Summary
Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d'épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant> 6 mois.
Abstract
Sein carcinome canalaire in situ (CCIS), par définition, est la prolifération des cellules épithéliales néoplasiques dans les limites de la conduite du sein, sans porter atteinte à la membrane basale de collagène. Bien CCIS est un précurseur non obligatoire pour les cancers du sein invasifs, les mécanismes moléculaires et les populations de cellules qui permettent la progression vers un cancer invasif ne sont pas complètement connus. Pour déterminer si les cellules souches capables d'invasion existaient au sein de la population de cellules CCIS, nous avons développé une méthodologie de collecte et de culture de tissu stérile maternel au moment de la chirurgie, sans perturbation enzymatique de tissu.
Tissu mammaire stérile contenant des segments canalaires est récolté à partir de tissu mammaire excisé chirurgicalement après examen pathologique de routine. Tissu contenant DCIS est placé en milieu riche en nutriments, contenant l'antibiotique, sans sérum, et transporté au laboratoire de culture de tissus. Le tissu mammaire est également dissected pour isoler les zones calcifiées. Morceaux de tissu du sein multiples (organites) sont placés dans un volume minimal de milieu sans sérum dans un flacon muni d'un couvercle amovible et cultivées dans un incubateur à CO2 humidifié. Populations de cellules épithéliales et fibroblastes émergent de la organoïde après 10 - 14 jours. Mammospheres former spontanément sur et autour de la monocouche de cellules épithéliales. Populations spécifiques de cellules peuvent être récoltées directement du ballon sans perturber les cellules voisines. Notre système de culture de tissu non-enzymatique révèle fiable cytogénétique anormaux, des cellules progénitrices invasives de lésions humaines fraîches de DCIS.
Introduction
La prolifération des cellules épithéliales dans les limites de canaux du sein et les alvéoles (carcinome canalaire in situ) est reconnu comme un précurseur obligatoire à canalaire infiltrant et le carcinome lobulaire. Néanmoins, les mécanismes moléculaires et la dynamique des populations de cellules qui permettent la progression vers un cancer invasif sont mal comprises. Élucider les mécanismes de survie utilisées par les cellules de carcinome du sein pré-invasives, ou toute tumeur pré-invasive, peut révéler des stratégies thérapeutiques pour le meurtre, voire d'empêcher, les tumeurs pré-invasives 1. Cependant, les méthodes simples et peu coûteuses pour l'étude fonctionnelle des lésions pré-invasives humaines ont fait défaut. Bien que la monocouche de culture in vitro de lignées de cellules transformées est une méthode de laboratoire établi, le phénotype et le génotype de ces lignées cellulaires immortalisées ne parvient pas à récapituler l'état moléculaire des cellules tumorales humaines primaires 2. En outre, même la lignée de cellules MCF-10A non-tumorigène, qui RecApitulates 3-D architecture de la glande mammaire, ne représente pas de manière adéquate le phénotype fonctionnel et caractéristiques moléculaires de la lésion du sein pré-invasive d'un patient individuel 3,4.
Pour déterminer si les cellules souches néoplasiques comme capables d'invasion existaient dans le carcinome canalaire in situ (CCIS) population de cellules, nous avons développé une méthodologie de collecte et de culture de tissu stérile maternel au moment de la chirurgie (Figure 1) 5. Notre ex vivo sein du système de culture organoïde ne dépend pas de perturbation enzymatique de tissu, matrice de membrane basale de l'extrait, ou l'appauvrissement des fibroblastes, pour l'isolement et la propagation de cellules formant mammosphere de frais canalaire du sein carcinome humain tissu 8.6. Notre nouveau système est basé sur le principe de la cellule de streaming / 5 migration. Les canaux du sein perceptibles, et le stroma environnant sont immergés dans un volume minimal de milieu nutritif sans sérum (juste enough à recouvrir les fragments de conduits) afin de maximiser l'échange de gaz, avec la surface de la gaine exposée au milieu de culture de coupure, mais pas dans une orientation spécifique dans le ballon (figure 1E-F). Ce système de culture de cellules permet de migrer hors de la gaine et dans / sur le stroma et ballon de culture autologue. Le milieu nutritif, complétée seulement par facteur de croissance épidermique (EGF), l'insuline et des antibiotiques, favorise la croissance de populations cellulaires mixtes issues de la organoïde. Le flacon de culture de tissu a une refermable couvercle amovible, qui permet aux organites et / ou des cellules qui doivent être récoltées, sans perturber le ballon ou voisins organites entiers, tout en maintenant un environnement stérile humidifié.
