 mM NaCl，6.7 mM KAc，1 mM DDT，pH 7.5）中，并加入蛋白酶抑制剂（complete mini，无EDTA）以及DNase I。
  4. 使用高压细胞破碎仪（French pressure cell），在20,000 psi条件下反复通过3次以裂解细胞（参见材料列表）。
  5. 超速离心细胞裂解液，100,000 x g g 4℃孵育1小时 °C.
  6. 保存上清液（进入步骤2）。
  7. 用移液器吸取1 ml 1×裂解缓冲液上下吹打重悬沉淀。
  8. 以 100,000 x g 超速离心 g 4℃孵育1小时 °C.
  9. 将沉淀物在液氮中速冻，并于-20℃保存 °C，直至用于膜蛋白捕获（见步骤3）。

2. 去除游离的 c-di-GMP 及其他核苷酸（仅可溶性组分）

  1. 用10 ml冷裂解缓冲液洗涤PD10脱盐柱（见材料列表）。
  2. 倒入上清液（≈ 1 ml）上样至PD10柱，以去除核苷酸。
  3. 用4 ml冷裂解缓冲液（500 µl 步骤）。
  4. 根据Bradford法测定结果，选择浓度最高的组分并合并。

3. 沉淀重悬与溶解（仅膜组分）

  1. 将沉淀重悬于 500 至 1,000 µl 的 1x 捕获缓冲液（不含去污剂）中（见表 1）。
    注意：沉淀难以重悬。建议先用移液器反复吹打以初步重悬沉淀，然后使用 27 G 注射器充分均质化溶液。
  2. 加入 1% (w/v) 的正十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃苷 (DDM)。
  3. 在 4 °C 下于旋转仪上孵育至少 2 小时（或过夜）。
  4. 在 4 °C 下以 100,000 x g 超速离心 1 小时。
  5. 收集上清液。

4. 蛋白质浓度测定

  1. 使用Bradford法测定蛋白质浓度（膜组分使用BCA法）。
  2. 将总蛋白浓度调至10 mg/ml。

5. 捕获

  1. 将300 µg蛋白与1 mM的GDP、GTP、ATP、CTP以及20 µl的5x捕获缓冲液（100 mM HEPES、250 mM KAc、50 mM MgAc、5%甘油，pH 7.5）混合（表1）。用H2O将反应体系调整至100 µl。
    注意：在竞争对照实验中（见步骤5.3和表2），总体积需包含cdG-CC和c-di-GMP的体积。
    注意：所有实验均在200 µl的12孔PCR条板（Thermo Scientific）中进行。
    注意：对于膜组分，务必确保在进行8 M尿素溶解蛋白步骤（步骤7.1）之前，DDM浓度始终高于临界胶束浓度（0.01% w/v）。
  2. 在4 °C下于旋转仪上孵育30分钟。
  3. 加入10 µM cdG-CC（终浓度）。
    注意：需设置不含cdG-CC的对照组（称为“珠粒对照”），以及添加1 mM c-di-GMP的对照组（“竞争对照”）（见表2）。
    注意：cdG-CC浓度可在1至10 µM范围内调整。
  4. 在4 °C下避光孵育至少2小时（膜组分建议过夜），置于旋转仪上。
  5. 短暂离心后，使用CaproBox（见材料列表，λ = 310 nm，辐照强度≥10 mW/cm²，光源距离为2 cm）进行紫外照射4分钟，以激活cdG-CC的反应基团，实现交联。注意：交联前需移除条板盖。
  6. 加入25 µl 5x洗涤缓冲液（5 M NaCl、250 mM Tris，pH 7.5）和50 µl充分重悬的链霉亲和素磁珠，轻轻混匀。
  7. 在4 °C下于旋转仪上孵育1小时。

6. 洗涤步骤

注意：（磁铁：见材料列表）。首先，使用磁铁将磁珠吸附在PCR条带管盖上。然后将PCR条带更换为含有下一个洗涤液的新条带。移除磁铁，重悬磁珠，并孵育2分钟。短暂离心后，将管盖更换为新的管盖。

  1. 洗涤步骤（仅可溶性组分）
    1. 用 200 µl 1× 洗涤缓冲液洗涤 6 次。
    2. 用 200 µl HPLC 级 H2O 洗涤 1 次。
    3. 用 200 µl 80% 乙腈洗涤 6 次。
    4. 用 200 µl HPLC 级 H2O 洗涤 2 次。
  2. 洗涤步骤（仅膜组分）
    1. 用 200 µl 1× 洗涤缓冲液 + 0.1% DDM 洗涤 5 次。
    2. 用 200 µl 1× 洗涤缓冲液 + 0.05% DDM 洗涤 2 次。
    3. 用 200 µl 1× 洗涤缓冲液 + 0.025% DDM 洗涤 1 次。
    4. 用 200 µl 1× 洗涤缓冲液 + 0.0125% DDM 洗涤 1 次。
    5. 用 200 µl 100 mM ABC（碳酸氢铵，NH4CO3）+ 2 M 尿素洗涤 3 次。

