注射原位乳腺癌细胞到小鼠乳腺脂肪垫来研究肿瘤的生长。

癌症是一种非常复杂的疾病，一直受​​到研究了几个世纪。乳腺癌是最常见的癌症类型;它主要发生在女性，但可能偶尔也发生在男性^27。该疾病主要是由控制机构的理事细胞分裂的损失，这又导致细胞在体内的无限增长。这些故障可引起几种机制：首先，健康的细胞需要为了增殖而癌细胞使自己的生长因子，并增加生长因子受体从而获得更高的增殖率¹的表达从周围的细胞生长信号;第二，癌细胞不易受到抗增殖信号^8;第三，为了平衡在体内的细胞死亡，还需要细胞数;然而，癌细胞程序性细胞死亡逃脱，被称为细胞凋亡^14;第四，细胞粘附细胞外基质为了生存，但肿瘤细胞可以成长过程中没有依恋的需要，表现出抗失巢凋亡^19;第五，激活端粒酶规避的端粒缩短，防止复制衰老^21;最后但并非最不重要的，跳绳的DNA的质量控制下的有丝分裂的结果改变基因的内容^15,16。为了确定在其中扮演放松管制的增殖作用，癌基因或抑癌基因，小鼠肿瘤生长的实验是至关重要的。

原发肿瘤的生长一般不会死亡的主要原因。癌细胞从原发部位，以辅助站点的迁移，被称为转移，是死亡的大多数癌症患者²²主要原因。限嗣继承转移的肿瘤细胞浸润，血管内，通过循环行驶，避免免疫攻击，外渗和生长在辅助站点。上皮至间质转变（EMT）是一个关键工艺转移并涉及在基因表达谱的开关产生的细胞具有较高的运动和侵袭，这是先决条件为转移性细胞^12。作为癌性过程的各种动作，包括癌症细胞，基质细胞和亲和抗炎细胞之间的相互交流的组合所得到的， 在体外的方法来癌症常常不提供完全的洞察癌变过程。同样地，抗癌治疗影响肿瘤脉管往往不能被研究在体外 ，从而利用在体内接近是不可避免的。

研究乳腺癌进展，不同的实验方法已经被开发出来。最广泛使用的模型是皮下注射乳腺癌细胞到小鼠中^5。在本实验装置中，研究者可以引入一个广泛的改变，以选择在体外的细胞系（ 即上调，蛋白质的下调），并注入细胞在皮肤下。虽然这种方法非常简单，并在注射过程中，没有任何必要对小鼠进行手术简单，在该肿瘤被注入的部位并不代表本地乳腺肿瘤环境以及缺乏这种环境可能导致乳腺癌的发展是不同于在人类病理学观察。其次，基因工程小鼠经常被用作一个体内的工具来研究乳腺癌进展。在这个模型中，致癌基因（ 即 PyMT，NEU）的表达是由乳腺组织特异性启动子导致的自发乳腺肿瘤S中形成驱动。这个实验装置是有用的通过注射药物或抗体，而在时间³检查肿瘤的大小，以研究这种疾病的治疗方面。然而，繁殖这些小鼠与其他小​​鼠品系缺陷或突变的兴趣也可能会给插件的基因ights成不同的蛋白质在乳腺肿瘤生长²⁴中的作用。这种模式的缺点是很容易产生变异肿瘤的大小和数量。此外，转基因表达的水平取决于整合位点在基因组中，并且可以从一个小鼠品系改变为另一个^4。在这个模型中，转基因的表达可以通过所有细胞与上皮起源来实现，而在人类疾病，细胞仅一个亚群表达的原癌基因或下调的肿瘤抑制的水平^26。研究转移，乳腺癌细胞也可以静脉注射（一种模式称为实验性转移^）25。但是，这种方法只概括转移过程的部分;它避开对肿瘤细胞的侵入和intravasate的要求，并开始从该点处的肿瘤细胞很容易存在于循环中。

在我们的工作中，我们使用原位注入离子模型来研究中乳腺癌进展¹³感兴趣的基因的参与。我们过表达在人乳腺癌细胞中的蛋白质和它们注入NOD / SCID伽玛（NSG）小鼠的乳腺脂肪垫。这种方法在许多方面是有利的：它允许非常迅速和多样化的注射细胞系的基因变化，它覆盖了从原发肿瘤的生长，以转移乳腺癌进展的整个过程，在病理相关的网站，并且它也提供了一个很好的实验模型用于研究的治疗性治疗在疾病的早期或晚期阶段的影响。另外，使用这个模型1可以调查基质与疾病进展癌细胞来源的蛋白质通过使用遗传修饰的小鼠或细胞的作用。虽然皮下注射是更容易执行，原位模型产生一个更致瘤性和更转移性癌症细胞群。因此，通过皮下注射方式获得的结果S可能会发生是要么假阴性或假阳性^6,17鼓励使用原位模型来研究肿瘤的生长。

