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利用 Jsubtomo 对电子冷冻断层成像重构结果中的病毒包膜糖蛋白刺突进行平均化处理

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DOI：

10.3791/51714

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2014年10月21日

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1Oxford Particle Imaging Centre, Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford

本文内容

摘要

本文介绍了一种结合电子冷冻断层扫描技术、亚断层平均化方法及计算软件包 Jsubtomo 来解析病毒膜糖蛋白复合物结构的研究方法。

摘要

包膜病毒利用其表面的膜糖蛋白介导进入宿主细胞的过程。对这些糖蛋白“刺突”进行三维结构分析通常在技术上具有挑战性，但对于理解病毒的致病机制以及药物设计至关重要。本文介绍了一种通过计算平均化冷冻电子断层扫描数据来确定病毒刺突结构的实验方案。冷冻电子断层扫描是电子显微镜中的一种技术，可用于获得形态多变的生物样本（例如处于接近天然、冷冻水合状态的膜病毒）的三维断层体积重建图像，即断层图。这些断层图能够以三维形式展示感兴趣的结构，尽管分辨率较低。为了获得重复结构基序（如病毒糖蛋白刺突）的更高分辨率细节，需要对子体积（即亚断层图）进行计算平均化。本文概述了一种使用 Jsubtomo 软件包进行亚断层图对齐和平均化的详细计算方法。该方法可将病毒糖蛋白刺突结构的分辨率提升至 20–40 Å 范围，并可用于研究病毒颗粒膜上刺突之间的高阶相互作用。文中以布尼亚韦拉病毒（Bunyamwera virus）为例展示了典型结果，该病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）。布尼亚病毒科是一类结构多样、对人类和动物健康构成威胁的病原体。

引言

电子冷冻断层扫描是一种电子冷冻显微镜成像技术，能够计算复杂生物样品的三维（3D）重构图像。适用的样品范围包括纯化的大型分子复合物1、纤维2、包被囊泡3、多形性膜病毒4、完整的原核细胞5，甚至完整真核细胞的较薄区域6。在完成倾斜系列数据采集后，可使用多种成熟的软件包（包括 Bsoft7 和 IMOD8）计算出三维断层图像数据体，即断层图。

利用电子冷冻断层扫描技术研究生物样品时，存在两个固有因素限制了对相应断层图像的生物学解释。首先，由于在对生物材料施加电子束时，若剂量过高会导致显著的辐射损伤，因此断层数据中的信噪比通常非常低。其次，在数据采集过程中受限于样品倾斜角度的范围，导致物体的某些视角信息缺失，从而在断层图像中产生所谓的“缺失楔形”（missing wedge）伪影。然而，如果断层图像中包含重复且相同的结构（例如大分子复合物），则可通过有效平均这些结构来克服上述两种限制9-12。

在对断层成像重构结构进行平均之前，必须先找到感兴趣的对象并将其调整至相同的方向。可通过在断层图像体积中使用模板匹配的方法进行交叉相关，从而定位此类结构，该方法通常被称为模板匹配13。此匹配过程中所使用的模板可来源于电子冷冻显微镜或结合三维重构的电子冷冻断层扫描，也可来源于原子结构模拟的密度图。目前已开发出多种计算软件包用于执行这些任务11。

对膜病毒（如 HIV-1）的糖蛋白刺突进行平均化处理，已成为研究其结构的一种尤为成功的方法14-16。理解这些结构对于揭示病毒与宿主相互作用的分子基础，并指导抗病毒药物和疫苗设计的研发至关重要。尽管大分子晶体学是针对单个病毒糖蛋白及其复合物进行高分辨率（通常优于 4 Å）结构分析的首选技术，但该方法所得的X射线结构来源于从病毒颗粒天然膜环境中分离出的蛋白质，因此在病毒颗粒背景下，糖蛋白的高级有序结构等重要细节仍然缺失。另一方面，电子冷冻显微镜结合单颗粒重构技术仅适用于具有二十面体对称性的病毒颗粒17,18。因此，电子冷冻断层成像结合亚体积对齐技术应运而生，成为一种互补手段，可用于原位研究形态不规则、多形性病毒的糖蛋白刺突结构 in situ。

