本视频文章介绍了一种已成功建立的高通量流程，可用于感染并分析大量斑马鱼胚胎，从而为利用完整动物脊椎模型进行化合物筛选和药物发现提供了一种新的强大工具。
方法文章
高通量研究体系的建立与优化 表皮葡萄球菌 和 Mycobacterium marinum 感染作为药物发现的模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
斑马鱼作为一种具有高通量筛选潜力的完整动物模型，正日益成为药物发现临床前阶段筛选的重要工具。它们可用于填补早期基于细胞的检测与后续研究之间的空白 体内 在哺乳动物模型中进行验证，从而减少进入成本更高的啮齿类动物模型测试阶段的化合物数量。基于此，本文描述了一种利用斑马鱼作为模型的新颖高通量筛选流程 体内 用于研究的模型系统 表皮葡萄球菌 和 Mycobacterium marinum 感染。该体系可产生并分析大量同步且均一感染的胚胎。此外，该流程具有灵活性，用户可根据需要轻松整合其他平台以提高分析分辨率。斑马鱼与创新的高通量技术相结合，为药物测试与发现领域开辟了新的可能性，这不仅得益于全动物模型的优势，还得益于大量可利用的转基因品系，这些品系可用于解析新化合物的作用机制。
引言
迄今为止，斑马鱼（Danio rerio已成功建立为研究多种传染病的有效模型1斑马鱼胚胎提供了独特的 体内 由于其透明性以及存在大量表达荧光蛋白的转基因报告品系，使得成像成为可能。这种强大组合使得在免疫细胞与病原体（如）相互作用的过程中，能够实时追踪不同类型的免疫细胞 Mycobacterium marinum，最接近的亲缘种 M. tuberculosis2, 或 表皮葡萄球菌，生物材料相关感染的主要致病因素3-5根据研究目的，可采用不同的感染途径对斑马鱼胚胎进行感染6.
其中一种感染途径是将细菌注射到卵黄中。与其它方法相比，该方法的主要优势在于卵黄感染可通过机器人注射自动完成，显著缩短注射时间，并实现感染的高度可重复性7,8。
先前的研究利用斑马鱼作为高通量模型 体内 研究的模型系统 S. epidermidis 和 M. marinum 感染被证实成功7,8该系统可通过机器人对早期胚胎进行卵黄注射，并以荧光读数作为细菌载量的检测指标，从而实现对疾病进展的筛选。与此概念一致，该实验装置已得到优化，建立了一条高效、高通量的流程，能够产生大量均一感染的胚胎，并在多种化合物处理后，实时追踪感染进展。利用该成熟装置，可制备多达8,000个同步发育的胚胎用于疾病进展筛选，每小时可处理多达2,500个胚胎。胚胎根据其细菌载量通过自动化系统进行分选，确保获得感染程度均一的幼体群体。此外，为验证该装置的有效性，已测试了若干已知在哺乳动物中可抑制结核病进展的参照药物对感染胚胎的作用。 M. marinum E11 毒株或毒力更强的 M 毒株9.