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Protocol
Tissu mammaire humain ont été recueillies auprès des patients participant à une étude de recherche, avec le consentement éclairé écrit, suivant ministère de la Défense, de l'Université George Mason, et les protocoles approuvés par le Conseil d'examen institutionnel du système de santé d'Inova.
1. Préparer riche en nutriments moyen de facteurs de croissance et des antibiotiques
- Préparation des solutions mères de l'insuline, le facteur de croissance épidermique (EGF), le sulfate de streptomycine et de sulfate de gentamicine.
- Reconstituer l'insuline dans l'eau filtrée stérile à une concentration finale de 10 mg / ml. Aspirer 10 ml de type 1 eau de qualité réactif dans une seringue de 10 ml stérile à usage unique. Fixer un filtre de 0,22 um de polyéthersulfone à la seringue. Verser l'eau filtrée stérile dans un tube de 15 ml conique stérile.
- Ajouter 10 ml d'eau filtrée stérile à un flacon de 100 mg d'insuline. Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. Conserver le flacon d'insuline sur la glace. Distribuer 450 ul de l'insuline actions solution dans étiquetés, des microtubes stériles et conserver à -20 ° C. Solution de réserve d'insuline est stable jusqu'à la date de péremption indiquée sur le flacon.
- Préparer une solution stock de facteur de croissance épidermique (EGF): Ajouter 500 pi d'eau stérile à 500 ug EGF (stock 1 pg / pl). Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. Conserver le flacon FEM sur la glace.
- Préparer une solution de travail de l'action de l'EGF: Ajouter 100 ul de la solution mère de l'EGF à 900 milieu nutritif pi (stock de travail sera de 0,1 pg / pl). Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. Distribuer 50 pl de la solution de travail des stocks EGF dans étiquetés, des microtubes stériles et conserver à -80 ° C.
REMARQUE: EGF solution stock (1 pg / pl) est stable pendant 1 an à -80 ° C; Solution de travail de stock (0,1 ug / ul) est stable pendant 2 mois à -80 ° C.
- Préparer une solution de travail de l'action de l'EGF: Ajouter 100 ul de la solution mère de l'EGF à 900 milieu nutritif pi (stock de travail sera de 0,1 pg / pl). Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. Distribuer 50 pl de la solution de travail des stocks EGF dans étiquetés, des microtubes stériles et conserver à -80 ° C.
- Peser 40 mg de sulfate de streptomycine sur une balance analytique. Placer le int de sulfate de streptomycineo stériles tube de 15 ml conique. Ajouter 4 ml de milieu nutritif. Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. La solution doit être légèrement rosée. Conserver à 4 ° C à l'abri de la lumière. Une solution de sulfate de streptomycine est stable pendant 7 jours.
- Peser 20 mg de sulfate de gentamicine sur une balance analytique. Placer le sulfate de gentamicine dans un tube conique de 15 ml stérile. Ajouter 2 ml de milieu nutritif. Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. La solution doit être jaune. Conserver à 4 ° C à l'abri de la lumière. Une solution de sulfate de gentamicine est stable pendant 7 jours.
- Préparer deux 200 ml lots de milieu nutritif additionné d'EGF humain recombinant (10 ng / concentration finale ml.), De l'insuline (10 ug / ml de concentration finale.), Du sulfate de streptomycine (100 ug / ml de concentration finale.) Et de sulfate de gentamicine (20 ug / ml de concentration finale.).
- Ajouter 200 ml de milieu nutritif à un ballon filtrant à vide équipé d'un filtre de 0,2 um ballon de polyéthersulfone et une bouteille de 250 ml de réception. Ajouter 20 &# 181; l stock de travail du FEM, 200 pi actions insuline, 2 ml de sulfate de streptomycine stock, et 400 pi actions sulfate de gentamicine à 200 ml de milieu nutritif. Fixez le flacon de filtre à vide. Filtrer le milieu. Jeter le filtre et l'étiquette du flacon comme «un milieu riche en nutriments". Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à 14 jours.
2. Acquisition de tissus et extrapolation
- Dans la salle d'opération, maintenir technique stérile après procurer le tissu mammaire. Placez le tissu mammaire dans un plateau stérile et recouvrir le plateau d'une pellicule de plastique stérile.