我们开发了一款名为 Jsubtomo（www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo）的软件，用于断层图像子体积的检测、对齐和平均。Jsubtomo 已被应用于多种细胞和病毒结构的结构解析19-26。本文概述了一种详细的实验方案，可用于确定病毒表面刺突蛋白的结构。为避免因噪声相关导致平均结构过度优化，采用了“黄金标准”优化策略10,27。最后，讨论了典型结果的可视化与解释策略。

方案

本文概述了一种用于病毒糖蛋白刺突结构的计算比对及后续平均化处理的详细方案。该方案遵循图1所示的工作流程，结合了使用初始模板结构对刺突进行自动搜索以及采用黄金标准的结构精修方法。

本方案的输入数据为病毒颗粒的一组断层扫描重构图像。每个断层图像包含一个或多个病毒颗粒。首先，手动选取少量刺突蛋白作为初始样本，用于进行平均化处理并独立优化生成两个模型。随后利用这两个模型自动定位所有病毒颗粒上的刺突蛋白。最后，分别进行两次独立的优化，将得到的平均结构进行比较与合并，从而获得最终的结构模型。

通过 Jsubtomo 软件包中的程序演示了精细化方法。Bsoft 软件包28中的程序用于常规图像处理任务，分子图形软件 UCSF Chimera29用于结果的可视化。各个程序的名称以斜体表示，文件格式则用大写的文件扩展名表示。

病毒粒子建模工作流程图；断层扫描数据预处理、模型优化、结构平均化。
图1：从形态多变的包膜病毒中解析糖蛋白刺突复合物结构的通用策略。 图中编号对应实验方案中的不同部分。请点击此处查看该图的高清版本。

1. 从完整尺寸断层图中提取病毒亚体积

  1. 在断层图中手动挑选病毒颗粒。
    1. 在 bshow 中打开一个断层图文件。使用颗粒挑选工具定义病毒颗粒的中心坐标。重复此步骤，直至所有病毒颗粒均被处理。将病毒颗粒坐标保存为 STAR 文件。
    2. 重复步骤 1.1.1，直至所有断层图均被处理。记录病毒颗粒直径（以像素为单位）。
      注意：如果在断层图中难以观察到刺突蛋白，可使用 bfilter 对断层图进行低通滤波，分辨率设为 80–Å（参数“-bandpass 80,10000”）。
  2. 以提取模式（参数“--mode extract”）运行 jsubtomo.py，将病毒颗粒子体积提取为独立的体积文件。使用步骤 1.1.1 中保存的 STAR 文件作为输入文件。
    1. 设定尺寸（参数“--size”），使其比数据集中最大的病毒颗粒大约 25%。例如，若病毒颗粒直径约为 200 像素，则使用 250 × 250 × 250 像素的尺寸。
    2. 病毒颗粒体积的输出文件将为 MAP 格式。此外，为每个病毒颗粒体积生成相应的 STAR 文件（参数“--output”）。
  3. 在 bimg 中对病毒颗粒体积进行归一化处理（参数“-rescale 0,1”）。