本研究详细描述了已建立的高通量流程，该流程可用于产生大量感染的胚胎，并在发育过程中及化合物处理后对细菌的进展情况进行后续分析。
方案
1. 细菌菌株与培养条件
- 制备S. epidermidis 接种物
- 从添加了10 μg/ml 氯霉素的Luria Bertani（LB）琼脂平板上挑取若干单菌落的S. epidermidis菌株O-47（含有pWVW189衍生的mCherry表达载体，De Boer L. 未发表），在25 ml添加了10 μg/ml 氯霉素的LB培养基中，于37 °C过夜培养至对数中期。
- 取1 ml培养物在12,000 x g离心1分钟，随后用1 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）含0.3%（v/v）Tween-80洗涤3次。
- 测定600 nm处的光密度（OD600），并将细菌悬液用含2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮40（pvp40）的PBS稀释至OD600为0.3。注意：OD600为0.3时相当于1.0 x 108菌落形成单位/ml（cfu/ml）。
- 制备M. marinum 接种物
- 从添加了50 μg/ml潮霉素的Middlebrook 7H10琼脂平板（含10%（v/v）Middlebrook OADC增补剂）上挑取若干单菌落的M. marinum菌株M或E11（含有稳定表达mCherry的pSMT3-mCherry载体10），在10 ml Middlebrook 7H9液体培养基（含10%（v/v）Middlebrook ADC增补剂及50 μg/ml潮霉素）中，于28 °C过夜培养。
- 取1 ml培养物在12,000 x g离心1分钟，随后用1 ml无菌PBS含0.3%（v/v）Tween-80洗涤3次。
- 测定OD600，并将细菌悬液用含2%（w/v）pvp40的PBS稀释至OD600为0.3。注意：OD600为1时相当于1.0 x 108 cfu/ml。
2. 准备受精卵斑马鱼
- 将最多70条雄性野生型斑马鱼和50条雌性野生型斑马鱼分别放入大型繁殖容器中。注意：将雌鱼放置在大型繁殖容器的下部。
- 次日早晨移除隔离板，使斑马鱼开始繁殖。
- 通过集卵器收集大型繁殖容器底部的卵，并置于含有卵水（60 µg/ml Instant Ocean 海盐）的50 ml离心管中。
3. 注射针头
- 获取市售的定制玻璃毛细管针，其内径为 10 µm。
4. 注射实验方案
- 将100 ml含1% (w/v) 琼脂糖的蛋水煮沸，冷却至约40 ºC。将琼脂糖倒入自动显微注射仪用板中，并将1,024孔模具放入琼脂糖中。注意：待琼脂糖冷却后即可使用。
- 在自动显微注射仪的操作软件中点击“校准载物台”，然后选择“1024”孔阵列，将琼脂糖板放入显微注射仪中，并通过在屏幕上点击孔中心位置 来校准板位。
- 进入“针头菜单”并点击“校准针头夹持器”。
- 使用微量移液吸头向注射针中加入10 µl含100 cfu/nl S. epidermidis 或30 cfu/nl M. marinum 的pvp40，或仅使用pvp40作为对照注射。
- 将针头放入自动显微注射仪中，通过上下移动针头并在屏幕上点击针头位置来校准x、y方向位置。然后通过在屏幕上点击针尖位置来校准针头的z方向位置。
- 使用塑料移液管将胚胎分布到琼脂糖网格上，并去除多余的蛋水。将琼脂糖网格放入自动显微注射仪中。
- 进入“注射菜单”，在Femtojet设置菜单中将“注射压力”调整为200 hPa，“注射时间”设为0.2秒，“补偿压力”设为15 hPa，对应注射体积为1 nl。
- 点击“全部注射”以完成整块板的注射。
- 注射后用培养皿（92 x 16 mm）冲洗收集胚胎，每培养皿最多放置70个胚胎，并在28 °C下孵育。
5. 流式细胞仪分析
- 根据制造商的说明准备大颗粒流式细胞仪，并用卵水填充样品杯和鞘液容器。
- 在操作软件中，进入“PMT”菜单并使用以下设置：“红色”通道为 650 V，“绿色”和“黄色”通道为 0 V。然后进入“Thresholds”菜单并使用以下设置：“光密度”阈值信号：975 mV（COPAS XL 值：50），以及“飞行时间”（TOF）最小值为 320 μsec（COPAS XL 值：800），以减少碎片的干扰。
- 若仅分析而不分选胚胎，请转至步骤 5.4；若需将胚胎分析并分选至培养皿中，请转至步骤 5.5；若需将胚胎分析并分选至 96 孔板中，请转至步骤 5.6。
- 将胚胎放入样品杯中，点击“start”开始分析。当所有胚胎分析完成后，点击“stop”停止分析。点击“Store all”保存数据。注意：所有数据将以 TXT、LMD、DAT、CSV 和 BSRT 文件格式存储。请继续执行步骤 5.7 的操作流程。