- Transporter le tissu dans le bac couvert de radiologie / Pathologie tel que requis par votre institution. Ne pas ouvrir le tiroir. Les temps de transport varient au sein des institutions. Les tissus peuvent rester viables dans ce bac couvert à température ambiante pendant jusqu'à 45 minutes après l'excision. Cependant, le traitement rapide des tissus dans un milieu riche en nutriments offre des conditions optimales pour la culture organoïde ultérieure.
- Dissection du tissu brut d'identifier les zones de CCIS dans le tissu du sein: Utiliser des gants stériles, des lames, des scalpels, tissus colorants de marquage et de vinaigre lors de la dissection de tissu pour maintenir la stérilité de tissu.
- Nettoyer la zone de travail avec 70% d'éthanol ou 1% eau de Javel. Ouvrez les gants stériles et placer l'enveloppe de gant sur la surface de travail. Placez l'intérieur du gant stérile emballage vers le haut. Mettre les gants stériles.
- Nettoyer la surface du récipient d'échantillon avec 70% d'éthanol. Retirer la pellicule de plastique du contenant d'échantillon de tissu et placer l'échantillon sur l'emballage de gants.
- Trempez deux cotons-tiges basculé dans la teinture de marquage de tissu. Appliquer le colorant à la surface du tissu en faisant rouler les tampons à travers la surface du tissu.
REMARQUE: Chaque département de pathologie a un protocole standardisé d'orientation couleur de teinture / tissu. Le tissu est marqué avec un colorant pour orienter le tissu par rapport à sa position dans le patient. Le colorant est effacé oupeint sur le tissu. Ne pas verser le colorant sur le tissu. Verser le colorant peut provoquer le colorant pour exécuter / goutte à goutte dans les crevasses de tissus nuisant ainsi à l'orientation des marges chirurgicales. orientation tissulaire fournit le chirurgien et avec des repères anatomiques pathologiste à a) décrire le spécimen de tissu, et b) déterminer l'emplacement des marges chirurgicales par rapport à la tumeur. - Verser le vinaigre blanc distillé (acide acétique à 5%) sur des tampons de gaze stériles. Tamponnez le tissu teint avec la gaze imbibée de vinaigre. Jeter la gaze. Le vinaigre est utilisé pour fixer les colorants marquage de tissu.
- Couper le tissu mammaire en tranches verticales d'environ 5 mm d'épaisseur. Ne pas couper tout le chemin à travers le tissu (Figure 2). Observer / palper le tissu pour les zones de calcification. Identifier les lésions de CCIS par leur entreprise caractéristique, pâle apparition entouré de rouge, les frontières caoutchouteux qui se sentent graveleux (en raison de spicules de calcium).
REMARQUE: Dans certains cas, les zones comédon (bouton-like) peuvent êtrevu comme des points blancs, représentant matériau nécrotique de grand diamètre lésions CCIS. - Découpez les zones de CCIS tissu mammaire / entartrée, y compris une petite quantité de tissu mammaire environnant. Placer le tissu mammaire dans un tube stérile de 50 ml contenant de 20 à 30 ml de milieu riche en nutriments préparé à l'étape 1.
- Mélanger le tissu et moyen en retournant doucement le tube plusieurs fois. Jeter le moyen et ajouter du milieu frais. Placer le tube contenant le tissu et le milieu dans un récipient isolé et transporter le tissu au laboratoire de culture de tissus.
- Nettoyer la zone de travail avec 70% d'éthanol ou 1% eau de Javel. Ouvrez les gants stériles et placer l'enveloppe de gant sur la surface de travail. Placez l'intérieur du gant stérile emballage vers le haut. Mettre les gants stériles.
3. Culture de tissu
- Travailler dans une enceinte de sécurité biologique, verser le tissu et une petite quantité de milieu nutritif dans une boîte de Pétri stérile. Avec un scalpel stérile coupé et jeter le tissu fibreux. Couper le tissu mammaire en morceaux (organites) d'environ 3 mm 2 (figure 1C-D). Essayez de couper le tissu de sorte que chaque organeOID contient au moins un segment de canal discernable avec stroma environnant.
- Ouvrir le couvercle de la fiole de culture de tissu. Avec des ciseaux ou des pinces stériles, placer les organites dans le ballon. Fermez le couvercle. Jeter la boîte de Pétri.