2. 生成两个独立的初始模型

  1. 在病毒颗粒子体积中选取一部分刺突蛋白。
    1. 在 bshow 中打开一个病毒颗粒子体积的 MAP 文件。通过工具箱窗口中的颗粒挑选工具，定义一个刺突蛋白的中心坐标。重复此步骤，直到所有清晰可辨的刺突蛋白均被处理完毕。将刺突蛋白坐标保存为 STAR 文件。
    2. 如有必要，对其他病毒颗粒重复步骤 2.1.1，直至处理约 200 个糖蛋白刺突。记录刺突蛋白的像素尺寸。
      注意：约 200 个刺突蛋白仅为粗略指导值，某些应用可能需要更多数量。若条件允许，应尽量挑选处于不同取向的刺突蛋白，避免仅挑选顶部视图。
  2. 运行 jviews.py 为刺突蛋白分配初始视角向量。使用步骤 2.1.1 中生成的 STAR 文件作为输入文件。
    注意：该视角向量用于近似表示刺突蛋白相对于病毒颗粒的方向。
    1. 使用中心坐标为球形病毒颗粒分配视角。例如，若病毒颗粒在经过步骤 1.2 处理后，位于尺寸为 250 × 250 × 250 像素的盒子中心，则其中心坐标为 125,125,125 像素（选项“--Radial 125,125,125”）。
    2. 为丝状病毒颗粒分配视角时，使用步骤 2.1.1 中定义的 STAR 文件作为输入文件，在 bshow 中打开每个病毒颗粒子体积。利用丝状结构挑选工具定义丝状体的两个端点，并保存 STAR 文件。重复此步骤，直至所有 STAR 文件均被更新，然后使用更新后的 STAR 文件作为输入文件运行 jviews.py（--option Segment 选项）。
  3. 使用 jsubtomo_create_mask.py 生成实空间掩模。确保该实空间掩模的尺寸与后续用于平均结构的尺寸一致（见步骤 2.6.2），且足够大以包含刺突蛋白及其下方膜区域的一小片区域。
  4. 使用 jsubtomo_create_wedgemask.py 生成倒易空间掩模。倒易空间掩模用于排除因单轴断层数据采集所导致的“缺失楔形”区域。确保其尺寸与后续用于平均结构的尺寸一致（见步骤 2.6.2）。
  5. 使用 jsubtomo_evenodd.py 及步骤 2.2 中生成的 STAR 文件，生成一个定义属于集合“1”和“2”的病毒颗粒的选择文件（SEL 文件）。
  6. 使用 jsubtomo_create_averages.py 生成两个初始平均结构。
    1. 使用步骤 2.5 中生成的 SEL 文件作为输入文件。
    2. 设定尺寸参数（“--size”），至少比刺突蛋白的最大维度大 32 像素。例如，若刺突蛋白长度约为 40 像素，则使用 72 × 72 × 72 像素的尺寸。
    3. 对平均结构施加高对称性（例如，c100）（参数“--symmetry c100”），以近似实现沿刺突蛋白长轴的圆柱形平均。利用对称化处理降低初始平均结构中的噪声。
    4. 为项目输出文件指定唯一名称（参数“--suffix”）。
    5. 使用步骤 2.3 中生成的实空间掩模来屏蔽背景信号（参数“--mask”）。使用步骤 2.4 中生成的倒易空间掩模来校正因缺失楔形导致的信号损失（参数“--Mask”）。

