由膀胱扩张诱发的内脏运动反应作为小鼠膀胱疼痛模型

摘要

在美国，约有300万至800万人患有间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS），这是一种以盆腔疼痛为主要特征的致残性疾病。为了研究神经系统对该疾病的作用，研究人员在小鼠和大鼠中采用了一种尿路膀胱疼痛的生理学模型。

摘要

在美国，约有300万至800万人患有间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS），这是一种致残性疾病，其特征是排尿急迫感和频率增加，以及夜尿增多和普遍的盆腔疼痛，尤其在膀胱充盈或排空时加重。尽管经过多年的研究，IC/BPS的病因仍不明确，现有的治疗策略也无法为患者提供完全的缓解。为了研究神经系统对该疾病的作用，已开发出多种动物模型以模拟IC/BPS相关的疼痛和症状。其中一种小鼠模型为尿道膀胱扩张（UBD）。在此模型中，向轻度麻醉动物的膀胱内以特定压力输送压缩空气，持续一定时间。在整个操作过程中，插入腹直肌上斜部的电极记录肌肉的电活动。这种活动被称为内脏运动反应（VMR），是伤害性感受的一种可靠且可重复的测量指标。本文中，我们描述了在小鼠中实施该技术所需的步骤，包括外科操作、生理信号记录和数据分析。利用此模型，可以揭示初级感觉神经元、脊髓二级传入神经元以及参与膀胱疼痛的高级中枢神经系统区域之间的协调机制。这些基础科学知识随后可被转化为临床应用，用于治疗IC/BPS患者。

引言

慢性疼痛被正式定义为持续约三个月或超过正常组织愈合时间的疼痛¹。这类疼痛是人们寻求医疗帮助的主要原因之一²，每年可能造成高达6350亿美元的经济损失³。目前应对慢性疼痛的策略被认为较为陈旧；尽管医学已发展数十年，非甾体抗炎药（NSAIDs）和阿片类药物仍是医生主要开具的治疗手段。然而，这些治疗方法以相同方式应对各种类型的疼痛，在全身范围内产生镇痛效果，而非针对特定疼痛的根本原因进行精准干预。为了更有效地帮助慢性疼痛患者，研究重点应转向最常见的慢性疼痛病因及其可能的特异性治疗方案。本文旨在描述一种用于深入理解间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（Interstitial Cystitis/Painful Bladder Syndrome, IC/BPS）的模型。

间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS）是一种影响数百万人的致残性疾病，主要见于40岁以上的女性⁴。IC/BPS的确切病因尚不明确，但其发病率与遗传因素⁵、特定饮食以及高压力水平相关⁶。IC/BPS的症状包括但不限于：尿急加重、排尿频率增加、膀胱充盈和排尿过程中出现隐痛、刺痛或烧灼样疼痛，以及夜尿增多⁷。出现这些症状的患者通常压力水平更高，并伴有更明显的焦虑情绪⁸。这种压力增加会加剧疼痛，从而进一步加重原有的压力水平。研究表明，在缓解泌尿疼痛的治疗后，患者的抑郁和焦虑水平有所下降，从而有效打破这一正反馈循环⁹。目前发现IC/BPS新疗法面临的主要挑战之一，是基础科学对膀胱疼痛机制的理解仍十分有限。

为了研究神经系统在该疾病中的作用，人们已开发出多种动物模型，以模拟间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS）相关的疼痛和症状。传统上，通过将芥子油、丙酮、脂多糖、盐酸和环磷酰胺等不同化学物质注入膀胱，可在动物体内诱导产生膀胱炎。然而，IC/BPS 患者的无菌尿液中并不存在外来物质，因此这些模型的有效性受到质疑。另一种泌尿系统疼痛的小鼠模型是尿道膀胱扩张（UBD）¹⁰。在该模型中，向清醒或轻度麻醉动物的膀胱内，在特定时间段内施加特定压力的压缩空气。在整个实验过程中，置于腹直肌上斜部的电极记录肌肉的电活动（通过肌电图（EMG））。这种电活动被称为内脏运动反应（VMR），是一种可靠且可重复的伤害性感受指标¹⁰。在健康人类志愿者中，类似的空腔器官扩张（例如 膀胱、直肠）会引起不适感，并显著增加主观疼痛评分^11,12，这些特征常被用于诊断 IC/BPS。因此，结合电刺激、药理学以及光遗传学的激活或抑制方法，UBD 成为研究膀胱伤害性感受和疼痛中外周与中枢神经系统成分的一种有效且可靠的模型。