- Ajouter 11 ml de milieu riche en nutriments sans sérum (préparé à l'étape 1) dans le ballon de culture tissulaire. Fermer le flacon et agiter la fiole de sorte que les organites et le milieu sont distribués uniformément sur toute la surface du ballon (figure 1E-F).
- Incuber le ballon à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5,0% pendant 2 jours. Ne déplacez pas le ballon pendant cette période.
- 2 jours après l'incubation, enlever le ballon de l'incubateur pour vérifier la contamination fongique / bactérienne potentiel. Évitez coup, les mouvements brusques, ou tourbillonnant du ballon. Placer le ballon sur une platine du microscope inversé.
- Observer le support de bactéries, de levures et / ou moisissures. Si aucune contamination est à noter, retourner le ballon à l'incubateur pour un complémentjour tradition-. Si la contamination est à noter, jeter le ballon et son contenu dans un récipient approprié.
- Le jour 3 après incubation, remplacer le milieu conditionné par un milieu frais.
- Placer 11 ml de milieu dans un tube stérile à 37 ° C pendant 20 à 30 min. Retirer le flacon de culture de tissu à partir de l'incubateur. Sans déranger les organites, retirez et jetez le milieu dans la fiole à l'aide d'une pipette sérologique stérile.
- En utilisant une nouvelle pipette sérologique stérile, ajouter 11 ml de milieu frais préchauffé. Très tourner doucement le flacon pour distribuer le fluide sur la surface du ballon.
- Incuber le ballon à 37 ° C dans 5,0% de CO 2, atmosphère humidifiée.
4. Maintien d'établi des colonies cellulaires Organoid / épithéliales
- Préparer milieu frais toutes les 2 semaines et remplacer les médias dans le flacon de culture de tissu 3 fois par semaine.
- Placer 11 ml de milieu dans un récipient stérile à 37° C pendant 20 à 30 min. Enlever le ballon de l'incubateur. L'utilisation d'un sérologique pipette stérile, retirez et jetez le milieu conditionné du ballon, en faisant attention de ne pas déranger les organites.
- En utilisant une nouvelle pipette sérologique stérile, ajouter 11 ml de milieu frais préchauffé. Très tourner doucement le flacon pour distribuer le fluide sur la surface du ballon. Incuber le ballon à 37 ° C dans 5,0% de CO 2, atmosphère humidifiée.
- Après 10 - 14 jours de culture, de supprimer tous les morceaux de tissus dans le flacon de culture qui ne sont pas adhérentes.
- Des cellules et / ou les organites de la fiole de propagation dans de nouvelles fioles de culture, la récolte périodique de transplantation de xénogreffe, ou pour phénotypique et / ou d'une analyse moléculaire.
- Retirer le flacon de culture de tissu à partir de l'incubateur. Vaporiser le ballon avec 70% d'éthanol. Essuyez l'excès de l'éthanol sur le ballon avec une serviette en papier propre qui a été pulvérisé avec 70% d'éthanol.
- Propagation Organoid: <ol>
- Ouvrez le couvercle du flacon et placez le couvercle face vers le haut dans l'enceinte de sécurité biologique. Sous visualisation microscopique, localiser la organoïde (s) à être récoltés. Utilisez des pinces ou des pinces stériles pour ramasser un organoïde.
- Pour propager la organoïde dans un nouveau flacon de culture, placez le organoïde dans le nouveau flacon. Ajouter 11 ml fraîche, milieu chaud. Incuber à 37 ° C, dans un 5% de CO 2, atmosphère humidifiée, comme décrit dans les étapes 3.3 - 3.6.3. Remplacer le milieu de culture cellulaire dans la culture de tissus ballon à trois fois par semaine.
- La récolte des cellules:
- Sous vixualization microscopique direct, gratter délicatement et cellules aspirer et mammospheres aide d'une pipette de 1000 pi avec des embouts de pipette jetables stériles. Aspirer les cellules et le milieu environnant. Distribuer les cellules / milieu dans un tube à centrifuger stérile.
- Faites tourner les cellules brièvement dans un mini-centrifugeuse à 12 100 g pendant 5 sec. Retirez et jetez le milieu. <ol>
- Pour l'analyse de l'ADN, geler immédiatement le culot de cellules sur de la glace sèche, dans un petit volume de milieu (10 pi), avec un stockage à long terme à -80 ° C.