3. 两种初始刺突蛋白模型的金标准迭代比对与平均化

使用 jsubtomo_iterate_gold.py 对第 2 节中生成的两个初始模型进行迭代对齐和平均。

  1. 第一阶段。此阶段的目标是优化视图向量的方向。输入文件为步骤 2.5 中生成的 SEL 文件。
    1. 使用8度角采样（参数“--angles 8,8,8”）。
    2. 允许刺突视角向量方向发生16度的变化（参数“--thetaphilimit 16”），但保持围绕刺突长轴的旋转角度固定（参数“--alphalimit 0”）。
    3. 允许微小的平移变化（例如，5 像素）以校正手动选取峰时可能产生的误差（参数“--shiftlimit 5”）。
    4. 应用高对称性（例如，c100）对平均值（参数“--symmetry c100”）进行处理，以近似获得刺突蛋白长轴周围的圆柱形平均。
      注意：对称化用于降低平均值中的噪声。
    5. 使用步骤 2.3 和 2.4 中生成的实空间掩模和倒易空间掩模，分别屏蔽周围的尖锐信号并校正缺失楔形区域（参数分别为 “--mask” 和 “--Mask”）。
    6. 使用步骤 2.6 中生成的两个 MAP 文件（文件名中分别带有“even”和“odd”标签）作为模板（参数分别为“--Template1”和“--Template2”）。
    7. 在50-Å分辨率（参数“--resolution”）下应用低通滤波，以防止取向偏差。
    8. 应用2倍 bin 因子以加快精细处理（参数“--bin 2”）。
    9. 运行5次迭代的比对与平均（参数“--firstiter 1 --lastiter 5”）。
  2. 第二阶段。此阶段的目标是优化视图向量周围的倾角。输入文件为步骤 3.1.9 输出的 SEL 文件。
    1. 通过在步骤 3.1.9 中生成的最后一次迭代的低通滤波 MAP 文件（文件名中以标签“_lp”表示）来测量尖峰的精确尺寸 bshow. 参照步骤2.3的方法，生成一个新的实空间掩模，用于定义该刺突蛋白，同时排除大部分膜结构及邻近的刺突。
      注意：掩模的最佳尺寸取决于尖峰的大小和特征。
    2. 使用8度角采样（参数“--angles 8,8,8”），与之前相同。
    3. 允许围绕尖峰视图向量的角度发生180度变化（参数“--alphalimit 180”），但保持theta和phi角度固定（参数“--thetaphilimit 0”）。
    4. 不要允许任何平移变换（参数“--shiftlimit 0”）。
    5. 平均处理时不要应用任何对称性（省略参数“--symmetry”）。
    6. 使用步骤 2.4 中生成的倒易空间掩模来校正缺失楔形区域的影响。
    7. 使用步骤 3.1.9 最后一次迭代中生成的两个未施加对称性的 MAP 文件（文件名中以标签 “even_nosym” 和 “odd_nosym” 标识）作为模板（参数分别为 “--Template1” 和 “--Template2”）。
    8. 在首次迭代中应用50-Å分辨率的低通滤波（参数“--resolution”），以防止对齐偏差。在后续迭代中，根据两个独立平均结果之间的黄金标准傅里叶壳层相关性（FSC）自动调整滤波参数（参数“--adaptivefilter”）。采用0.143作为判定标准（参数“--fsccrit 0.143”）。除非已对断层图像应用了CTF校正，否则不允许超过对比度传递函数（CTF）首个零点的分辨率进行优化（参数“--minhires”）。
    9. 运行5–10次比对与平均化迭代例如，参数“--firstiter 6 --lastiter 15”）。监测报告分辨率的变化，当未观察到显著变化时，可停止该过程。
  3. 通过检查文件名中标记为“_lp”的低通滤波后的MAP文件，评估结构的对称性程度 嵌合体. 例如如果该刺突蛋白为三聚体复合物，则应能观察到三重对称性。
  4. 第三阶段。此阶段的目标是利用正确的对称性进一步优化视图向量周围的倾转角度。输入文件为步骤 3.2.9 输出的 SEL 文件。参数设置与步骤 3.2 相同，仅有少数例外：
    1. 允许在尖峰视角向量周围进行适当的角度调整。例如，如果结构具有三重对称性，则允许α角变化60度（参数“--alphalimit 60”）。
    2. 应用正确的对称性（例如，c3）在平均值上（参数——对称性 c3”）。
    3. 使用步骤 3.2.9 中上一次迭代生成的两个 MAP 文件（文件名中带有“even”和“odd”标签）作为输入模板文件（参数“--Template1”和--Template2）。
    4. 运行5–10次比对与平均化迭代例如，参数“--firstiter 16 --lastiter 25”）。监测报告分辨率的变化，当未观察到显著变化时，可停止该过程。
  5. 第四阶段。此阶段的目标是同时精确优化所有三个角度。输入文件为步骤 3.4.4 输出的 SEL 文件。参数设置与步骤 3.4 相同，但有以下几项例外：
    1. 允许在刺突视角向量周围的角度有8度的变化（参数“--alphalimit 8”），以及刺突视角向量方向有8度的变化（参数“--thetaphilimit 8”）。将取向优化至4度精度（参数“--angles 8,8,8 --iterate 2”）。
    2. 允许微小偏移（例如，5 像素）以校正先前比对步骤中的不准确之处（参数“--shiftlimit 5”）。
    3. 使用步骤 3.4.4 中上一次迭代生成的两个 MAP 文件（文件名中带有“even”和“odd”标签）作为输入模板文件（参数“--Template1”和--Template2）。
    4. 运行5-10次比对与平均化迭代例如，参数“--firstiter 26 --lastiter 35”）。监测报告分辨率的变化，当未观察到显著变化时，可停止该过程。

