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从蜘蛛中提取毒液及显微解剖毒腺用于蛋白质组学和转录组学分析

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DOI：

10.3791/51618

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2014年11月3日

1Department of Biological Sciences, University of Massachusetts Lowell

本文内容

摘要

本文提供了一种利用电刺激从蜘蛛中提取毒液的实验方案，旨在：1）进行毒液的蛋白质组学表征，2）刺激毒液腺基因表达，3）开展毒液的功能研究。随后描述了用于基因表达研究的毒液腺显微解剖方法。

摘要

毒液是化学成分复杂的分泌物，通常包含多种具有不同生理活性的蛋白质和多肽。对毒液蛋白的功能表征具有重要的生物医学应用价值，包括发现潜在药物分子或用于细胞受体研究的探针。蜘蛛是已知物种最丰富的有毒生物类群，但目前仅有少数物种的毒液被充分研究，部分原因在于从小型动物中采集微量毒液存在困难。本文介绍了一种利用电刺激采集蜘蛛毒液的实验方案，并以西部黑寡妇蜘蛛（Latrodectus hesperus）为例演示该操作流程。所采集的毒液适用于多种后续分析，包括通过质谱法直接鉴定蛋白质、功能测定，以及用于转录组研究的毒液基因表达分析。该方法相较于从整个毒腺组织匀浆中分离毒液的方法具有优势，后者无法将真正的毒液成分与未被分泌的细胞内蛋白质区分开来。代表性结果展示了利用质谱技术在采集样本中检测到已知的毒液多肽。在毒液采集之后，本文还提供了一套蜘蛛毒腺解剖方案，结果表明该方法可实现对毒液表达蛋白和多肽的序列水平表征。

引言

毒液是动物分泌物，主要通过注入其他动物体内以实现捕食或防御目的，同时在生物医学领域具有重要的生物学应用价值1–3。只有少数动物能够合成毒液，但由于其在进化过程中多次独立产生，因此在无脊椎动物（例如，刺胞动物、芋螺、蝎子和蜘蛛）和脊椎动物（例如，蛇类、某些鱼类和哺乳动物）中广泛分布1,4。对毒液的生化表征通常显示，其成分包含多种多样的蛋白质和多肽，主要作用于被注入动物的循环系统和神经系统，从而快速递送其中的毒素成分1。少数有毒动物可能对人类构成威胁，特别是那些与人类共栖分布的物种5。对毒液组成及其功能活性的研究，在脊椎动物细胞组分（尤其是神经元离子通道）的功能鉴定6以及基本细胞过程（例如，神经分泌）的阐明方面7发挥了重要作用。此外，某些毒液多肽在生物医学领域具有潜在应用价值，可用于癌症和疼痛治疗8,9，并被用作候选药物先导化合物及抗蛇毒血清开发的资源。毒液在生态学和进化生物学研究中也具有重要地位1,4,10,11，因此采集这些具有潜在危险的分泌物具有多种科研用途。

已描述的蜘蛛（蛛形纲蜘蛛目）物种超过>40,000种，除一个科外，100多个蜘蛛科均具有一对以螯牙为末端的毒腺12。蜘蛛物种的高度多样性表明，它们是毒液生物中最大的单系群。然而，对蜘蛛毒液的生化表征主要集中于少数与人类中毒事件相关的物种。近年来对蜘蛛毒液的蛋白质组学和转录组学研究表明，其通常含有大量独特的蛋白质和多肽2,13,14。高通量cDNA测序和质谱肽指纹技术的进步极大促进了这些毒液蛋白的发现15。然而，此类研究的前提是从蜘蛛中收集足够量的毒液和/或毒腺，而关于这些技术的详细操作记录却十分有限16。