动物实验批准了荷兰莱顿大学医学中心（LUMC）的动物福利委员会。

1.准备的细胞，仪器和小鼠

1. 手术前一天，从第四乳头中线刮胡子的NOD / SCID伽玛（NSG）小鼠，权衡小鼠验证所有小鼠有大致相当的权重。
2. 高压灭菌剪刀，镊子2和两个直的蚊钳（ 图1A）。
3. 对手术当天，洗人乳腺癌（MDA-MB-231）细胞中，将一次用磷酸缓冲盐水（PBS）被注入，pH为7.4和trypsinize细胞。通过在细胞的顶端加入10ml含血清DMEM培养基猝灭胰蛋白酶。离心将细胞在1,200rpm下在RT 7分钟通过重悬细胞无论在PBS或在没有血清的培养基以除去血清。再次离心他们彻底清除血的痕迹。将细胞重悬于PBS或媒体。
4. 计数细胞用血细胞计数器，并计算细胞的量。使用50万细胞/鼠标在不超过150微升。择，以PBS或媒体，重新悬浮在基质胶中的细胞。
   注：确定取决于所使用的细胞类型的细胞的量。
5. 将细胞在无菌离心管，并让他们在冰。
6. 填充1 50ml锥形离心管中以35毫升的PBS pH 7.4的，另一个50ml的锥形离心管中，用70％的乙醇。浸泡棉签到每个试管中。

2.注射原位

1. 在无菌罩下进行手术，以保持无菌气氛。通过皮下注射赛拉嗪/氯胺酮混合物在10毫克/千克，100毫克/公斤体重的剂量麻醉的小鼠。修复鼠标放在一个加热垫。确认麻醉由缺乏反应脚趾捏的成功。
   注：如果一个人是不是很熟悉的外科手术，手术可能需要更长的时间。安排麻醉剂量相应。
2. 适用于小鼠的眼中的眼科软膏，以防止眼睛干燥。
3. 用棉签蘸取步骤1.6编写乙醇清洁剃光区域。交替使用优碘和酒精三次以循环的方式从计划切口部位旋转远离磨砂应该执行。另外，使用离子载体作为消毒剂。
4. 使第四奶嘴和中线之间的小切口用剪刀和通过将棉签浸湿，用PBS pH 7.4的做出一个口袋。
5. 使用镊子，露出乳房脂肪垫。观察脂肪垫它的白色。
6. 挤压脂肪垫从其基地等镊子;通过这样做，完全暴露的脂肪垫（ 图1B），以容易地进行注射。
7. 通过上下吹打均质的细胞混合物。轻轻吸50微升细胞悬浮液成胰岛素注射器和注入乳房脂肪垫由持针水平。通过检查脂肪垫肿胀确认成功注入。
8. 轻轻松开脂肪垫。
9. 通过使用针驱动缝合切口。使三个单结转动缝合周围的针驱动在顺时针，逆时针和顺时针方向转动。每缝合两个结应该被使用。
   注：确保结紧张，否则小鼠可以打开缝合。
10. 手术后，在0.05-0.1毫克/公斤体重，皮下注射，以缓解疼痛注射止痛药，如temgesic。
11. 不要让动物无人看管，直到他们获得的意识，保持胸骨recumbence。将所有的动物分成不同的笼子里，直到他们完全康复。
12. 保持无菌，使用蒸压笼和水。改变笼，每三天要保持大气的清洁。

