由膀胱扩张诱发的内脏运动反应作为小鼠膀胱疼痛模型

摘要

在美国，约有300万至800万人患有间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS），这是一种以盆腔疼痛为主要特征的致残性疾病。为了研究神经系统对该疾病的作用，研究人员在小鼠和大鼠中采用了一种尿路膀胱疼痛的生理学模型。

摘要

在美国，约有300万至800万人患有间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS），这是一种致残性疾病，其特征是排尿急迫感和频率增加，以及夜尿增多和普遍的盆腔疼痛，尤其在膀胱充盈或排空时加重。尽管经过多年的研究，IC/BPS的病因仍不明确，现有的治疗策略也无法为患者提供完全的缓解。为了研究神经系统对该疾病的作用，已开发出多种动物模型以模拟IC/BPS相关的疼痛和症状。其中一种小鼠模型为尿道膀胱扩张（UBD）。在此模型中，向轻度麻醉动物的膀胱内以特定压力输送压缩空气，持续一定时间。在整个操作过程中，插入腹直肌上斜部的电极记录肌肉的电活动。这种活动被称为内脏运动反应（VMR），是伤害性感受的一种可靠且可重复的测量指标。本文中，我们描述了在小鼠中实施该技术所需的步骤，包括外科操作、生理信号记录和数据分析。利用此模型，可以揭示初级感觉神经元、脊髓二级传入神经元以及参与膀胱疼痛的高级中枢神经系统区域之间的协调机制。这些基础科学知识随后可被转化为临床应用，用于治疗IC/BPS患者。

引言

慢性疼痛被正式定义为持续约三个月或超过正常组织愈合时间的疼痛¹。这类疼痛是人们寻求医疗帮助的主要原因之一²，每年可能造成高达6350亿美元的经济损失³。目前应对慢性疼痛的策略被认为较为陈旧；尽管医学已发展数十年，非甾体抗炎药（NSAIDs）和阿片类药物仍是医生主要开具的治疗手段。然而，这些治疗方法以相同方式应对各种类型的疼痛，在全身范围内产生镇痛效果，而非针对特定疼痛的根本原因进行精准干预。为了更有效地帮助慢性疼痛患者，研究重点应转向最常见的慢性疼痛病因及其可能的特异性治疗方案。本文旨在描述一种用于深入理解间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（Interstitial Cystitis/Painful Bladder Syndrome, IC/BPS）的模型。

间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS）是一种影响数百万人的致残性疾病，主要见于40岁以上的女性⁴。IC/BPS的确切病因尚不明确，但其发病率与遗传因素⁵、特定饮食以及高压力水平相关⁶。IC/BPS的症状包括但不限于：尿急加重、排尿频率增加、膀胱充盈和排尿过程中出现隐痛、刺痛或烧灼样疼痛，以及夜尿增多⁷。出现这些症状的患者通常压力水平更高，并伴有更明显的焦虑情绪⁸。这种压力增加会加剧疼痛，从而进一步加重原有的压力水平。研究表明，在缓解泌尿疼痛的治疗后....

方案

以下方案已获得杜肯大学机构动物护理和使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院的指导方针。

1. 使用无菌技术手术植入导线电极和膀胱导管（总耗时 5-10 分钟） 

1. 手术开始前应准备好以下物品：
   1. 使用温度监测系统、电池供电加热垫和动物体温探针（材料列表），主动监测并调节体温至37.5±0.5 °C。将自动系统连接至低功率加热灯，以进一步控制体温。
   2. 异氟烷麻醉所需的设备包括压缩空气（例如 100% O₂异氟烷蒸发器、异氟烷、异氟烷诱导室（用于初始麻醉）、鼻罩和废气排放系统。
   3. 组装好合适的外科手术器械、静脉导管和电极（材料清单）
2. 在诱导室中使用2-3%异氟烷诱导麻醉状态。当小鼠翻正反射消失时（0-1分钟），将其从诱导室中取出。
3. 将小鼠放入含2-2.5%异氟烷的鼻罩中。轻捏脚趾以检查麻醉深度，动物应无反应。启动计时器。
4. 在每只小鼠的眼睛上放置一滴眼膏。
5. 将小鼠翻转，使其背侧朝下。
6. 经尿道插入导管至膀胱。
7. 将导管浸入外科润滑剂中以润滑导管。
   1. 用尖头镊子轻轻夹住尿道口，镊子方向与动物身体垂直。用另一只手持导管^nd 用镊子夹住导管末端，以与动物身体垂直的角度....

结果

整体UBD-VMR装置的示意图如图所示 图1A。逐步增加压力会诱导原始VMR升高（即 肌电图 (EMG)图1B。使用数字化软件记录过程中应观察到的原始视觉运动反应（VMR）、压力及刺激标记信号如图所示 图2. 图中所示的上层通道 图2 是肌电图（EMG）信号（单位：V）。EMG信号的背景噪声应稳定且幅值较低（<0.2 V）。如果背景信号过高或包含零星的大尖峰（>0.5 V）时，可能需要调整导线和放大器设置。在某些情况下，将导线（从小鼠到放大器和/或从放大器到数字转换器）用铝箔包裹可减少部分噪声。中间通道在 图2 显示由定时压力调节器量化的压力信号（单位：mmHg）。请注意，信号起始呈曲线状，这是由于膀胱完全扩张并非瞬时完成。当压力信号达到该次试验的最大值时例如 75 mmHg 图2)，压力应保持在该最大值。有时，空气会从导管周围的尿道泄漏。这种情况在高压时最为常见（例如