- 将胚胎放入样品杯中，在“Sort”菜单中输入 70，设定每块板最多分选 70 个胚胎。在分选器下方放置一个空的培养皿，点击“Manual Sort”。当培养皿填满后，点击“Store all”保存数据。注意：所有数据将以 TXT、LMD、DAT、CSV 和 BSRT 文件格式存储。请继续执行步骤 5.7 的操作流程。
- 将胚胎放入样品杯中，在“Sort”菜单中输入 1，设定每个孔最多分选 1 个胚胎。将一个空的 96 孔板放入左侧板架中，点击“Fill plate”。当 96 孔板填满后，点击“Store all”保存数据。注意：所有数据将以 TXT、LMD、DAT、CSV 和 BSRT 文件格式存储。请继续执行步骤 5.7 的操作流程。
- 获取 TXT 文件以处理原始数据，使用以下数据筛选设置：“Status select”：40，若使用分选模块则“Status sort”：6。然后使用“红色”通道的总荧光信号数值计算平均值和平均值的标准误差。将这些数据集绘制成柱状图或散点图。
6. 药物处理
- 注射后3天（dpi），使用大颗粒流式细胞仪（步骤5.5）分析并分选感染M. marinum的胚胎，将其分为数量相等的两组。其中一组用目标化合物及其溶剂处理，另一组仅用溶剂处理（对照组）。对模拟注射的对照组进行相同处理，以检测抗生素的潜在副作用。
- 在4 dpi和5 dpi时重复分析（步骤5.5），并更换含有或不含化合物的胚胎培养水。
7. 高分辨率成像
- 在分析前10分钟，用含有0.02%（w/v）缓冲三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯，Tricaine）的卵水麻醉胚胎。
- 根据制造商的说明，准备脊椎动物自动筛选技术系统（Vertebrate Automated Screening Technology system）和大颗粒采样器（Large Particle Sampler）。
- 从“成像 – 目标 – 检测设置”菜单中选择与胚胎年龄相对应的参考图像。
- 从“成像 – 自动存储图像”菜单中选择脊椎动物自动筛选技术系统将拍摄的图片数量和方向。
- 将装有胚胎的96孔板（来自步骤5.6）放入大颗粒采样器的左侧板架中，然后点击“运行板”（Run plate）。
- 当检测到胚胎并正确定位后，使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）配备10倍平场干镜分别对头部和尾部进行成像，随后使用图像处理软件拼接图像。
结果
目前的结果表明，用于研究的高通量流程能够 S. epidermidis 和 M. marinum 感染已成功建立，且该方法可推广至其他感染模型。首先，使用大型繁殖容器（图1A)，依据 Adatto 发表的系统 等 (2011)11，能够在单次操作中产生大量同步的卵子，从而实现对产卵过程的高度控制。除了能够短时间内注射大量胚胎外，还改进了先前开发的自动显微注射系统7 被使用（图1A）。为了评估卵黄感染的最佳发育阶段，进行注射 S. epidermidis 和 M. marinum 在1细胞期至512细胞期的各个不同阶段均进行了操作，具体步骤依据Kimmel的描述进行 等 (1995)12.
在16至128细胞期之间注射100 cfu的S. epidermidis可获得最佳感染模式（图2）。细菌在卵黄内增殖3天，并从3 dpi开始扩散至胚胎体部。若在16细胞期之前进行注射，则从4 dpi起出现高死亡率；而在256细胞期之后注射则主要表现为细菌在卵黄内生长，几乎无细菌向胚胎体内扩散。细菌负荷量的定量通过大颗粒流式细胞仪进行荧光强度分析，方法如Veneman et al. (2013)8所述（图3）。
观察结果显示，E11菌株在16至128细胞阶段注射30个cfu的M. marinum为最佳发育时期（图4A），而毒力更强的M菌株则在16至64细胞阶段注射为最佳（图4B）。在这些时期注射的胚胎中，可见细菌在卵黄内生长，并扩散至整个胚胎（图7）。若在更早阶段感染两种菌株，则会出现非特异性的广泛细菌增殖，导致胚胎在感染后4天内死亡。相反，在较晚阶段注射的胚胎中，细菌负荷则局限于卵黄内。
接下来，使用大颗粒流式细胞仪进行预分选（图1B），可获得大量感染程度均一的鱼类样本，同时排除未感染或高度感染的胚胎（图5A 和 图6A）。预分选后，将感染 M. marinum 的胚胎暴露于利福平（Rifampicin）中，该药物为一线抗结核药物。既往研究表明，在200 μM剂量下使用利福平可有效降低斑马鱼体内的 M. marinum 感染水平7,13。借助高通量系统所产生的大量均一感染胚胎，本研究进一步开展了不同剂量药物处理实验。结果显示，感染 M. marinum M株并经12、24和200 μM利福平处理48小时的胚胎，其分枝杆菌感染水平呈剂量依赖性显著降低（图5B）。鉴于200 μM利福平在抑制感染方面效果显著，后续实验均采用该浓度。与前述结果一致，在使用 M. marinum E11株研究细菌负荷进展时，经200 μM利福平处理24小时后，亦观察到感染水平显著降低，并持续至后续时间点（图6B）。