在此，我们描述了目前在常用小鼠品系 C57Bl/6J 雌性个体中进行 UBD 的操作步骤。由于雄性小鼠导管插入过程存在技术困难，该操作主要在雌性小鼠中实施。本方案改编自 Ness 所建立的方法。 等¹⁰ 以及先前由我们实验室发表的研究¹³以下方案描述了在麻醉动物中实施该模型的四个主要组成部分：（1）膀胱插管与记录电极手术；（2）部分麻醉诱导；（3）膀胱扩张及排尿相关肌电反应（VMR）记录；（4）原始VMR/EMG信号的数据分析。下文将讨论因实验生物选择、麻醉深度与诱导方式以及体温控制等因素导致的UBD-VMR操作中的细微差异。

方案

以下方案已获得杜肯大学机构动物护理和使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院的指导方针。

1. 使用无菌技术手术植入导线电极和膀胱导管（总耗时 5-10 分钟） 

1. 手术开始前应准备好以下物品：
   1. 使用温度监测系统、电池供电加热垫和动物体温探针（材料列表），主动监测并调节体温至37.5±0.5 °C。将自动系统连接至低功率加热灯，以进一步控制体温。
   2. 异氟烷麻醉所需的设备包括压缩空气（例如 100% O₂异氟烷蒸发器、异氟烷、异氟烷诱导室（用于初始麻醉）、鼻罩和废气排放系统。
   3. 组装好合适的外科手术器械、静脉导管和电极（材料清单）
2. 在诱导室中使用2-3%异氟烷诱导麻醉状态。当小鼠翻正反射消失时（0-1分钟），将其从诱导室中取出。
3. 将小鼠放入含2-2.5%异氟烷的鼻罩中。轻捏脚趾以检查麻醉深度，动物应无反应。启动计时器。
4. 在每只小鼠的眼睛上放置一滴眼膏。
5. 将小鼠翻转，使其背侧朝下。
6. 经尿道插入导管至膀胱。
7. 将导管浸入外科润滑剂中以润滑导管。
   1. 用尖头镊子轻轻夹住尿道口，镊子方向与动物身体垂直。用另一只手持导管^nd 用镊子夹住导管末端，以与动物身体垂直的角度轻轻插入尿道。
   2. 当导管插入尿道约1-2 mm时，轻柔调整导管方向，使其与身体平行并朝向头部。此操作步骤对于避开耻骨至关重要。
   3. 轻轻将导管推向小鼠身体方向。导管应顺畅无阻力地滑入体腔。切勿强行插入。若导管无法顺利进入，应退回至垂直位置，重新操作。
   4. 导管完全插入膀胱后，轻柔按压小鼠腹部以排出膀胱内容物。将一小块纸巾推入导管开口，彻底清除导管内的尿液。当纸巾被尿液浸透后，及时更换。在整个后续实验过程中持续清除尿液，包括膀胱扩张实验期间（参见实验方案） 3如下所示。
8. 将两根银丝插入左侧腹肌，一根银丝插入胸部（作为接地）。
   1. 使用酒精或碘对导管右侧区域（动物身体的左侧）进行消毒。
   2. 暴露左侧腹肌。
      1. 用镊子夹住左侧腹肌附近的皮肤，用中号手术剪做一个1-2厘米的小切口。
      2. 将剪刀尖插入切口，并轻轻将切口扩大至2 cm。
      3. 使用镊子移开浅层筋膜，以暴露腹外斜肌。注意避免切割或撕裂该区域内的任何主要血管。
   3. 将三根银丝对折弯曲。使用锋利的21 G针头 用针头取少量肌肉组织，然后将针头穿过肌肉。插入肌肉时需小心，避免刺穿任何内脏器官或对肌肉造成不必要的损伤。
   4. 将一根银丝的自由端插入21 G针头的开口中 针头。轻轻将针头从肌肉中抽出，以带动银丝穿过肌肉切口。当针头完全脱离肌肉后，继续轻柔地拉动银丝，直至银丝上的环状部分与肌肉切口齐平。
   5. 对第二根肌线重复步骤 1.7.3–1.7.4。该肌线应放置在距离第一根肌线约 0.5 cm 的位置。插入后，必须确保两根肌线互不接触。
   6. 将第三根银丝（接地）插入心脏下方的胸部位置。
      1. 使用锋利的21 G针头 用针头取一小块皮肤（无需切开或剃除皮肤），并将针头穿过皮肤。
      2. 按照上述方法插入银丝，并穿过皮肤。
9. 在暴露的肌肉上覆盖少量37.5 °C的无菌矿物油以保持湿润，并将皮肤尽可能多地拉伸覆盖暴露的肌肉区域。
10. 注射 0.5 ml 皮下注射生理盐水，以在后续步骤中帮助维持体液水平。
11. 轻轻将动物侧放，以便于维持其体温。