- Pour l'analyse protéomique, la lyse des cellules dans 10 ul de 8 M urée pour la spectrométrie de masse ou 2x SDS tampon tris-glycine pour blot / arrière des puces à protéines de la phase de l'Ouest. Sinon, tourner cellules dans un cytocentrifugeuse à faire des frottis cellulaires pour l'analyse immunohistochimique.
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Representative Results
Workflow pour l'acquisition et la culture de carcinome canalaire du sein stérile dans les tissus in situ
stérilité du tissu mammaire est maintenue de la salle d'opération au laboratoire de culture cellulaire par des changements mineurs dans typique flux hôpital de pathologie (figure 1). Le tissu est transportée dans un récipient stérile avec une couverture en film plastique qui permet une évaluation radiologique, tout en maintenant la stérilité du tissu. Traitement de tissu d'un échantillon brut de chirurgie mammaire conservatrice du sein ou mastectomie est réalisée avec des gants stériles, des lames et des colorants de marquage de tissu. Aspect morphologique brut de carcinome canalaire in situ du sein ressemble zones pâles, légèrement relevées avec une texture granuleuse / ferme, entourée par un tissu caoutchouteux rouge / jaune. Domaines d'hyperplasie canalaire et CCIS peuvent se sentir "graveleux" et ferme en raison de calcifications. Ces zones de tissu du sein apparaissent souvent bronzage ou une couleur légèrement différente de celle du tissu mammaire environnant. Cependant, ADH cun seul être distingué après la collecte des tissus et de l'examen pathologique des sections de tissus colorés. Le tissu mammaire reste viable par immersion des tissus et / ou des organites canalaires dans un milieu nutritif exempt de sérum supplémenté avec de l'EGF humain recombinant (10 ng / ml), de l'insuline (10 ug / ml), du sulfate de streptomycine (100 ug / ml) et de sulfate de gentamicine (20 ug / ml) 5. des flacons de culture cellulaire avec des couvercles amovibles / refermable permettent la récolte périodique de cellules / organites (figure 1E-F). Ce modèle propagé avec succès sein lésions pré-invasives de l'homme de plus de 20 patients diagnostiqués avec une hyperplasie canalaire atypique (n = 2) et un carcinome canalaire in situ (n = 18).
La formation de mammosphere spontanée in vitro et in vivo
Mammospheres et des structures en 3-D est apparue spontanément à partir de multiples fragments de tissus humains indépendants de conduit de DCIS de différents patients diagnostiqués avec hyper canalaire atypiqueplasie ou carcinome canalaire in situ (figure 3 et 4) de 5,9. Perturbation enzymatique du tissu du sein n'a pas été effectuée avant la culture de tissus, ce qui conduit à une culture mixte de type cellulaire. Ni le sérum, les matrices extrait de la membrane basale, ni gel comme étaient nécessaires pour la formation de mammosphere spontanée (figure 4). Les mammospheres xénogreffes de tumeurs mammaires générés dans un modèle de souris NOD / SCID avec le même motif que celui de la croissance de cancer invasif (figure 5) 5. Ces résultats démontrent que les cellules progénitrices ayant un potentiel invasif pré-exister dans le sein humain CCIS conduit mais sont apparemment tenus en échec par la niche canalaire et peuvent être amenées à émerger dans la culture organoïde. Ces cellules constituent une nouvelle catégorie de cellules souches comme mammaires qui existent avant la manifestation évidente du phénotype 5,9,10 invasive.
Confirmation de l'épithélium dérivé mammospheres et xenografts
Les mammospheres et les xénogreffes dérivées des mammospheres ont été confirmés par immunofluorescence comme ayant des origines épithéliales. Molécule d'adhérence des cellules épithéliales (EpCAM) est une glycoprotéine membranaire exprimée sur les cellules epitheliales 11. L'immunofluorescence avec un anticorps monoclonal de souris réactif à EpCAM humaine (vert) et un colorant nucléaire (DAPI, bleu) montrent des cellules positives EpCAM dans les mammospheres en culture (figure 6A) et le centre d'une xénogreffe de souris NOD / SCID (Figure 6B).