此外，如果需要对这些胚胎进行高倍成像，可将其自动装载至96孔板中（图1C），随后利用装配了大颗粒采样器的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合脊椎动物自动化筛选技术系统对样品进行分析。
配备大颗粒采样器的脊椎动物自动筛选技术系统可安装在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或体视显微镜上。该设备可通过玻璃毛细管自动从96孔板或大量容器中加载活体或固定的胚胎，并将其在相机前方调整至所需角度（例如，背侧或侧向）。可通过内置相机或外部CLSM获取胚胎在各个方向上的图像（图7）。随后，胚胎将被转移至收集容器或废液容器中。
图1. 主要实验流程示意图。A) 将成年鱼放在一起交配，收集卵子，排列在琼脂糖板上并进行注射。B) 注射后的卵子在28 °C下孵育，并将进行预分选以备可能的药物处理。C) 随后通过大颗粒流式细胞仪和/或配备共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的大颗粒采样器/脊椎动物自动筛选技术进行分析。请点击此处查看该图的高清版本。
图2. 最佳细胞阶段的确定 S. epidermidis 卵黄注射 斑马鱼胚胎在1至512细胞期的不同发育阶段被显微注射到卵黄中，注射量为100 cfu的 S. epidermidis1到8细胞期注射的胚胎在卵黄中出现细菌生长，并从感染后第4天开始出现高死亡率。16到128细胞期注射的胚胎从感染后第3天起在卵黄及体内出现细菌生长。256到512细胞期注射的胚胎在卵黄内出现大量细菌生长。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3. 使用大颗粒流式细胞仪定量细菌负荷。将100 cfu的S. epidermidis注射至斑马鱼胚胎卵黄中。A) 自注射后至5 dpi期间，每天取10个胚胎为一组进行匀浆并直接涂板，结果显示基于两次生物学重复的平均指数生长趋势（误差棒 = 标准误SEM）。B) 大颗粒流式细胞仪分析显示未注射组与注射S. epidermidis组胚胎的平均荧光信号。每组条件分析了30–160个胚胎（误差棒 = 标准误SEM），不同字母表示经单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey事后检验（P < 0.001）判定具有统计学显著差异，ns：无显著差异。C) 10个感染S. epidermidis的胚胎组中cfu与平均荧光信号之间的相关性（误差棒 = 标准误SEM）。本图经Veneman et al. (2013)8修改。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 4. 确定注射 M. marinum 至卵黄的最佳细胞发育阶段。 斑马鱼胚胎在1至512细胞期的不同发育阶段均被注射了30 cfu的 M. marinum E11株和M株。A, B) 在1-8细胞期注射的胚胎中，两种菌株均表现出相似的扩散模式和死亡率。A) 使用E11株在16-128细胞期注射的胚胎表现出肉芽肿形成和系统性感染，而在256至512细胞期注射的胚胎则将细菌负荷限制在卵黄内。B) 使用M株在16-64细胞期注射的胚胎表现出类似肉芽肿结构的形成和系统性感染，而在128至512细胞期注射的胚胎则将细菌负荷保留在卵黄中。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5. 使用一线抗结核药物治疗 M. marinum 急性感染。 在 16 至 64 细胞期注射了 30 个菌落形成单位（cfu）M. marinum M 菌株的胚胎，在感染后第 3 天（3 dpi）通过大颗粒流式细胞仪进行检测，并根据排除未感染和/或高度感染的胚胎后分为两组。A) 两组中各个胚胎的荧光信号。B) 使用利福平（RIF）在 12、24 和 200 μM 剂量下处理 48 小时的胚胎，在感染后第 4 天（4 dpi）进行分析；其细菌负荷显著降低。C) 使用 DMSO 及利福平在 12、24 和 200 μM 剂量下处理 24 小时的胚胎的代表性 COPAS 图谱。细菌负荷及分布由红色峰表示。蓝色线代表 COPAS 分选的元件（4 dpf 斑马鱼胚胎）的图谱。每种条件下分析了 60–90 个胚胎。每个数据点代表一个单独的胚胎。数值以均值 ± 标准误（SEM）表示。ns：无显著差异。统计学显著性分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。请点击此处查看该图的高清版本。