本文介绍了一种从黑寡妇蜘蛛中采集毒液及毒腺的实验方案，该方法也可适用于体型相似的其他蜘蛛。将毒液与毒腺分别采集，有助于区分分泌至毒液中的蛋白质与执行其他细胞功能的蛋白质。黑寡妇及其他Latrodectus属蜘蛛因其高度神经毒性的毒液而广为人知，其毒液可导致人类剧烈疼痛，有时还伴随大量出汗、肌肉收缩、高血压、呼吸困难和局部麻痹5。本文所述的毒液采集方案采用电刺激法，对麻醉后的蜘蛛施加电流，以诱发肌肉收缩并释放毒液。使用微毛细管迅速收集毒液液滴，并转移至离心管中冷冻保存。由于该实验涉及危险操作，仅应由经过充分培训的人员执行，并在关键步骤中格外谨慎。所采集的毒液具有多种用途，例如用于成分分子的表征与分离2、生理学实验或功能检测18，以及诱导毒液相关基因的表达11。本方案最后描述了毒腺的解剖与保存方法，可用于克隆特异性毒液基因，已有研究表明，在不同蜘蛛中，此类基因的表达通常在毒液耗尽后2–3天内启动10,11。

方案

1. 电刺激装置的准备

  1. 将电刺激器电源线插入电源插座，并将外接脚踏开关连接至外部信号输入端。
    注意：电线必须正确绝缘，禁止触碰暴露的导电金属部分。操作时应佩戴乳胶或丁腈手套以提供保护。在连接电源线和电极线时，电刺激器的电源开关应处于关闭状态。
  2. 将正极电极连接至电刺激器的红色输出端子（当极性开关处于正常模式时），负极电极连接至黑色输出端子。注意：每个电极线末端应配有鳄鱼夹。
  3. 将刺激器设置为以下推荐的初始参数：电压=7 V，频率=1 脉冲/秒，延迟=0 毫秒，持续时间=200 毫秒，双脉冲开关=常规，模式开关=关闭。
  4. 通过将鳄鱼夹连接至电压表的正负测试引线来检测电极输出。打开刺激器电源开关，并用脚踏开关输出电流。

2. 固定镊子及其他材料的准备

  1. 将轻质镊子的一个镊臂浸入液态塑料涂层中，静置四小时使其干燥。用单层棉质缝纫线紧密缠绕相对镊臂的尖端约15 mm，并将线头打结固定。
    注意：线绳用于吸收施加的生理盐水溶液，以促进电导性，而塑料涂层则提供绝缘作用以减缓电流。
  2. 用锋利的剪刀剪断钝头注射针的针尖，并用砂纸打磨开口使其平滑。通过软管将针头连接至真空废液收集装置（例如，真空过滤瓶）。
    注意： 该针头将吸走水分并可反向排出，用于完成刺激电极所形成的电路。针头开口必须足够小以免伤害蜘蛛，但又足够大以确保溶液可被真空吸入而不堵塞（例如，25 G × 1 ½ 英寸，参见材料清单）。
  3. 在解剖显微镜视野下，使用固定于磁性底座或固定支架装置上的覆塑双头夹具，将轻质镊子水平固定于紧密闭合状态，使镊子的塑料涂层镊臂位于上方，缠绕线绳的镊臂位于下方。
    注意：双头夹具通过夹具架固定于磁性底座上以保持静止（参见材料清单）。可在夹具架旁用橡皮筋紧紧缠绕轻质镊子的镊臂，以增加压力，确保引入蜘蛛后镊子保持闭合状态。
  4. 将正极鳄鱼夹连接至线绳上游的镊子底部镊臂，将负极鳄鱼夹连接至钝头金属真空针。 
  5. 使用电压表测试电路电流：将正极探针置于线绳与鳄鱼夹之间的镊臂上，将负极探针置于钝头真空针上。踩下脚踏开关，确认检测到足够电流；若电流充足，则移除探针。
  6. 准备若干用于毒液采集的微量毛细管。戴手套的手握住微量毛细管一端，无菌金属镊子夹住另一端，将镊子夹持端水平置于本生灯火焰上方。用金属镊子从火焰方向向外拉伸微量毛细管，形成细长的尖端，同时保持另一端固定不动。
    注意：操作时应佩戴护目镜，因微量毛细管易发生断裂。
  7. 将制备好的微量毛细管平放在培养皿中的固定腻子条上。在解剖显微镜下检查毛细管末端，并用无菌金属镊子在拉伸端制造一个小的斜面开口。
  8. 标记若干无菌0.5 ml离心管。向无菌管中加入无菌去离子水（例如，5 μl 经高压灭菌的去离子水）。盖紧管盖，并将离心管置于冰上。
  9. 在烧杯中配制生理盐水溶液，并用另一烧杯盛装高压灭菌的去离子水。