Vérification des limites de la membrane basale intacte
Le mammosphere former, les cellules épithéliales néoplasiques dans ce système de culture ont été tirées à partir de lésions mammaires pré-invasives qui étaient dépourvus d'invasion franche ou micro-invasion, tel que vérifié par l'analyse pathologique indépendant selon la norme de diagnostic histopathologique soins. Organoïdes structures multiples provenant du même patient pour générer mammosphereMing colonies qui se sont avérées tumorigène. En outre, l'examen histopathologique du tissu utilisé pour la culture organoïde a révélé des lésions intra-canalaires confluentes avec sous-sol intact limites de la membrane (figure 7b) 5. Ainsi, il peut être conclu que les mammospheres spontanés formés dans ce système de culture sont obtenues uniquement à partir de zones néoplasiques pré-invasives et ne sont pas un produit de zones rares d'microinvasion 5.
Figure 1. Flux de travail pour maintenir la stérilité de tissu lors de l'imagerie radiologique et la dissection des tissus brut. (A) Dans la salle d'opération, le tissu du sein (tumorectomie échantillon représenté) est placé dans un plateau stérile et recouvert d'une pellicule de plastique stérile. Le tissu peut être visualisé directement dans le bac en matière plastique. (B) pour identifier les tissus extrapolation les zones de DCIS. À usage unique seulement colorants d'orientation des tissus sont peints sur la surface du tissu à l'aide de coton stérile tampons à pointe. vinaigre blanc distillé des ménages est versé directement sur le tissu et effacé avec de la gaze de coton stérile. (C & D) Le tissu mammaire est transporté au laboratoire de culture de tissus dans un milieu riche en nutriments additionné d'antibiotiques. dissection des tissus, d'isoler les domaines de la CCIS, est effectuée en utilisant des gants stériles et lames de scalpels / / ciseaux. Le tissu CCIS est découpé en plusieurs organites de la culture. (E & F) La culture in vitro de organoïdes du sein. CCIS tissu humain est placé directement en flacons de culture tissulaire avec couvercles amovibles, sans digestion enzymatique préalable du tissu. Une quantité minimale de milieu de culture exempt de sérum supplémenté avec le facteur de croissance épidermique et de l'insuline favorise la croissance cellulaire, tout en maintenant une interface air-liquide dans le organoïde.6fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Illustration de traitement de tissu brut de tissu mammaire CCIS. La tumorectomie ou une mastectomie tissu est coupé en fines sections en découpant le tissu verticalement sans couper tout le chemin à travers l'échantillon. Cette méthode de dissection est souvent désigné sous le nom de "technique de miche de pain", car le tissu coupé ressemble à une miche de pain. La zone (s) suspecté de contenir CCIS sont découpées et coupées en 2 - 3 mm tranches de pathologie de diagnostic et culture organoïde.
Figure 3. Une culture de type cellulaire mixtemaintient représentant des populations de cellules in vivo. (A) image en contraste de phase de culture cellulaire mixte généré du sein CCIS lésions de plus de 11 semaines (grossissement de 4x). (B & C) in vitro organoïde culture succès propagé CCIS dérivé des cellules épithéliales avec une croissance indépendante de l'ancrage, définie comme la culture vers le haut et mammospheres expansion et lobulée, formations 3-D type conduit, dans un milieu sans sérum complété avec de l'EGF, l'insuline, la streptomycine et la gentamicine (grossissement 10X). (D) Exemple mammosphere formé après 11 semaines de culture (40X). Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. spontanéeformation de mammospheres dans la culture organoïde sans sérum. Un exemple de formation mammosphere après 33 jours de culture (grossissement 10X, 20X encadré). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. NOD / SCID modèle de xénogreffe de souris. Xénogreffes ont été générés par l'injection de cellules épithéliales dérivées d'un patient diagnostiqué avec un CCIS (droit de la souris pad mammaire graisse) ou à partir d'un patient diagnostiqué avec invasive CCIS (gauche de la souris mammaire de coussinet adipeux). Xénogreffes dérivés à la fois pur et CCIS invasive CCIS ont révélé un modèle de croissance similaire et taux. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de tsa figure.
