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定量免疫荧光测定法用于测量中心体蛋白水平的变化

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DOI：

10.3791/52030

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2014年12月20日

 , 
1Department of Molecular Genetics, The Ohio State University

本文内容

摘要

在此，开发了一种新型的定量荧光检测方法，通过将特定蛋白在中心体处的荧光强度归一化至适当的内参标准荧光强度，从而定量检测该蛋白在中心体局部水平的变化。

摘要

中心体是体积微小但功能重要的细胞器，可作为有丝分裂纺锤体的两极以维持基因组完整性，或组装初级纤毛以促进细胞的感觉功能。蛋白质在中心体处的水平调控方式可能与其他细胞区域不同，且多种蛋白质在细胞周期不同时相中中心体水平的变化似乎对中心粒的正确组装至关重要。我们开发了一种定量荧光显微检测方法，用于测量不同样本（如处于细胞周期不同阶段或经不同试剂处理后）的固定细胞中蛋白质在中心体处的相对水平变化。该检测方法的原理在于，测量对应于蛋白质在微小区域内的背景校正后荧光强度，并将该测量值归一化至另一种在特定实验条件下水平不变的蛋白质的相应测量值。通过将该检测方法与BrdU脉冲-追踪策略结合用于研究未受干扰的细胞周期，我们定量验证了近期观察结果：VDAC3在中心体处的蛋白池在细胞周期中受到调控，可能通过中心体特异性的蛋白酶体介导降解实现。

引言

中心体由一对中心粒及其周围的中心粒周围物质（PCM）组成。作为哺乳动物细胞中主要的微管组织中心（MTOCs），中心体在分裂细胞中充当有丝分裂纺锤体的两极，从而有助于维持基因组完整性1。在静止期细胞（例如，G0期）中，中心体的两个中心粒之一，即母中心粒，会转化为基体，以组装从细胞表面突出的初级纤毛，这是一种感觉性细胞器2。当细胞重新进入细胞周期时，初级纤毛被解体，每个中心粒在其近端引导前中心粒的组装，前中心粒逐渐延长形成成熟的中心粒3。在S期开始时，一种类似轮盘的结构在每个已有中心粒的表面形成，赋予中心粒九重对称性，并将成为每个前中心粒的基础。Sas6是中心粒组装所必不可少的蛋白，被招募至轮盘结构的中心形成轮毂4-6。随后，其他中心粒蛋白以高度有序的方式，从近端向远端依次组装到轮盘结构上7。在精确完成中心粒复制后，细胞在G2期末组装额外的中心粒周围物质，形成两个功能性的中心体8。除了核心的中心粒组分9-11外，还有多种其他蛋白，包括激酶、磷酸酶、分子伴侣、支架蛋白、膜相关蛋白以及降解机制相关蛋白，在细胞周期的不同阶段与中心粒、基体及PCM相关联12-16。值得注意的是，许多蛋白在中心体上的水平通常通过中心体靶向机制和/或在中心体处的蛋白酶体降解而受到时间上的调控。重要的是，Plk4、Mps1、Sas6和CP110等蛋白在细胞周期不同时相中中心体水平的波动似乎对调控中心粒组装至关重要5,17-22；以Mps1为例，若阻止其在中心体的降解，则会导致过量中心粒的形成19。另一方面，某些蛋白在中心体的组分比细胞质中的池更稳定。例如，尽管整体细胞中Centrin 2（Cetn2）的蛋白水平显著降低，但通过siRNA介导的Cetn2下调仅导致中心粒处蛋白水平的适度下降23。因此，在评估蛋白在中心体的特异性功能时，测量其在中心体局部的蛋白水平比测量全细胞蛋白水平更为关键。

在本研究中，我们建立了一种利用间接免疫荧光（IIF）的方法，用于定量中心体中某种蛋白质的相对水平。该方法特别适用于分析来自不同样本的细胞，因而无法在同一时间进行成像。这些样本可以是经不同试剂处理的细胞（即，药物与对照），在不同时间点采集即，脉冲与追踪），或处于细胞周期的不同阶段。该实验方法的原理在于，测量目标蛋白在细胞微小区域内的背景校正后荧光强度，并将其归一化为另一种在特定实验条件下表达水平不变的蛋白的相应荧光强度值。近年来，多项中心体生物学研究已在活细胞或固定细胞中采用多种定量显微技术，以确定候选蛋白在中心体上的特异性功能24-27与这些检测方法类似，本技术同样测量待测蛋白质经背景校正后的荧光强度。然而，本实验通过引入内参标准进行归一化处理，有望在分析位于不同盖玻片上的两个不同样本时提供更高的准确性和可信度。此外，除了检测中心体处的蛋白质水平外，通过少量调整，该方法还可应用于多种不同的实验条件或其他细胞位点。