3. 用镊子固定蜘蛛

  1. 打开 CO2 气罐，使用长金属镊子将蜘蛛从封闭的塑料收集瓶（见材料清单）转移至 CO2 麻醉室。
    注意：黑寡妇蜘蛛具有危险性毒液，进行本方案时务必佩戴手套。
  2. 将蜘蛛置于麻醉室内 5–10 分钟，或直至其被麻醉且在用长镊子轻轻触碰时不再移动。使用移液器将生理盐水滴加到镊子上的细线上以润湿细线。
    注意：有关黑寡妇蜘蛛 CO2 麻醉参数的指导，请参见 Spagna 和 Moore19。
  3. 使用钝头解剖镊子并戴着手套，夹住麻醉后蜘蛛的前肢，将其从 CO2 麻醉室中取出，转移至轻质镊子装置。分开闭合的轻质镊子的叉臂，将蜘蛛的头胸部置于两叉臂之间，并让叉臂闭合，以确保蜘蛛被牢固固定但未受压损。确保蜘蛛背甲朝下（参见 Foelix20 获取蜘蛛解剖结构指南），使其腹面朝向塑料涂层，并稳定地停靠在涂有细线的叉臂上，同时正极电极保持连接在底部叉臂。操作蜘蛛时应迅速进行。
  4. 调节解剖显微镜的放大倍数、焦距和光源，直至蜘蛛的螯肢和毒牙清晰可见。

4. 毒液采集

  1. 开启真空泵，使用另一支钝头注射器针头将水溶液喷洒到蜘蛛的螯肢上，再用真空针头吸走水分以去除杂质。
  2. 将连接负极的真空针头接触蜘蛛的口器，并用脚踏开关施加一次或多次电脉冲。如有需要，用真空吸除反流物。
    注意：蜘蛛口器位于螯肢后方、口器与颚叶之间背侧的口腔内部（详见Foelix20中对蜘蛛解剖结构的详细描述）。注意：每次施加脉冲时，蜘蛛的腿部会发生收缩，毒液将以透明液滴的形式从螯牙末端渗出，肉眼可见。
  3. 用微毛细管尖端收集毒液液滴，并将毛细管尖端插入含有水或缓冲液的0.5 ml离心管中（溶液将被吸入毛细管内）。
    注意：避免毛细管刺破蜘蛛身体，以免导致血淋巴污染及蜘蛛死亡。同时避免毛细管接触纺器分泌的丝和粘液，防止污染。
  4. 将带有管适配器的转移注射器连接至微毛细管（连接端为与采集端相对的一端），将毒液溶液重新排入离心管中。将离心管置于冰上。
    注意：废弃的毛细管应丢弃至附近的锐器盒中。
  5. 将开口的塑料收集管及其管盖放置在蜘蛛附近。一只手用钝头解剖镊小心夹住蜘蛛腿部，另一只手小心打开轻质镊子的镊口，用钝头镊将蜘蛛滑入收集管中，并迅速盖紧管盖。继续处理下一只蜘蛛；操作完成后，将含有毒液的离心管存放在-80 °C冰箱中。
    注意：将蜘蛛从镊子转移回收集管时仍需保持谨慎。确保收集管及管盖放置在蜘蛛附近，以便快速转移，并佩戴手套操作。