Figure 6. mammospheres sont confirmés pour être d'origine épithéliale. Immunofluorescence avec des anticorps anti-EpCAM conjugué à FITC a été utilisée pour confirmer l'origine épithéliale de mammospheres et les xénogreffes de souris générés à partir de canaux mammaires contenant CCIS. (A) des cellules positives EpCAM-FITC (pseudo- de couleur verte, 488 nm) ont été seulement vu dans mammospheres des cultures cellulaires mixtes émanant organites du sein (DAPI (pseudo-couleur bleu, 408 nm) colorant nucléaire). (B) Dans les sections de tissus de xénogreffe de souris inclus en paraffine fixés au formol, EpCAM positif les cellules ont été détectées uniquement dans le centre de la section de xénogreffe de tumeur. (20X) Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Le collagène IV immunohistochimique révèle les membranes basales intactes canaux environnants. Conduits mammaires normales (A) sont entourés par des membranes basales intactes enrichie en collagène IV (= diaminobenzidine de coloration brune). Après culture organoïde, tissu mammaire contient également les membranes basales intactes confirmant que les mammospheres proviennent de zones de CCIS et pas de cancer invasif (collagène IV immunohistochimie, partie A grossissement 4X, panneau B 10X). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le système de culture décrit ici constitue un nouveau modèle pour générer des cellules vivantes mammaires néoplasiques pré-invasives pour les études de base et de recherche translationnelle. Dans le passé, la progression du cancer du sein pré-malin a généralement été étudié en utilisant trois procédés différents. La première méthode est histopathologique et l'analyse génétique des échantillons humains congelés ou fixes microdisséquées 12-14. La deuxième méthode utilise des modèles de souris qui contiennent des nodules alvéolaires (lésions hyperplasiques HAN) qui sont pensés pour être similaire à des lésions mammaires pré-invasives humaines 15. Le troisième modèle utilise des lignées cellulaires de carcinome du sein, comme lignées MCF7 (MCF10A) qui ont un CCIS hautement différenciés comme morphologie 3,4. Bien que ces trois modèles ont fourni des indices moléculaires de la progression du cancer du sein, aucun de ces procédés sont capables d'évaluer le potentiel malin ou le phénotype moléculaire dans la lésion (s) d'un patient individuel. Histopathanalyse démiologique ne fournit pas d'informations sur le phénotype fonctionnel des cellules dans les lésions pré-invasives. Le modèle de souris de la progression du cancer du sein peut ne pas refléter la diversité histomorphologie et de l'hyperplasie canalaire atypique humain, un carcinome lobulaire in situ, et un carcinome canalaire in situ 16-18. En outre, le micro-environnement stromal et entourant le dépôt de lésions précancéreuses de la souris de la matrice extracellulaire sont sensiblement différentes de la contrepartie humaine 16. Lésions précurseurs murins spontanés peuvent présenter un niveau de progression très faible à l'invasion et les métastases. La troisième méthode, des lignées cellulaires en culture, peut fournir de l'information phénotypique fonctionnel seulement si transplantées dans des hôtes immunodéprimés 3,4. En outre, les anomalies génétiques de la lignée cellulaire à long des passages peuvent pas représenter l'évolution spontanée de cancer du sein chez l'homme 2. Enfin, il est bien établi que la tumeur de chaque patientpossède une combinaison unique d'anomalies génétiques et épigénétiques qui déterminent le taux de croissance, état différencié, et la progression de l'invasion et les métastases 13,14,17. Lésions pré-invasives humaines sont multifocales et hétérogène dans la composition de la cellule et histomorphologie. En outre, le potentiel de malignité biologique est inconnu pour lésion pré-invasive d'un patient individuel.
Notre méthode de culture de tissu primaire de surmonter les déficiences des précédents modèles de cancer du sein pré-invasive humaine et présente les avantages suivants: 1) Le système de culture organoïde favorise la croissance des populations de cellules néoplasiques à l'intérieur de la micro-environnement tissulaire natif qui poussent spontanément et génèrent mammospheres qui produiront tumeurs invasives dans des modèles de xénogreffe de souris. Les cellules constituent le génotype et le phénotype d'un patient individuel et ainsi fournir des informations pour un traitement personnalisé, ou le pronostic individuel. 2) Le organoïde maint système de cultureAins les sous-populations cellulaires natifs et fournit un moyen de cultiver des cellules non malignes épithéliales, les cellules stromales et les cellules du système immunitaire présents à l'origine dans le tissu du sein primaire, et réalisé en culture à l'intérieur de la organoïde. Le faible volume des médias dans le système de culture permet l'échange d'oxygène encourager la formation spontanée de mammosphere et conduit différenciée et les alvéoles comme structures sans la nécessité d'un échafaudage trois dimensions artificielle. 3) La culture de cellules primaires est exempte de modifications et de sélection générés par dissociation enzymatique ou de la modification génétique exogène. En outre, le milieu nutritif est de faible coût et faciles à préparer. 4) Analyse moléculaire et génétique peuvent être menées sur les populations et / ou organites cellulaires spécifiques de la culture à différents points dans le temps, sans perturber l'ensemble de la culture. 5) Le système de culture organoïde permet la croissance, la morphologie différenciée et cellule-cellule interactions des populations de cellules natives qui peutêtre étudié avant et après l'introduction d'agents thérapeutiques dans le milieu de culture.