7. 质谱样品制备

  1. 在瓶盖中直接将珠子重悬于 20 µl 100 mM ABC（膜组分使用 100 mM ABC + 8 M 尿素）中，并转移至 1.5 ml 离心管中。
  2. 仅膜组分：在 60 °C 孵育 5 分钟，以 500 rpm 振荡。
  3. 加入 0.5 µl 200 mM TCEP（三(2-羧乙基)膦），在 60 °C 孵育 1 小时，以 500 rpm 振荡，随后冷却至 25 °C。
  4. 加入 0.5 µl 新鲜配制的 400 mM 碘乙酰胺，在 25 °C 避光孵育 30 分钟，以 500 rpm 振荡。
  5. 加入 0.5 µl 0.5 M N-乙酰半胱氨酸，在 25 °C 孵育 10 分钟，以 500 rpm 振荡。
  6. 仅膜组分：加入 1 µl Lys-C，在 37 °C 过夜孵育。
  7. 加入 2 µg 胰蛋白酶，在 37 °C 过夜孵育，以 500 rpm 振荡（用 Parafilm 封口以防止干燥）。
    注意：此步骤后样品可在 -20 °C 保存。
    注意：仅膜组分：在加入胰蛋白酶前，加入 100 mM ABC 以调节尿素浓度至 <2 M。
  8. 短暂离心，使用磁铁收集珠子。
  9. 将上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中（若仍有珠子残留，请重复此步骤）。
  10. 加入 5 µl 5% TFA（三氟乙酸）+ 1 µl 2 M HCl（膜组分使用 15 µl 5% TFA + 5 µl 2 M HCl）。
  11. 用 150 µl 乙腈预处理 C18 MicroSpin 柱（The Nest Group, MA, USA）（2,400 rpm 离心 20 秒）。
  12. 用 150 µl 0.1% TFA 平衡 C18 柱两次（每次 2,400 rpm 离心 20 秒）。
  13. 上样并以 2,000 rpm 离心 2 分钟。
  14. 将穿流液重新加载到柱上，并重复离心步骤（2 分钟，2,000 rpm）。
  15. 用 150 µl 0.1% TFA、5% 乙腈洗涤三次（每次 2,400 rpm 离心 20 秒）。
  16. 取一新管，用 150 µl 0.1% TFA、50% 乙腈洗脱两次（每次 2,000 rpm 离心 2 分钟）。
  17. 在真空浓缩仪中将肽段干燥。
  18. 重悬于 40 µl 98% H2O、2% 乙腈、0.15% 甲酸中。
  19. 超声处理 20 秒（脉冲周期 0.5，振幅 100%；参见材料列表），随后以 12,000 rpm 离心 5 秒（台式离心机）。涡旋振荡 10 秒，再以 12,000 rpm 离心 5 秒。转移至 HPLC 小瓶中用于 LC-MS/MS 分析。
  20. 在 -20 °C 冻存。
    注意：此步骤后样品可在 -20 °C 保存。

8. LC-MS/MS 分析

  1. 使用配备反相高效液相色谱柱（75 μm × 37 cm，填充 Magic C18 AQ 3 μm C18 树脂）的纳米液相色谱系统（nano-LC systems），以 0.2 µl/min 的流速运行，采用线性梯度洗脱：溶剂 A（0.15% 甲酸，2% 乙腈）从 95% 逐渐变为 65%，同时溶剂 B（98% 乙腈，0.15% 甲酸）从 5% 逐渐升至 35%，历时 60 分钟。
  2. 采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析肽段，仪器为双压 LTQ-Orbitrap Velos 质谱仪，连接电喷雾离子源。
    注意：数据采集模式设置为：在质谱仪的傅里叶变换（FT）部分进行一次高分辨率 MS 扫描，分辨率为 60,000 FWHM，随后对强度最高的 20 个离子在线性离子阱中进行 MS/MS 扫描。为提高 MS/MS 采集效率，启用电荷态筛选模式，排除未指定及单电荷离子。当前体离子强度超过 100 计数时，触发碰撞诱导解离（CID）。动态排斥时间设置为 30 秒。离子累积时间设置为 300 毫秒（MS 模式）和 50 毫秒（MS/MS 模式）。