图 6. 使用一线抗结核药物治疗 M. marinum 慢性感染。 在 16–64 细胞期注射了 30 个菌落形成单位（cfu）M. marinum E11 菌株的胚胎，在感染后第 3 天（3 dpi）通过大颗粒流式细胞仪进行检测，并根据排除未感染或高度感染胚胎后的结果分为两组。A) 两组中各个胚胎的荧光信号。B) 用利福平（Rifampicin, RIF）以 200 μM 浓度处理 4 天的胚胎，分析显示在给药 1 天后细菌负荷显著降低。每组分析了 90 个胚胎。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。不同字母表示同一处理组内不同时间点之间存在显著差异。* 表示与对照组相比具有显著差异。ns：无显著差异。统计学显著性分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验（P < 0.05）。图 B) 经修改自 Spaink et al. (2013)13。请点击此处查看该图的高清版本。
图7. 结果 M. marinum E11 卵黄注射成像使用 脊椎动物自动化筛选技术 和CLSM。 5 dpi fli1-egfp 的共聚焦Z轴层扫图像（拼接3张）14 胚胎 A) 活体胚胎显示增殖现象 M. marinum E11 细菌（红色）遍布全身。 B) 固定后5 dpi fli-egfp胚胎示意图 M. marinum E11 细菌（红色）遍布全身，与通过 L-plastin 免疫染色检测到的白细胞（浅蓝色）共定位15.
讨论
本文所述的高通量方法提供了一种快速且经济有效的流程，可用于筛选大量感染不同类型病原体的鱼类胚胎和幼体。使用大型繁殖容器替代传统的单个或家系繁殖缸，有助于更好地控制产卵过程，并产生更多同步发育的卵。借助改进后的自动化显微注射系统7，可在1小时内将多达2,500枚卵几乎全部注射于相同的细胞阶段。结合这些改进及优化的软件，能够注射的卵数量较以往显著增加，可用于以细菌增殖为读数的大规模药物筛选。然而，该方法目前仍仅限于卵黄注射；其他注射途径，例如Benard et al.（2012）6所述的方法，有望在不久的将来被整合到自动化显微注射系统中。
尽管这些方法是以斑马鱼筛选为基准建立的，但也可应用于其他鱼类物种。例如，已有研究表明，普通鲤鱼在药物筛选方面具有优势。与斑马鱼类似，普通鲤鱼的卵和早期胚胎具有透明性，但其主要优势在于单次产卵量可达数十万枚，并且存在近交系，可提供更为稳定的遗传背景16。
利用高通量大颗粒流式细胞仪对大量感染的胚胎进行分析。该设备可将已分析的胚胎分选至多孔板或培养皿中，因此特别适用于大量化合物的筛选。若需要更高的成像分辨率，则可调整实验装置，使大颗粒流式细胞仪技术用于初筛，随后以中等通量、更高分辨率对样品进行进一步分析。此过程可借助脊椎动物自动化筛选技术17,18实现。该设备能够自动从多孔板或批量容器中收集受精后2至7天的活体或固定胚胎，通过毛细管利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或体视显微镜进行360°成像，随后将胚胎分别排放至两个批量容器中，以便根据显微图像进行人工分选。未来的改进将实现在成像后直接将胚胎分选至多孔板中，从而能够随时间推移自动对大量单个胚胎进行CLSM筛选。假设在未来应用中，脊椎动物自动化筛选技术系统无需预先将幼体分配至多孔板，即可与大颗粒流式细胞仪技术直接连接，则将实现更为先进的分选能力。
本文描述了一种用于研究S. epidermidis和M. marinum感染的高通量实验体系的建立与优化，该模型可用于药物发现。研究表明，将细菌注射入卵黄后的感染结果取决于注射时胚胎的发育阶段。在16-128细胞期注射M. marinum E11株，或在16-64细胞期注射M株，所产生的感染模式与尾静脉注射相同2,6。然而，该实验体系的应用不仅限于细菌病原体的增殖研究。此前已有研究证明，可通过机器人系统注射含有DNA、RNA或吗啉寡核苷酸（morpholinos）的溶液，分别用于转基因、基因过表达和基因敲低研究13。此外，该体系还被证实可用于癌细胞增殖与迁移的研究。因此，该技术流程为在先天免疫背景下，针对传染病及癌症发生过程中多种信号机制的高通量筛选提供了一种多功能方法。这些筛选可与其他药物发现实验相结合，也可与所鉴定出的有效药物可能产生的毒性效应分析联合进行。
披露
J.S 是 Life Science Methods BV 的所有者，该公司生产本文所用的仪器。
致谢
我们感谢莱昂妮·德布尔和巴斯·扎特（阿姆斯特丹学术医学中心）向我们提供了 S. epidermidis O-47品系。我们感谢Rico Bongaarts、Francis Smet和Angela Comas（Union Biometrica）在COPAS XL和VAST BioImager分析方面提供的帮助与建议。感谢Davy de Witt、Ulrike Nehrdich和Laura van Hulst在斑马鱼饲养方面的支持，以及莱顿大学其他同事的有益讨论。本研究是BioMedical Materials研究所研究项目P5.03 IBIZA的一部分，由荷兰经济事务部共同资助，同时也属于荷兰经济事务部与荷兰教育、文化和科学部联合支持的Smart Mix计划（NWOA_6QY9BM）。