5. 蛇毒腺解剖

  1. 毒液采集后两到三天，将蜘蛛置于 CO2 麻醉室中进行麻醉（参见步骤 3.1）。装满液氮容器并放置在解剖显微镜旁。
    注意：操作液氮时，需佩戴护目镜和耐低温手套。
  2. 用可去除 RNase 和 DNA 污染的溶液清洁解剖区域和解剖镊。在解剖显微镜下放置一个小培养皿，并加入解剖缓冲液（例如，1× 盐水-柠檬酸钠（SSC）缓冲液）。 
  3. 将蜘蛛从 CO2 麻醉室转移至培养皿中，用镊子迅速分离头胸部与腹部。
  4. 用镊子在解剖显微镜下固定头胸部，使螯肢位于视野范围内。使用另一把镊子的尖端剪开连接头甲与螯肢侧面的角质层。用第二把镊子从侧面夹住螯肢，轻轻来回拉动，直至毒腺被拉出。 
  5. 将毒腺从螯肢上分离（或根据需要保留在螯肢上），并转移至一个耐低温的 0.5 ml 离心管中。将盖好的离心管放入液氮中。
    注意：每次解剖操作不应超过 15 分钟。
  6. 重复对其他蜘蛛进行解剖，直至完成。将装有样品的离心管从液氮转移至 -80 °C 超低温冰箱中保存。

结果

采集毒液并进行毒腺解剖常用于在序列水平上表征毒液中的蛋白质和多肽10,11,15。采集的毒液还可用于生理学检测，以确定其功能活性18。毒液采集可刺激毒腺基因表达，从而有利于通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）克隆特定的毒素转录本10,11。通过将标准质谱技术与由毒腺cDNA文库生成的序列数据库相结合，也可高通量地鉴定毒液蛋白15,21。上述方案所采集的毒液和毒腺已成功应用于相关研究，图1展示了该方法有效性的示例。

从成年雌性L. hesperus收集的毒液经胰蛋白酶消化后，进行溶液内多维蛋白质鉴定技术（MuDPIT）分析，该技术将高效液相色谱法（HPLC）与串联质谱法（MS/MS）联用。本实验中的MuDPIT分析由亚利桑那大学蛋白质组学联盟完成。将检测到的肽段质量及其解离碎片（子离子，由质谱图推断）与从L. hesperus毒腺构建的基因表达文库中获得的cDNA序列翻译所理论预测的肽段序列进行比对（毒腺通过上述解剖方案获取）21。在本实验中，在99.9%的概率阈值下，从所有收集的质谱数据中检测到36种蛋白质，且每种蛋白质至少包含一个被检测到的肽段。其中一种被检测到的蛋白质由总共43个质谱图支持（代表性质谱图见图1A），对应三个特异性肽段，覆盖了该蛋白质序列的35%（图1B）。该检测到的蛋白质（由所获得的cDNA翻译而来）在BLASTp分析中与L. tredecimguttatus的latrodectin（GenBank登录号P49125.1）具有最高匹配度，e值为2e-46，在氨基酸序列水平上与本实验中检测到的蛋白质有80%的一致性。latrodectin也被称为α-黑寡妇毒素低分子量蛋白，是黑寡妇蜘蛛毒液中已知的组分22,23，这验证了本方案的有效性。在毒液中鉴定出的部分蛋白质对应于在BLAST分析中未找到匹配结果的序列。目前尚不清楚这一结果是由于蜘蛛基因组资源有限以及其蛋白质功能信息不足所致，还是因为该未知蛋白为毒液中的污染物。然而，通过基因或蛋白质表达分析，检测该新型蛋白质在毒腺中的相对其他组织的表达丰度，应可判断其是否为真正的毒液组分。