在此，我们将定量显微镜检测与BrdU脉冲-追踪策略相结合，以比较处于不同细胞周期阶段的细胞。与采用标准的细胞周期阻滞和释放技术来研究各个细胞周期时间点的方法不同，本方法使用异步生长的细胞，先经BrdU孵育以标记S期细胞，随后进行不同时间（通常为4–6小时）的追踪。脉冲结束后，大多数被标记的细胞处于S期。通过选择适当的追踪时间，可在追踪结束后使被标记的细胞进入晚S期、G2期或有丝分裂期，其阶段可通过中心体相对于细胞核的位置、中心体之间的距离以及染色体的凝集程度等形态学特征加以验证。 等等。 因此，追踪时间的长短取决于特定细胞类型中S期、G2期和M期的平均持续时间。由于该方法避免了使用羟基脲、阿非迪霉素、诺考达唑等细胞周期抑制剂， 等等。它能够实现更具生理相关性的细胞周期分析。

因此，本文证明了定量荧光显微技术单独使用或与 BrdU 脉冲-追踪实验联合使用，是一种简单而强大的方法，可准确测量候选蛋白在未受干扰的细胞周期中中心体水平的相对变化。我们利用这些方法检测了 VDAC3 在中心体的含量，该蛋白是我们近期除线粒体外又发现定位于中心体的一种蛋白16,28。本文获得的结果验证了我们先前的观察，即 VDAC3 在中心体的蛋白量受到降解调控，并且其水平呈现细胞周期依赖性的变化16，进一步证实了该方法的适用性。

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方案

1. 细胞培养

  1. 使用人端粒酶逆转录酶（hTERT）永生化的视网膜色素上皮细胞（hTERT-RPE1；本文中简称为RPE1）。
    注：RPE1细胞为接近二倍体、非转化的人类细胞，常用于研究中心粒组装和纤毛发生。这些细胞遵循与受调控细胞周期协调一致的正常中心粒复制周期。
  2. 将接近汇合的100 mm细胞培养皿中的RPE1细胞以1:5比例传代至含10 ml添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素G和100 µg/ml链霉素的DME/F-12（1:1）培养基的新鲜100 mm培养皿中（该完全培养基称为DME/F-12培养基）。在37 °C、5% CO2条件下培养细胞。
    1. 将12 mm圆形玻璃盖玻片放入盛有50 ml 1 N HCl的带盖玻璃烧杯中，在水浴或培养箱中于60 °C孵育过夜（O/N），不振荡。
    2. 弃去酸液后，用100 ml蒸馏水孵育盖玻片15分钟，期间偶尔振荡，清洗三次。随后同样依次用70%乙醇和95%乙醇各清洗一次。
    3. 在生物安全柜中将盖玻片逐个平铺于实验室吸水纸上干燥，然后用紫外光照射60分钟进行灭菌。
  3. 将2–4个干燥的盖玻片放入35 mm细胞培养皿中。将纤连蛋白或类似纤连蛋白的工程化聚合物溶液（储存浓度为1 mg/ml）用细胞培养用PBS稀释至25 µg/ml。
    1. 在每片盖玻片上加入80–100 µl稀释后的溶液，孵育60分钟以包被盖玻片上表面。加入完全培养基前，用PBS洗涤盖玻片三次。

2. 培养细胞及使用蛋白酶体抑制剂处理细胞

  1. 在每个含有盖玻片的 35 mm 培养皿中接种 2 × 105 个处于异步生长状态的 RPE1 细胞，并加入 2 ml 完全培养基进行培养。每 24 小时更换一次培养基，替换为新鲜预热的完全培养基。
    1. 为分析蛋白酶体抑制对测试蛋白（此处为 VDAC3 或 γ-微管蛋白）在中心体水平上的影响，将细胞在两个 35 mm 培养皿中培养 44 小时。更换培养基为完全培养基，并分别加入终浓度为 5 µM 的 MG115 或终浓度为 0.05% 的 DMSO 作为溶剂对照。同时，向细胞中加入终浓度为 40 µM 的 BrdU，继续孵育 4 小时。
    2. 将每个盖玻片转移至 24 孔板中。每孔加入 500 µl 冰冷甲醇，在 -20 °C 下孵育 10 分钟以固定盖玻片上的细胞。立即用 500 µl 洗涤缓冲液（含 0.5 mM MgCl2 和 0.05% Triton-X 100 的 1× PBS）洗涤盖玻片三次。
  2. 收集 35 mm 培养皿中剩余的细胞，以 1,000 × g 离心 5 分钟。使用所得细胞沉淀通过蛋白质印迹法（western blotting）分析总蛋白（见步骤 6）。

3. BrdU 脉冲与追踪实验以分析不同细胞周期时相中的蛋白质水平

  1. 为分析特定蛋白（此处为 VDAC3、Sas6 或 Cep135）在细胞周期不同阶段中心体上的水平变化，将细胞培养于两个含盖玻片的 35 mm 培养皿中，培养 44 小时。随后更换为含 40 µM BrdU 的完全培养基，并将细胞在细胞培养箱中继续孵育 4 小时。
  2. 从其中一个培养皿中取出盖玻片，转移至 24 孔板中，按照步骤 2.1.2 所述方法使用预冷甲醇固定细胞。
  3. 在 4 小时 BrdU 脉冲标记后，移除含 BrdU 的培养基，用 PBS 洗涤细胞一次，再用完全培养基洗涤一次，加入新鲜培养基，随后在无 BrdU 条件下继续培养不同时间（对于 RPE1 细胞通常再培养 4 小时），然后按照步骤 2.1.2 所述方法固定细胞。
    注意：对于 RPE1 细胞，在 4 小时追踪后，大多数 BrdU 阳性细胞处于 S 期晚期或 G2 期。此结果需针对每种细胞类型独立验证。