4. 用于模板匹配的种子生成及其与病毒表面的对齐

  1. 在病毒颗粒表面均匀生成用于模板匹配的种子，并通过运行为这些种子分配初始视角向量 jviews.py使用步骤1.2.2中生成的STAR文件作为输入文件。生成的种子数应约为预期尖峰数量的1.5倍。
    注意：该视图向量近似于最靠近每个种子点的尖峰方向。
    1. 为在近似球形的病毒颗粒上生成均匀分布的种子（参数“--Even”），请提供半径（参数“--radius”）、角间距（例如种子的角度（参数“--angle 20”）和病毒粒子的中心坐标 例如，如果病毒粒子在经过步骤1.2处理后，位于一个尺寸为250 × 250 × 250像素的盒子中心，则中心坐标为125,125,125像素（选项“--origin 125,125,125”）。
    2. 为在丝状颗粒上生成均匀分布的种子，请使用参数“--Filament”，并指定半径以及螺旋对称参数（上升量和扭转角）。
      注意：此处使用的螺旋对称参数仅作为定义均匀分布种子位置的便捷方法，无需反映纤丝上刺突的实际排列顺序。
  2. 按照第2节所述方法，生成病毒表面的两个独立平均值。
    1. 使用“1”和“2”集合定义属于病毒颗粒的SEL文件 jsubtomo_evenodd.py 以及在步骤 4.1 中生成的 STAR 文件
      注意：为确保数据集的独立性，病毒颗粒先前被分配至“1”组和“2”组的任何分组必须保持不变。
  3. 优化种子的位置。
    1. 除非另有说明，否则按照步骤 3.1 中的指示操作。使用步骤 4.2.1 中生成的 SEL 文件作为输入文件。
    2. 允许种子仅沿膜的法线方向移动（参数“--zshiftlimit”）。根据病毒颗粒偏离理想球形几何结构的程度，调整允许的移动量例如，参数 --zshiftlimit 25”）
    3. 使用步骤4.2中生成的两个MAP文件（文件名中带有“even”和“odd”标签）作为输入模板文件（参数“--Template1”和--Template2）。
    4. 使用唯一的后缀以避免覆盖原始输入的 STAR 文件（例如参数“--suffix _seeds”
    5. 使用4倍 binning 以加快计算速度（参数“--bin 4”）和低通滤波器例如参数“--resolution 50”
  4. 使用优化后的种子STAR文件生成Chimera标记文件（CMM） jviews.py （参数“--cmm”）。通过在CMM文件（以及相关的病毒颗粒MAP文件）中打开来检查种子 嵌合体 确保提纯后的种子相对于病毒膜正确对齐。
    注意：可使用不同颜色来区分不同的标记物组（参数“--color”）。或者，可根据标记物之间的互相关系数对其着色例如，参数“--fomcolor 0.1,0.3”）

5. 刺突蛋白结构的金标准迭代比对与平均化

使用局部模板匹配方法，在优化后的种子点周围自动定位病毒颗粒亚体素中的所有刺突蛋白，并对定位到的刺突蛋白进行比对和平均。采用通过手动挑选的部分刺突蛋白所生成的平均结构作为初始模板。

  1. 在种子点周围执行局部模板匹配，以利用程序对所有峰电位进行平均 jsubtomo_iterate_gold.py. 除非另有说明，否则请按照步骤 3.5 中的说明进行操作。
    1. 输入文件是步骤 4.3 中生成的优化种子的 SEL 文件。
    2. 为视图向量角度设置足够大的限值。 例如，如果每20度生成一次种子（步骤4.1），则使用略大于该值一半的角度（参数“--thetaphilimit 12”）。允许在尖峰视图向量周围适当调整角度。
    3. 允许种子在膜平面内移动（参数“--xyshiftlimit”）。 例如。，如果种子与种子之间的距离为25像素，则总位移应略大于该距离的一半（例如参数“--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10”
      注意：如果在步骤 3.5 中生成的 MAP 文件与种子到病毒颗粒中心的距离不同，则可能需要额外的平移校正。
    4. 使用步骤3.5中生成的两个MAP文件（文件名中标记为“even”和“odd”）作为输入模板文件（参数“--Template1”和--Template2）。
    5. 使用步骤3.5中生成的MAP文件的当前分辨率（参数 --resolution）。
    6. 运行5-10次模板匹配、比对与平均化迭代过程（例如参数“--firstiter 1 --lastiter 10”）。监测报告分辨率的变化，当未观察到显著变化时，可停止该过程。
    7. 每次迭代后，排除重叠的匹配结果。 例如。如果峰的宽度为30像素，则排除与其他峰距离小于30像素的峰（参数“--mindist 30”）。
    8. 排除交叉相关系数较低的匹配结果。例如，对每个病毒粒子仅保留最佳的 75% 峰值信号（参数“--topp 75”）。
      注意：交叉相关系数较低的命中结果可能代表假阳性结果。