额外的支持来自欧盟ZF-Health项目（FP7-Health-2009-242048），RMJ获得了欧盟初始培训网络FishForPharma（PITN-GA-2011-289209）中资深研究员的玛丽·居里奖学金资助。SJR获得了创新药物计划联合企业资助协议编号n°115337，其资源由欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）的财政资助以及EFPIA公司提供的实物捐助组成。作者进一步感谢莱顿大学基金（LUF）在机器人技术方面提供的资金支持，以及Cyttron在知识基础设施投资补贴决策项目（Besluit Subsidies Investeringen Kennisinfrastructuur）中提供的资助，该项目由荷兰科学研究组织为成像设施提供财政支持。COPAS系统的购置部分得到了地球与生命科学学部（ALW）的支持，资金来源于荷兰科学研究组织（NWO，834.10.004）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Middlebrook 7H10 琼脂 | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 肉汤 | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 271310 | |
| BBL Middlebrook 油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（OADC）增补剂 | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211886 | |
| BBL Middlebrook 白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC）增补剂 | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211887 | |
| LB 琼脂 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L5542 | 多个供应商 |
| LB 肉汤 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L3022 | 多个供应商 |
| 氯霉素 | Bio-connect, Huissen, 荷兰 | 16785.03 | 多个供应商 |
| 潮霉素 | Bio-connect, Huissen, 荷兰 | 25966.01 | 多个供应商 |
| 吐温-80 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | P1754 | 多个供应商 |
| 聚乙烯吡咯烷酮40 | Calbiochem, San Diego, California, USA | 529504 | 多个供应商 |
| 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine） | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | A5040 | |
| 琼脂糖 | Sphaero-Q, Gorinchem, 荷兰 | S103 | 多个供应商 |
| Instant Ocean 海盐 | Sera Marin, Heinsberg, 德国 | 5460 | |
| iSPAWN | Techniplast, Buguggiate, 意大利 | iSPAWN | |
| 自动化显微注射系统 | Life Science Methods BV, Leiden, 荷兰 | Automated microinjection system | |
| 复杂物体颗粒分析与分选仪 XL（COPAS XL） | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | COPAS XL | |
| 脊椎动物自动化筛选技术生物成像仪（VAST BioImager） | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | VAST BioImager | |
| LP 取样器 | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | LP Sampler | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems, Wetzlar, 德国 | TCS SL | |
| 注射针，内径 10 µm | Qvotek, Mississauga, 加拿大 |
参考文献
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