2. 局部麻醉逐步操作流程 （总时长约75分钟）

以下麻醉方案已获得杜肯大学机构动物照护与使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院的指导方针。

1. 完成上述第一部分后，立即将异氟烷浓度降至1.5%，并在此浓度维持15分钟。
2. 逐步降低异氟烷浓度，使动物处于部分麻醉状态。
   1. 每15分钟降低异氟烷浓度0.125%，直至动物对脚趾夹捏产生屈曲反应，但不发出声音或出现其他动作。
   2. 通常，异氟烷浓度在0.8–1.0%时为最佳水平，但因麻醉装置配置不同，所需浓度可能有所差异。当麻醉水平适当时，发声和/或自主活动极为罕见。

3. 在梯度压力（15–75 mmHg）膀胱扩张期间进行肌电图（EMG）记录 （总时长——根据实验情况而定）

1. 设置以下项目用于肌电图记录和膀胱扩张：
   1. 设置放大器、数据采集器和记录软件。在此配置中，数据采集器有一个用于放大器的输入端口，以及两个用于压力调节器的输入端口（压力输入和刺激标记输入，详见下文第3.1.2节）。具体的硬件和软件配置可根据需要进行调整（详见材料清单中的具体说明）。
   2. 建立一个向动物输送特定气压脉冲的系统。该系统在以下实验方案中称为“定时压力调节器”。它可实现气压的自动化输送，包括气压的数字化、控制试验时长、自动控制试验间间隔、控制试验次数以及刺激起始的数字信号输出（参见 Anderson 等¹⁴ （用于定时压力调节器的示意图）。
2. 将小鼠的所有导联线（2根腹部导联线 + 1根接地线）连接至放大器和数字转换器，并在数字转换器软件中开始记录肌电（EMG）信号。注意记录在数字转换器软件中选择“Write”时的时间。
3. 从膀胱导管上移除纸巾。将导管连接至气管（来自定时压力调节器）。
4. 在60 mmHg扩张压力下进行一次20秒的单次试验。
   1. 将流量调节器设置为 60 mmHg（使用模拟血压计检查压力）。
   2. 将定时压力调节器设置为先输出20秒的预压阶段（这将在数据采集软件中记录为2V刺激信号），随后输出20秒的压力扩张脉冲。
   3. 开始试验（预加压间隔 + 压力扩张试验）。当实际压力试验开始时，使用连接到系统上的3个血压计再次核对压力。
   4. 在压力扩张试验期间，出现强烈的肌电图信号（>在20秒扩张期间及可能结束后，应观察到约0.5 V的信号。动物可能会出现腹部运动，但不应发出声音或有其他身体活动。尽管罕见，若观察到异常运动或发声，应增加异氟烷浓度。
5. 如果 1^st 60 mmHg的扩张可产生适当的肌电图信号，以1-2分钟的试验间间隔重复步骤3.4两次。
6. 在接收到三次60 mmHg试验的强信号后，进行实验性扩张。
   1. 许多研究采用逐步递增的扩张刺激，起始压力较低（10–15 mmHg），以10–15 mmHg为增量逐步升高至伤害性压力（75–80 mmHg）。不同压力下的代表性结果示例见下文的记录曲线。
   2. 典型试验包括20秒的预加压阶段、20秒的加压扩张试验，以及1至2分钟的试验间歇期。
   3. 在每个压力水平下进行三次扩张刺激，然后对三次试验结果取平均值（以获得每个压力水平下的单一内脏运动反应）。在另一种方法中，在每个压力水平下进行五次扩张刺激，剔除最高值和最低值试验结果，然后对剩余的三个反应值取平均。
7. 实验性扩张完成后，停止记录，保存实验文件，并采用批准的方法处死动物。