6. 结果的可视化

  1. 在 chimera 中打开刺突蛋白的优化结构，用于原子结构的可视化与拟合。
    1. 使用第 5.1.6 步最终迭代中生成的低通滤波 MAP 文件（以标签“lp”表示）作为输入文件。
    2. 使用第 5.1.6 步中指定的分辨率，在 chimera 的“Fit in Map”工具中进行基于交叉相关的拟合。
  2. 使用 jsubtomo_create_model.py 创建病毒颗粒的复合模型。
    1. 使用第 5.1.6 步最终迭代中生成的低通滤波 MAP 文件（以标签“lp”表示）作为输入 MAP 文件（参数“--Template”）。
    2. 使用第 5.1.6 步最终迭代中生成的 STAR 文件作为输入 STAR 文件。
    3. 使用第 3.2.1 步中生成的掩膜文件，以校正复合模型中重叠的密度信号（参数“--mask”）。
    4. 指定待生成的病毒颗粒 MAP 文件的尺寸，以获得相同大小的复合模型（参数“--size”）。
  3. 在 chimera 中打开复合模型进行可视化。

结果

我们展示了上述亚断层平均化工作流程在布尼亚韦拉病毒（Orthobunyavirus，Bunyaviridae科）包膜糖蛋白复合物中的应用，所用数据集为先前已发表的数据24。数据采集与优化参数列于表1中。一个代表性断层图显示在图2中。

参数（单位）数值
数据采集
电压（kV）300
校准放大倍数（X）111,000
像素尺寸（Å）5.4
估计剂量（e–/ Å2）100
欠焦量（μm）4.0–4.5
第一CTF零点（Å）a26–30
倾斜范围（°）–60–60
倾斜采样间隔（°）3
数据与精修
断层图像数量11
病毒颗粒数29
每个病毒颗粒的种子数106
种子总数3,074
检测到的刺突蛋白数1,346
去除重叠后的刺突蛋白数1,401
基于互相关选择后的刺突蛋白数1,022
纳入最终平均结构的刺突蛋白数1,022
对称性C3
角度采样间隔（°）8
精修中使用分辨率范围（Å）42–334
最终分辨率估计值（Å）b35

表1：布尼亚乌拉病毒数据收集与精修统计。
a CTF，对比度传递函数。
b 使用两个独立精修结构之间的傅里叶壳层相关性计算，阈值为0.143。

病毒样颗粒结构；冷冻电子显微镜图像；纳米结构分析。
图 2：布尼亚韦拉病毒颗粒断层图像的切片。 每个病毒颗粒边缘可见多个刺突的侧面视图，以箭头标示。该断层图像已进行低通滤波至 60 Å。比例尺为 100 nm。

首先，我们利用205个手动挑选的刺突蛋白对初始模型进行了优化（图3）。最中心刺突蛋白的三重对称性在未施加任何对称性约束的情况下已清晰可见（图3B），并在后续的多轮优化中被施加（图3C）。为了在病毒颗粒表面自动检测所有刺突蛋白，我们在每个病毒颗粒上以43 nm为半径、20度为间距生成了106个初始种子点（图4A），并迭代优化其相对于膜的位置（图4B）。

三维分子表面模型，顶部和侧面视图示意图，结构分析，计算研究。
图3：初始模板结构的优化。（A） 基于手动定义的刺突位置构建的圆柱对称平均（C100）模板。（B） 在未施加任何对称性（C1）的情况下经过五轮优化后得到的平均密度图，显示刺突具有三重对称特征。该模型的分辨率为48 Å。（C） 在施加三重对称性的条件下经过五轮优化后，刺突的平均分辨率达到41 Å。

显示指示方向的向量的圆形图，提示分子或结构分析。
图 4：种子的优化。 A-B) 显示了在图 2中一个病毒颗粒密度图上，优化前（A）和优化后（B）的部分种子。图（B）中的种子根据相应的互相关系数进行了颜色编码（蓝色表示相关性低，红色表示相关性高）。

选取相关性最高的糖蛋白刺突区域（去除重叠后排名前75%，约1000个刺突）用于计算最终的平均结构。该平均结构的分辨率达到35 Å（图5）。结果显示，中心区域呈现三聚体刺突结构，并包含来自周围六个相邻刺突的部分贡献。通过将结构置于已知位置计算得到的病毒颗粒复合模型，揭示了刺突在病毒颗粒表面的分布情况（图6A）。偶尔可观察到刺突在局部区域呈现有序排列的斑块（图6B）。

蛋白质结构的3D表面模型；显示偶数、奇数和平均构型的顶视图和侧视图。
图5：经过模板匹配后糖蛋白刺突层局部区域的优化结构。（A-B） 展示了从数据的两半分别重建的两个“偶数”和“奇数”密度图。这两个图谱表现出高度相似性，验证了该方法的可靠性。由于两个图谱完全独立重建，因此刺突长轴周围的取向有所不同。（C）展示了两个图谱的平均结果，最终分辨率为35 Å。