Bien que la culture de tissu primaire présente certains avantages, il est pas sans limites. La culture organoïde soutient la croissance des cultures cellulaires mixtes, sans prolifération de tout type de cellule. Cependant, le rapport spécifique de types de cellules ne peut pas être contrôlée et ne peuvent donc pas récapituler les rapports cellulaires exacte n'a été trouvée in vivo. Culture organoïde réussie nécessite la collecte de tissus stériles et de traitement, les deux qui ne sont pas des procédures de routine dans de nombreux laboratoires de pathologie de l'hôpital communautaire. Une bonne communication entre les chercheurs cliniques, le personnel chirurgical, et le personnel de la pathologie sont essentiels pour maintenir l'échantillon stérilité dans le continuum des soins aux patients.
Une autre limite de la culture organoïde est l'effet de substrat fermeté sur le phénotype cellulaire et l'expression des gènes 16,19. La différenciation des cellules souches en culturepeut être induite par l'addition de milieu contenant du sérum ou peut être due à durée prolongée dans la culture. Un phénotype en forme de tige a été maintenue au bout de plusieurs mois dans ce système de culture sans sérum organoïde non enzymatique 5. Cependant, à un moment donné dans le temps, les cellules peuvent se différencier qui peut être vu morphologiquement - les cellules deviennent plus petits, plus dense, et ne parviennent pas à former mammospheres. Pour éviter les problèmes potentiels avec des changements dans le phénotype cellulaire au fil du temps, des expériences moléculaires, tels que transfections ou abattre des essais, doit être effectué avec les jeunes cultures plutôt que d'anciennes cultures (plus de 6 mois).
Les clés de la culture organoïde succès utilisent un volume approprié de dans le flacon de milieu de culture, et donner le temps de organoïdes d'adhérer à la fiole de culture de tissus. Excès du milieu dans la diffusion des limites de ballon d'oxygène, inhiber la formation de mammosphere. Les 3 premiers - 7 jours de culture de tissus sont essentiels pour les organites de joindre à la TISpoursuivre flacon de culture. En général, si un organoïde n'a pas attaché par jour 14, il ne contient pas de segments susceptibles canalaires CCIS viables et ne deviendra pas adhérente. Organites qui ne sont pas adhérentes par jour 14 doivent être retirés de la culture. Le manque de poitrine viable conduits CCIS peut être vérifiée culture suivante en fixant la organoïde formol à 10% et le traitement du tissu dans des blocs de paraffine pour la coloration des tissus et de l'évaluation microscopique.
Notre non-enzymatique, les résultats du système de culture sans sérum soutiennent l'hypothèse que génétiquement anormales des cellules précurseurs néoplasiques avec potentiel invasif existent au sein de lésions du sein humain pré-invasives 5,9,20. Ce résultat est en accord avec les travaux antérieurs de Sgroi et al., Qui a mené l'analyse génétique des lésions pré-invasives mammaires humaines et Damonte et al., Qui a étudié l'mammaire néoplasie intraépithéliale excroissance (Mino) modèle murin de la progression du cancer du sein 12,14 21. Toge pristher avec les conclusions des autres, notre modèle de culture de lésions pré-invasives chaque patient appuie le concept que le phénotype agressif de cancer du sein invasif d'un patient peut être en grande partie pré-déterminé au stade pré-invasif.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par (1) le ministère de la Défense Programme Cancer Research (Recherche Acquisition Activité US Army Medical) de prix # W81XVVH-10-1-0781 à LAL et VE, et (2) la subvention de la Fondation Susan G. Komen Breast IR122224446 Lal et VE. des services de pathologie et extrapolation de tissu a été gracieusement fournie par Inova Fairfax département de pathologie, le Dr Hassan Nayer, le Dr Geetha A. Menezes, et le Dr Charles Bechert. Le consentement du patient et la collecte des échantillons a été savamment guidés par l'hôpital Inova Fairfax coordonnateurs de recherche clinique de Holly Gallimore, Heather Huryk, et Emil Kamar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
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