4. 原始肌电图信号的分析

1. 内脏运动反应分析（即 肌电图记录可通过内置的数字化软件或第三方程序（见材料清单）轻松完成。以下为通用分析步骤，适用于使用多种软件或手动分析此类数据。
2. 要从数字化仪软件中导出肌电图、压力和刺激信号数据，请执行以下操作：
   1. 打开实验文件。
   2. 点击“文件” “另存为”
   3. 将文件类型更改为“电子表格文本 (.txt)”，命名文件，然后点击“保存”。
   4. 在弹出窗口中，将输出采样率更改为“1000”，将开始时间更改为数据采集开始的时刻，将结束时间更改为“MaxTime()”。勾选“时间偏移输出，使第一行为 0.0 秒”的选项，然后点击“OK”。
   5. 数据现在将被导出为一个文本文件，可在多种程序中打开。该文件应包含四列（Timer、VMR（EMG）、Pressure、Stimulus）。
3. 对每只受试实验动物，执行以下数学运算。
   1. 通过计算每个时间点的绝对值，对整个数据集的肌电（EMG）信号进行整流。
   2. 确定实验背景阶段的平均肌电图（EMG）反应。
   3. 从实验中每个整流后的数据点减去该平均背景肌电图反应，以获得经背景校正的数据集。
   4. 计算背景校正后数据集中每个20秒加压前时间间隔的曲线下面积（AUC）。
   5. 在经背景校正的数据集中，计算每次20秒压力扩张试验的曲线下面积（AUC）。
   6. 将每次压力扩张试验的曲线下面积（AUC，步骤 4.3.5 中获得）除以整个实验中最低压力前时间间隔的 AUC（步骤 4.3.4 中获得）。该比值即为每次完整压力扩张试验的归一化且经背景校正的 AUC。
4. 对每只实验动物，从单一压力下多次标准化试验取平均值，以获得以伏特·秒（Vsec）为单位的标准化内脏运动反应（VMR）。
5. 根据实验设计对数据进行适当的统计分析。

结果

整体UBD-VMR装置的示意图如图所示 图1A。逐步增加压力会诱导原始VMR升高（即 肌电图 (EMG)图1B。使用数字化软件记录过程中应观察到的原始视觉运动反应（VMR）、压力及刺激标记信号如图所示 图2上方通道可见于 图2 是肌电图（EMG）信号（单位：V）。EMG 信号的背景信号应稳定且幅值较低（<0.2 V）。如果背景信号过高或包含零星的大尖峰（>0.5 V）时，可能需要调整导线和放大器设置。在某些情况下，将导线（从小鼠到放大器和/或从放大器到数字转换器）用铝箔包裹可减少部分噪声。中间通道在 图2 显示由定时压力调节器以 mmHg 为单位量化的压力信号。请注意，信号起始呈曲线状，这是因为膀胱完全扩张并非瞬时完成。一旦压力信号达到该次试验的最大值（例如 75 mmHg 图2)，压力应保持在该最大值。有时，空气会从导管周围的尿道泄漏。这种情况在高压时最常发生（例如. ...

讨论

在人类中，间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS）是一个重要的临床问题，因为患者会出现严重的疼痛，且这种疼痛通常对常规止痛治疗无反应¹⁵。理解并最终治疗慢性膀胱疼痛的主要挑战之一，在于阐明在有害膀胱扩张反应中所涉及的正常神经过程。为了克服这一挑战，需要建立一种膀胱疼痛的动物模型。该模型应具有可重复性、稳定性，并易于测量。幸运的是，Ness 及其同事¹⁰开发了一种可用于研究对有害膀胱扩张产生生理反应的系统。