蛋白质结构模型（A）和密度图（B），显示分子表面可视化。
图6：布尼亚韦拉病毒颗粒上刺突蛋白的排列。（A）病毒颗粒的复合模型。视图向量（棒状）表示刺突蛋白的取向。颜色表示每个刺突蛋白与模板结构之间的交叉相关性（蓝色表示相关性低，红色表示相关性高）。（B）有序刺突蛋白区域的放大图。

讨论

了解病毒包膜表面病毒糖蛋白刺突的结构，对于理解病毒复制机制以及开发用于治疗和预防感染的疗法至关重要。电子冷冻显微镜结合单颗粒平均技术已成为解析包膜病毒颗粒结构（包括糖蛋白刺突）最常用的方法。然而，该方法仅适用于具有二十面体对称性的病毒。本文通过应用电子冷冻断层扫描技术及Jsubtomo中的子层析图平均方法，提出了一种通用实验方案，可用于确定那些无法通过其他现有结构生物学方法解析的多形性包膜病毒上的糖蛋白刺突结构。我们的代表性结果表明，该方法的分辨率足以揭示完整病毒颗粒上糖蛋白刺突的结构域架构、寡聚化状态及其高级有序排列特征。

本方案中最关键的步骤是构建两个相互之间具有统计学独立性的可靠起始模型。成功执行此步骤的前提是，糖蛋白刺突足够大且彼此之间未过于紧密堆积，从而能够在断层图中清晰识别单个刺突并进行手动挑选，进而获得两个独立的模型并进行平均。如果此方法不可行，可尝试对方案进行两种修改。第一种方法是通过首先定义两个随机的子断层图子集，然后分别对这些子集内的子断层图进行平均，从而构建两个独立的随机模型30。第二种方法是，若已通过其他方法（例如X射线晶体学）获得了分离刺突的结构，则可将其用作起始模型。然而，必须注意使用低分辨率截断值（50–70 Å）对该模型进行低通滤波，因为只有在此分辨率以上，下一轮精细结构中得到的两个模型才具有统计学独立性。鉴于这一局限性，推荐采用前一种方法。

本方案可达到的分辨率取决于四个主要因素：i. 数据采集策略及输入数据的质量，ii. 子断层图像的数量，iii. 子断层图像的对齐精度，以及 iv. 结构的异质性。前两个限制因素可通过使用高信噪比的直接电子探测器结合CTF校正断层成像技术和自动化数据采集在很大程度上得以克服，而对齐精度还受到目标结构自身大小和形状的影响。当将本方案应用于缺乏显著特征的小型突起结构时，可将Fab片段结合至突起上，以提高对齐精度，从而提升分辨率31。最后，若待平均的结构存在多种构象，可采用子断层分类方法对不同构象分别进行平均。为此，Jsubtomo与Dynamo软件包集成，提供强大的子断层图像分类功能9。

上述方案可与分离病毒糖蛋白的X射线晶体学研究相互补充。晶体结构可拟合到亚断层平均图中，从而获得糖蛋白相对于病毒颗粒膜的精确定向。该方法的应用无疑将继续深化人们对包膜病毒结构与病理生物学的理解。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了芬兰科学院（J.T.H. 项目编号：130750 和 218080）、惠康信托基金会（T.A.B. 项目编号：090532/Z/09/Z；089026/Z/09/Z）以及英国医学研究理事会（J.T.H. 和 T.A.B. 项目编号：MR/J007897/1；T.A.B. 项目编号：MR/L009528/1）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Jsubtomo（版本 1.3.1）牛津大学不适用www.opic.ac.uk/jsubtomo
Bsoft（版本 1.8.7）美国国立关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所，美国国立卫生研究院不适用bsoft.ws
UCSF Chimera加州大学旧金山分校不适用www.cgl.ucsf.edu/chimera

参考文献

  1. Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
  2. Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
  3. Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
  4. Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
  5. Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
  6. Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  7. Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
  8. Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  9. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
  10. Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
  11. Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).
  12. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  13. Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
  14. Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
  15. Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
  16. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
  17. Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
  18. Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
  19. Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
  20. Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
  21. Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
  22. Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
  23. Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
  24. Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
  25. Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).
  26. Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
  27. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
  28. Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
  29. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
  30. Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
  31. Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).

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