质谱肽段碎片分析；质荷比谱图；肽段序列鉴定。
图1：通过质谱技术从黑寡妇蜘蛛毒液中鉴定出的latrodectin肽段。 (A) 通过MuDPIT分析中MS/MS部分检测到的代表性质谱图（共43张之一），该谱图被指认至从L. hesperus毒液中获得的cDNA序列的预测翻译产物，该cDNA序列如图B所示。谱图横轴显示对母肽（CGEEDFGEEIVK）进行碎裂后产生的子离子的质荷比（m/z），顶部字母表示根据子离子质量确定的肽段序列。 (B) 图A中谱图所归属的蛋白质序列，其中以红色、粗体并加下划线的文本标示出与图A谱图对应的序列；额外的红色文本（非粗体）代表通过其他质谱数据检测到的该蛋白质中的另一肽段。该蛋白质序列由解剖获得的毒腺组织中提取的cDNA序列翻译而来。

讨论

毒液是具有生理活性的蛋白质、多肽及其他分子的重要来源，在药物发现以及细胞和生态学基础研究中具有广泛应用1–3。然而，毒液的采集，特别是来自危险或体型较小动物的毒液，是一项具有挑战性的任务。本实验方案展示了如何从黑寡妇蜘蛛中采集毒液及毒腺，并通过多维蛋白鉴定技术（MuDPIT）对毒液进行分析，结合从毒腺cDNA克隆获得的蛋白质数据库，验证了该方法的成功性21。尽管本方案适用于黑寡妇蜘蛛及中等体型的蜘蛛，但对于体型较大的原蛛下目（类捕鸟蛛）蜘蛛，已有其他毒液采集技术被采用，例如直接用玻璃移液管从毒牙中吸取毒液e.g., 24。然而，对于体型较小且不具攻击性的蜘蛛，后一种方法并不适用。 

此处所述毒液采集方案的一个尤为关键的方面是采集过程的初始准备和优化阶段，以使该过程变得更加常规化、一致且快速。该方案在初期掌握起来具有挑战性，但经过多次重复操作后，会变得更容易且更迅速。在涉及处理危险蜘蛛、使用电流、尖端玻璃微量毛细管和注射器针头等所有关键步骤时，均需格外谨慎。在操作过程中应穿戴适当的个人防护装备，例如腈类手套、实验服、长裤和封闭式鞋具；在塑形微量毛细管时还应佩戴护目设备。 

毒液采集的另一个难点在于单只蜘蛛产生的毒液量很少，尤其是Latrodectus属蜘蛛，每只个体最多只能采集到1–2微升。为了获得足够用于下游应用（如蛋白质凝胶电泳或功能测定）的毒液，可能需要将多只个体的毒液汇集至同一管中。在此类情况下，鉴于某些蜘蛛毒液存在性别间、发育阶段间及地理种群间的差异25,26，仅可将相同性别、相同发育阶段及相同种群的个体毒液进行混合。不同个体间毒液产量也可能存在显著差异，产量较低的情况可能反映了毒腺近期已被耗竭。因此，建议在最后一次喂食后数天再进行毒液采集。若释放的毒液量较少，不应过度增加电流刺激蜘蛛，否则可能导致外骨骼破裂，使毒液被血淋巴污染或导致蜘蛛死亡。 

应使用无菌或洁净的设备，避免毒液样本受到蜘蛛丝或人为来源的污染。尽管存在这些挑战，仍优先选择在保持蜘蛛存活的前提下采集纯净毒液的方法，而非通过腺体匀浆获取毒液（该方法无法将毒液成分与其他细胞蛋白分离）并导致蜘蛛死亡的方法。此外，必须确保样本迅速冷冻，以防止蛋白质降解。