讨论

在人类中，间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS）是一个重要的临床问题，因为患者会出现严重的疼痛，且这种疼痛通常对常规止痛治疗无反应¹⁵。理解并最终治疗慢性膀胱疼痛的主要挑战之一，在于阐明在有害膀胱扩张反应中所涉及的正常神经过程。为了克服这一挑战，需要建立一种膀胱疼痛的动物模型。该模型应具有可重复性、稳定性，并易于测量。幸运的是，Ness 及其同事¹⁰开发了一种可用于研究对有害膀胱扩张产生生理反应的系统。

系统设置简单，主要使用现成的硬件和软件即可完成。UBD VMR 系统中唯一主要的定制设备是定时压力调节器。该设备对气压进行模数转换，并向数字化硬件发送刺激起始标记。使用定时压力调节器可极大地简化数据分析，因为它能自动将压力刺激与记录的肌电图（即 VMR）同步。这一点非常重要，因为 VMR 并不一定在膀胱首次扩张时立即开始，且通常在扩张结束后的短时间内（<5 秒）仍持续存在。尽管如此，只要进行精确同步，研究人员也可轻松使用一个开关式调节器来控制扩张的开启与关闭，并配合一个与记录的肌电图信号同步的计时器来完成 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
红外加热毯及监测系统	Kent Scientific	Right-Temp System	该系统可同时监测两个独立的温度 ，应包括动物体温和加热毯温度 。此外，系统可自动调节温度以维持设定值 。然而，此自动功能在肌电图（EMG）记录期间会产生电干扰，必须关闭 。Kent 可为实验中的 riEMG 记录阶段提供加热垫用的电池组。
异氟烷蒸发器	Draeger	Vapor 19.1	任何异氟烷蒸发器均可使用，但最好选择在 0–2% 异氟烷范围内具有多个调节档位的型号。
异氟烷	多个来源	n/a
100% 氧气气罐	多个来源	n/a	用于动物通气
呼吸级空气	多个来源	n/a	用于膀胱扩张
24 G 0.56 英寸静脉导管	BD Biosciences	381411	用于膀胱插管
外科润滑剂 Surgilube（无菌）	Savage Laboratories	0281-0205-02	任何外科级润滑剂均可适用。
矿物油（无菌）	多个来源	n/a
生理盐水（无菌）	多个来源	n/a
AG8W 银丝，2 米，0.20 毫米（0.008 英寸）直径，无绝缘层	Warner Instruments	W4 64-1318	任何符合上述规格的银丝均可使用 。导线无需"氯化处理"。
眼科软膏	多个来源	n/a
小型手术剪刀	多个来源	n/a
尖头镊子	多个来源	n/a
21 G 针头	多个来源	n/a
Grass 放大器 P511 配三导输入电缆	Grass Instruments	P511 (F-P5IC3/REV1)	这是本实验方案中使用的"放大器" 。放大器设置如下：校准器 = 1 mV；低频 = 300 Hz；放大倍数 = 20；高频 = 10 kHz；线路滤波器 = 开启。
Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus（或等效设备）	Cambridge Electronic Design	1401 Plus	这是本实验方案中使用的"数字化仪" 。来自 WINDAQ 或其他公司的其他数字化系统也可使用；需具备压力信号、肌电图（EMG）和刺激信号的输入通道。
CED Spike2 软件	Cambridge Electronic Design	Spike 2	这是本实验方案中使用的"数字化软件" 。应与数字化仪为同一制造商 。程序应设置为三个通道：压力通道（0–100 mmHg 范围）、EMG 信号通道（通常为 -5 至 +5 V 范围）和刺激标记通道（0–2 V 范围）。
从气罐至膀胱导管的流程图	n/a	n/a	从加压空气罐连接至动物膀胱的顺序：  气罐 → 1/4 英寸管路 → Gilmont 流量计 → Y 型连接器 。Y 型连接器的分支 1 接血压计 。分支 2 接四通阀的单个输入口 → 四通阀输出口 → 定时压力调节器 → 从定时压力调节器引出的 3/32 英寸管路 → 第二个 Y 型连接器（分支 1 接血压计），其分支 2 经 3/32 英寸管路  接第三个 Y 型连接器 。第三个 Y 型连接器的分支 1 接第三个血压计，分支 2 接动物膀胱导管。
Gilmont 流量计	Gilmont	GF8321-1401	多种品牌的流量计均可使用 。用于膀胱扩张的空气，流量计应能承受高压（如该 Gilmont 流量计） 。用于呼吸空气时，流量应可调节至 100 ml/min（典型小鼠流速为 500–1,000 ml/min） 。
四通阀	Elite		这是一种特定设备 。Elite 四通阀原设计用于低压水族箱 。在膀胱扩张系统中，该阀可作为压力骤升时的安全阀 。初始开启气罐时压力过高会损坏定时压力调节器内的压力传感器和/或血压计。此外，该阀通过在系统中提供微小泄漏，使 10–80 mmHg 范围内的压力调节更加容易  。
1/4 英寸管路	多个来源	n/a
3/32 英寸管路	多个来源	n/a
"Y" 型连接器（1/4 英寸和 3/32 英寸）	多个来源	n/a
血压计	CVS		任何药店出售的模拟式血压计均可用于本应用  。
定时压力调节器	定制		该设备为定制装置（由圣路易斯华盛顿大学机械车间制造），可实现自动压力输送，包括气压数字化、试验时长控制、试验间间隔自动化、试验次数控制以及刺激起始的数字信号输出 。然而，系统的基本功能（在特定试验周期内控制压力的开启与关闭）也可通过简单的在线开关实现  。此类模拟控制方式将需要额外的分析参数（见实验方案第 4 部分） 。此外，在数据分析过程中需根据模拟血压计手动设定压力值  。
IGOR Pro	Wavemetrics	n/a	用于肌电图（EMG）信号分析。此类实验中可使用多种不同类型的软件进行数据分析。