3.摘器官的分析

1. 在收获的当天，细胞的植入8周后，填的15毫升锥形离心管中的每个小鼠3毫升Bouin氏溶液。此外，使用两个15ml试管充满每只小鼠5毫升福尔马林溶液。
2. 通过注射赛拉嗪/氯胺酮，以10mg的剂量麻醉动物/千克100毫克/公斤体重皮下​​注射。等到动物失去脚趾捏撤回反射。
3. 固定在基本的针的动物。做一个长期的，垂直的正中切口，用剪刀。使下方的前腿和后腿上面两横切口。由钉扎皮肤基底暴露肿瘤。测量肿瘤体积通过使用卡尺。
4. 分离使用剪刀皮肤肿瘤。卡扣冻结肿瘤在液氮中用于RNA分离的一部分。放置另一部分，进入锥形离心管中填充有福尔马林以下石蜡包埋，以进行免疫组化分析。
5. 轻轻取出肺。将左肺到布安的解决方案。保持在溶液中的肺3天。清楚地观察浅表转移灶，以肉眼。或者，将右肺到福尔马林使用苏木精和伊红（H＆E）染色，以验证微。
   注：虽然，肺转移乳腺癌经常出现，人们可能还需要收集骨，肝，脑，脾，分析转移。将细胞在转移区是密度和形态不同，因此可以很容易地从肺组织区别开来。
6. 一天收获后，吸出从15ml试管的福尔马林溶液，并替换为70％的乙醇。嵌入在石蜡的组织和执行免疫组化研究。
7. 对于血液分析，开拓胸腔用剪刀。撤销450微升血液通过心脏穿刺。放置血液样本中含有50微升3.2％的柠檬酸钠微量离心管中。血液采集后，旋转它在2000 XG为10英里ñ。储存的血浆样品在-20℃直至进一步使用。
   注意：有在实践²⁰常用的几个其它血液收集技术，并且需要被使用的技术取决于实验设置和科学家的选择。如果不需要血液样品，根据动物的协议或按该机构的准则安乐死的动物。

成功应用了“原位乳腺癌模型”是基于适当的细胞注射到乳腺脂肪垫。实验误差如不精确接种细胞或泄漏的可能导致的变化的肿瘤大小或甚至不存在肿瘤这导致结构的形成寻找类似于一个乳房脂肪垫注射了对照缓冲液（ 图2A）的。肿瘤的生长速率依赖于所注入的细胞系的性质和在一般情况下，可以通过只小鼠（ 图2B）的皮肤中观察到。不像在体外实验中，对肿瘤细胞的生长速率可能不会在时间在体内 （ 图2C）常数。由于缺氧和营养素的缺乏，坏死区可形成和这些区域将影响肿瘤（ 图2D）的生长速率。此外，所关注的基因可能会影响一定相癌的进展的（早期或晚期），从而根据不同的实验装置，肿瘤生长可能会开始快但减慢在端，或反之亦然。

护理应肿瘤切除过程中服用;严格的处理可能影响肿瘤的结构，并导致在免疫组织化学分析的问题。肿瘤周围的区域可能会显示源于血管重构的大型船舶。这些血管中除去废物起着至关重要的作用，并提供在肿瘤组织与营养和氧气，从而促进肿瘤生长（ 图2B）。新生血管（血管）的形成可以通过染色肿瘤的新血管标志物进行调查（ 即 CD31，CD34）。

收集在Bouin氏溶液的肺部有助于可视化对肺浅表转移灶（ 图3A）。癌灶可从肺组织由苍白色的方式来区分d为容易检测18。转移可以被表示为形成在肺表面灶的数量。然而，形成灶是细胞系依赖性;非侵略性细胞产生仅微或无转移的。微转移可以容易地识别与在石蜡包埋的肺组织（ 图3C）一个苏木精/伊红染色。

图1：材料和方法（A）的手术所需的注射乳腺癌细胞到乳腺脂肪垫设备（B）的代表性的图像示出乳房脂肪垫的曝光。

图2：原位乳腺肿瘤生长的小鼠概述（一）媒体控制或（C）的肿瘤体积的测定使用卡尺通过使用下面的公式：肿瘤体积= 0.5×长×宽×宽（D）的肿瘤的总体形态与H＆E染色进行分析。 I代表浸润细胞，T表示肿瘤细胞和N代表坏死区。 （比例尺= 200微米）

图3：肿瘤转移至肺中（A）的小鼠的肺即分别原位注射肿瘤细胞（MDA-MB-231）。肺的布安的解决方案孵化公开转移灶的肺。（B）从对照组小鼠肺该行原位喷射控制媒体。正如可以清楚地看到，这些控制肺部不显示宏观转移。（℃），H＆E染色显示了肺组织中的转移区域。插入表示含有转移灶的肺组织的低倍率的概述。在将黑色虚线框表示，在大板。肿瘤细胞是由白虚线表示;注意做大密集的细胞核。 （黑色比例尺= 100微米，白色比例尺= 20微米）

提交人声明，他们没有竞争的经济利益。