毒液的提取会促进后续毒液的生成，从而刺激毒腺中毒液相关基因的表达。因此，由于本方案允许蜘蛛在耗尽毒液后存活，可在数天后（以处死蜘蛛的方式）解剖其毒腺，此时毒液基因的表达水平预期已足够用于转录本克隆等遗传学研究10,11。进行毒腺解剖时还必须采取若干重要预防措施。应特别注意使用无RNase污染的实验设备和试剂，以防止RNA降解。因此，建议使用可去除RNase和DNA污染的溶液擦拭镊子及其他非一次性使用的器械和操作表面。解剖操作应尽可能迅速完成，并在解剖后立即将组织冷冻，以进一步确保RNA的完整性。最后，解剖操作仅可在麻醉后的蜘蛛上进行，且需先迅速分离其头胸部与腹部。

综上所述，本文提供了一种经过验证的获取蜘蛛毒液和毒腺的实验方案。利用毒液和毒腺，可通过蛋白质组学和转录组学方法分离并鉴定其中的蛋白质和多肽成分。此外，毒液样本还可作为功能分析的起点，用于评估其组成分子的生物医学和药理学潜力。几乎所有蜘蛛都会产生毒液，而不同物种合成的毒液成分具有高度多样性，表明仍有大量毒液分子有待发现13。因此，本方案为研究蜘蛛毒液中丰富的生物活性分子资源提供了有效工具。

披露

作者声明无披露事项，且无竞争性经济利益。

致谢

感谢以下人员在本实验方案开发过程中提供的帮助：Chuck Kristensen、Greta Binford、Alex K. Lancaster、Konrad Zinsmaier 和 Mays Imad。质谱和蛋白质组学数据由亚利桑那蛋白质组学联盟（Arizona Proteomics Consortium）获得，该联盟得到了国家环境健康科学研究所（NIEHS）资助 ES06694（支持西南环境健康科学中心 SWEHSC）、美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）资助 CA023074（支持亚利桑那癌症中心 AZCC）以及亚利桑那大学 BIO5 研究所的支持。本研究的资金由美国国立卫生研究院（国家普通医学科学研究所）通过资助编号 1F32GM83661-01 和 1R15GM097714-01 提供给 Jessica E. Garb。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
神经和肌肉刺激器（电刺激器） Grass TechnologiesSD9http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html
电压表RadioShack22-223可使用任何通用的电压表/万用表替代
尖头轻质镊子Bioquip4748
Plasti Dip 绝缘涂层Performix可在 Ace Hardware 购买
25 G × 1½ 英寸 Precision Glide 皮下注射针头BD Medical305127
1 L 真空过滤瓶NalgeneDS4101-1000较小规格的烧瓶也可使用
布氏两件式漏斗，90 mmNalgene4280-0900
5 μl 毛细管内径管（微毛细管）VWR53508-375
固定用腻子条 Loctite可在 Ace Hardware 购买
Fisherbrand 通用超长镊子，长度：11-13/16 英寸Fisher10-316C
SSC 缓冲液，20× (pH 7.0)，分子生物学级PromegaV4261可用储备试剂配制（150 mM NaCl，15 mM 柠檬酸钠）
Eppendorf 带锁盖离心管，0.5 ml（适用于低温保存）Eppendorf22363611
Nalgene 杜瓦瓶，1 L，高密度聚乙烯，液氮台式储存瓶Thermo Scientific4150-1000
RNase Away 核酸酶清除剂VWR53225-514
超细镊子（解剖镊）EMS78310-0可使用类似高质量的尖头镊子替代
脚踏开关/踏板Linemaster Switch Corp.491-S
双叉式延伸夹具，带乙烯基覆盖套管，8.5 英寸VWR21570-007可使用类似型号替代
夹具支架VWR89084-746可使用类似型号替代，需适配延伸夹杆的直径
磁力底座（通过夹具支架固定延伸夹）VWR300042-270可使用能牢固固定延伸夹于固定位置的类似装置替代
塑料收集瓶（大号/40 打兰）Bioquip8940
棉质缝纫线Joann 布料与手工用品店7245855可使用类似产品替代

参考文献

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