系统设置简单，主要使用现成的硬件和软件即可完成。UBD VMR 系统中唯一主要的定制设备是定时压力调节器。该设备对气压进行模数转换，并向数字化硬件发送刺激起始标记。使用定时压力调节器可极大地简化数据分析，因为它能自动将压力刺激与记录的肌电图（即 VMR）同步。这一点非常重要，因为 VMR 并不一定在膀胱首次扩张时立即开始，且通常在扩张结束后的短时间内（<5 秒）仍持续存在。尽管如此，只要进行精确同步，研究人员也可轻松使用一个开关式调节器来控制扩张的开启与关闭，并配合一个与记录的肌电图信号同步的计时器来完成 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
红外加热毯及监测系统	Kent Scientific	Right-Temp System	该系统可同时监测两个独立的温度 ，应包括动物体温和加热毯温度 。此外，系统可自动调节温度以维持设定值 。然而，此自动功能在肌电图（EMG）记录期间会产生电干扰，必须关闭 。Kent 可为实验中的 riEMG 记录阶段提供加热垫用的电池组。
异氟烷蒸发器	Draeger	Vapor 19.1	任何异氟烷蒸发器均可使用，但最好选择在 0–2% 异氟烷范围内具有多个调节档位的型号。
异氟烷	多个来源	n/a
100% 氧气气罐	多个来源	n/a	用于动物通气
呼吸级空气	多个来源	n/a	用于膀胱扩张
24 G 0.56 英寸静脉导管	BD Biosciences	381411	用于膀胱插管
外科润滑剂 Surgilube（无菌）	Savage Laboratories	0281-0205-02	任何外科级润滑剂均可适用。
矿物油（无菌）	多个来源	n/a
生理盐水（无菌）	多个来源	n/a
AG8W 银丝，2 米，0.20 毫米（0.008 英寸）直径，无绝缘层	Warner Instruments	W4 64-1318	任何符合上述规格的银丝均可使用 。导线无需"氯化处理"。
眼科软膏	多个来源	n/a
小型手术剪刀	多个来源	n/a
尖头镊子	多个来源	n/a
21 G 针头	多个来源	n/a
Grass 放大器 P511 配三导输入电缆	Grass Instruments	P511 (F-P5IC3/REV1)	这是本实验方案中使用的"放大器" 。放大器设置如下：校准器 = 1 mV；低频 = 300 Hz；放大倍数 = 20；高频 = 10 kHz；线路滤波器 = 开启。
Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus（或等效设备）	Cambridge Electronic Design	1401 Plus	这是本实验方案中使用的"数字化仪" 。来自 WINDAQ 或其他公司的其他数字化系统也可使用；需具备压力信号、肌电图（EMG）和刺激信号的输入通道。
CED Spike2 软件	Cambridge Electronic Design	Spike 2	这是本实验方案中使用的"数字化软件" 。应与数字化仪为同一制造商 。程序应设置为三个通道：压力通道（0–100 mmHg 范围）、EMG 信号通道（通常为 -5 至 +5 V 范围）和刺激标记通道（0–2 V 范围）。
从气罐至膀胱导管的流程图	n/a	n/a	从加压空气罐连接至动物膀胱的顺序：  气罐 → 1/4 英寸管路 → Gilmont 流量计 → Y 型连接器 。Y 型连接器的分支 1 接血压计 。分支 2 接四通阀的单个输入口 → 四通阀输出口 → 定时压力调节器 → 从定时压力调节器引出的 3/32 英寸管路 → 第二个 Y 型连接器（分支 1 接血压计），其分支 2 经 3/32 英寸管路  接第三个 Y 型连接器 。第三个 Y 型连接器的分支 1 接第三个血压计，分支 2 接动物膀胱导管。
Gilmont 流量计	Gilmont	GF8321-1401	多种品牌的流量计均可使用 。用于膀胱扩张的空气，流量计应能承受高压（如该 Gilmont 流量计） 。用于呼吸空气时，流量应可调节至 100 ml/min（典型小鼠流速为 500–1,000 ml/min） 。
四通阀	Elite		这是一种特定设备 。Elite 四通阀原设计用于低压水族箱 。在膀胱扩张系统中，该阀可作为压力骤升时的安全阀 。初始开启气罐时压力过高会损坏定时压力调节器内的压力传感器和/或血压计。此外，该阀通过在系统中提供微小泄漏，使 10–80 mmHg 范围内的压力调节更加容易  。
1/4 英寸管路	多个来源	n/a
3/32 英寸管路	多个来源	n/a
"Y" 型连接器（1/4 英寸和 3/32 英寸）	多个来源	n/a
血压计	CVS		任何药店出售的模拟式血压计均可用于本应用  。
定时压力调节器	定制		该设备为定制装置（由圣路易斯华盛顿大学机械车间制造），可实现自动压力输送，包括气压数字化、试验时长控制、试验间间隔自动化、试验次数控制以及刺激起始的数字信号输出 。然而，系统的基本功能（在特定试验周期内控制压力的开启与关闭）也可通过简单的在线开关实现  。此类模拟控制方式将需要额外的分析参数（见实验方案第 4 部分） 。此外，在数据分析过程中需根据模拟血压计手动设定压力值  。
IGOR Pro	Wavemetrics	n/a	用于肌电图（EMG）信号分析。此类实验中可使用多种不同类型的软件进行数据分析。