9. 数据库搜索

  1. 通过 NCBI 主页（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载 P. aeruginosa NCBI 数据库。
  2. 使用 MassMatrix 转换工具（http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py）将质谱原始谱图转换为 Mascot 通用文件（mgf）。
  3. 使用 MASCOT 2.3 版本在包含正向序列和反向诱饵蛋白条目的 P. aeruginosa NCBI 数据库中搜索该 mgf 文件。
  4. 对完全胰蛋白酶肽段进行赖氨酸和精氨酸位点的 in silico 胰蛋白酶消化（脯氨酸之后除外），允许最多两个漏切位点。
  5. 设置数据库搜索参数：甲硫氨酸氧化（+15.99491 Da）作为可变修饰，半胱氨酸羧氨甲基化（+57.021464 Da）作为固定修饰；对于使用高分辨率扫描的 MASCOT 搜索，前体离子质量容差设为 15 p.p.m.，碎片离子质量容差设为 0.6 Da；最后将蛋白质错误发现率（FDR）设为 1%。
  6. 将 P. aeruginosa CCMS 实验的 Mascot 搜索结果导入 Scaffold 软件（ProteomeSoftware，版本 3），设置参数以获得接近 1% 的蛋白质 FDR，并提取总谱图计数。
  7. 本文展示的代表性结果中，我们采用配对 t 检验比较实验组与竞争对照组，仅考虑 p 值低于 0.1 且谱图计数比值大于 2（实验组谱图计数 / 竞争对照组谱图计数）的蛋白。
  8. 数据可导出至任意电子表格软件进行进一步分析。

10. 无标记定量

  1. 将原始文件导入 Progenesis LC-MS 软件（Nonlinear Dynamics，版本 4.0）。
  2. 使用默认设置进行 LC-MS 对齐和特征峰检测。
  3. 从 Progenesis LC-MS 中以 mgf 格式导出数据。
  4. 使用 MASCOT 对包含正向与反向诱饵蛋白条目的 NCBI P. aeruginosa 数据库进行 MS/MS 谱图搜索。
  5. 将数据库搜索结果导入 Progenesis LC-MS，并将肽段鉴定结果映射到 MS1 特征峰。
  6. 对于数据分析（显著性水平计算、倍数变化比值），采用 SafeQuant 的 ProteinSQAnalysis 脚本（阈值：q 值低于 0.1，谱图计数比值高于 2）。

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结果

为了在P. aeruginosa中鉴定新的环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）效应因子，我们系统地采用共价交联质谱法（CCMS）分析了对数生长期培养的P. aeruginosa菌株PAO1（OD600 = 0.5）的可溶性组分和膜组分。本文总结并讨论了此次“分子捕获”实验的代表性结果。实验共使用了四个独立的生物学重复。每次实验采用两种不同浓度的cdG-CC（5 µM和10 µM）。为验证结合特异性，实验分别在有或无1 mM c-di-GMP作为竞争物的条件下进行，最后还设置了磁珠对照（即不含cdG-CC）（表1）。

按照上述详细描述的方法（图2），我们获得了以 Scaffold 格式列出的捕获蛋白清单，并去除了可能的污染物，包括核糖体蛋白、链霉亲和素、胰蛋白酶、血清白蛋白、角蛋白及其他人源蛋白。通过 Scaffold 软件将蛋白鉴定的错误发现率（FDR）设定为1%，并将数据导出至 Excel。Scaffold 提供的登录号可通过 Excel ...

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讨论

在实验方案的多个步骤中需格外注意。蛋白浓度是一个关键参数，当细胞在特定培养条件下生长时，很难达到10 mg/ml的浓度。例如 生物膜或小菌落变体）。因此，沉淀重悬应使用少量裂解缓冲液进行。蛋白质浓度可降低至8 mg/ml。与Nesper发表的方法相比 等.1，我们在捕获反应中添加了多种核苷酸，以尽量减少对核苷酸结合蛋白的非特异性捕获。尽管添加核苷酸提高了特异性，但同时也可能阻止在相同位点结合不同核苷酸的蛋白质被捕获。例如效应蛋白FleQ，最近研究表明其可结合ATP和c-di-GMP18 在我们之前的实验中，是在无ATP条件下特异性钓取的1，但在本实验所呈现的数据中，由于存在过量ATP，该现象不再出现。

cdG-CC 应避光保存。尽管环境光中仅含有少量紫外线，仍建议将捕获化合物的储备液用铝箔包裹，并在紫外线照射活化前将捕获混合物也进行同样处理。由于被捕获的蛋白质已与 cdG-CC 共价结合，后续的洗涤步骤可较为严格，以提高特异性。在进行 LC-MS/MS 分析时，实验应在无角蛋白污染...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Alberto Reinders 在优化铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的 CCMS 条件方面所做的工作。同时感谢 Pablo Manfredi 对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）蛋白质的注释。本研究由瑞士国家科学基金会（SNF）Sinergia 项目（资助号：CRSII3_127433）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
caproBoxcaprotec bioanalytics1-5010-001 (220 V)配备冷却功能的96孔板冷却块耦合紫外灯，用于光激活
caproMagcaprotec bioanalytics包含在CCMS启动试剂盒中用于磁性颗粒的简便操作，无需移液
c-di-GMP caproKitcaprotec bioanalytics按需提供该试剂盒包含c-di-GMP捕获化合物、c-di-GMP（用于竞争性对照）、链霉亲和素包被的磁珠、捕获缓冲液和洗涤缓冲液
一次性PD-10脱盐柱GE Healthcare17-0851-01 
12联PCR管条Thermo ScientificAB-1114
UIS250v超声波破碎仪配VialTweeterHielscher超声波技术公司UIS250v和VialTweeter
微型French高压细胞破碎仪Thermo Electron CorporationFA-003

参考文献

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