4. 免疫染色

  1. 将固定后的盖玻片细胞置于含有200 µl封闭缓冲液（含2% BSA和0.1% Triton X-100的1×PBS）中，30分钟。
    1. 在湿盒中，用封闭缓冲液稀释一抗混合物（通常一种为兔源抗体，另一种为鼠源抗体），4 °C过夜孵育。
    2. 制备湿盒时，将一张湿润的纸巾放入空的1,000 µl枪头盒下半部分。在支架表面铺一条Parafilm膜，每张待孵育的盖玻片对应在Parafilm上滴加一滴抗体溶液（15–20 µl）。将盖玻片细胞面朝下倒置覆盖于抗体液滴上（使细胞浸入溶液中），然后盖上枪头盒盖子。
    3. 再次翻转盖玻片并放回24孔板中。用洗涤缓冲液清洗盖玻片，随后加入150 µl二抗混合液（绿色荧光染料标记的抗兔抗体和红色荧光染料标记的抗鼠抗体，用封闭缓冲液稀释），室温孵育1小时。清洗盖玻片三次。
      注意：荧光染料标记的二抗对光敏感。在步骤4.1.3–5.1.2期间需避免光照。
  2. 进行抗BrdU染色前处理：按照步骤2.1.2所述方法，用500 µl预冷甲醇在-20 °C再次固定已染色的RPE1细胞10分钟。清洗盖玻片三次。
    注意：此步固定可确保在后续酸水解过程中，目标蛋白的一抗和二抗标记保持稳定。
    1. 在室温下用200 µl 2 N HCl孵育细胞30分钟。加入300 µl 1 M Tris-Cl（pH 8）中和，并用洗涤缓冲液清洗细胞三次。
    2. 再次使用200 µl封闭缓冲液在室温下封闭30分钟。
    3. 在湿盒中加入用封闭缓冲液稀释的鼠源抗BrdU抗体，37 °C孵育45分钟。将盖玻片放回24孔板，清洗后加入用150 µl封闭缓冲液稀释的蓝色荧光染料标记的抗大鼠二抗，室温孵育1小时。
  3. 清洗盖玻片三次。在玻璃载玻片上滴加一滴封片剂（含抗荧光淬灭剂，约3–6 µl）。将盖玻片细胞面向下倒置贴附于封片剂液滴上。用柔软的擦拭纸轻轻按压盖玻片边缘，吸去多余液体。沿盖玻片边缘涂抹透明指甲油，密封固定于载玻片上。

5. 免疫荧光图像采集与分析

  1. 使用100倍Plan Apo油镜物镜（数值孔径为1.4）在室温下获取BrdU阳性RPE1细胞的图像。
    1. 将载玻片置于显微镜（参见设备）上，显微镜需配备具备数字成像功能的相机。针对每种荧光染料，通过手动检查实验中所有样品来确定合适的曝光时间（通常在300-1,000毫秒之间）。在获取细胞图像之前，手动确定Z轴方向上合适的上、下焦平面（通常步长为0.2 µm）。使用数字显微成像软件包，对位于不同盖玻片上的不同样品，在Z轴上以相同曝光时间获取不同荧光染料的图像。
  2. 对沿Z轴获取的所有图像堆栈进行去卷积处理（本实验中使用无邻域算法）。
    1. 获取每个图像堆栈沿Z轴的总强度投影。
  3. 对于中心粒彼此靠近的细胞（两个中心粒之间的距离小于2 µm），在两个中心粒周围绘制一个小方框（通常每边20-30像素），并标记所选区域。
    1. 在第一个方框外绘制一个更大的方框（通常每边24-35像素），并标记大方框的选定区域。
    2. 获取每个方框内每种荧光染料的面积（A）和总荧光强度（F）（S表示小方框，L表示大方框）。
    3. 使用Howell et al.29描述的公式分析每种荧光染料的背景校正荧光强度：F = FS – [(FL – FS) × AS / (AL – AS)]。
    4. 通过计算目标蛋白（此处为VDAC3或Sas6）荧光染料的背景校正荧光强度与其内部参照荧光染料（此处为γ-微管蛋白、Sas6或Cep135）的比值，获得目标蛋白的归一化荧光强度。
  4. 在分析中心粒明显分离的细胞时（两个中心粒之间的距离大于2 µm），分别对每个中心粒进行分析，绘制两组独立的方框。在每个中心粒周围绘制一个小方框（通常每边15-25像素），并标记所选区域；再绘制一个更大的方框（每边20-30像素）包围第一个方框，并标记所选区域。
    1. 获取每个方框内每种荧光染料的面积（A）和总荧光强度（F），并按照步骤5.3.3所述方法，分别对每个中心粒计算其荧光染料的背景校正荧光强度。
    2. 将来自两个中心粒的每种蛋白的背景校正荧光强度合并，以获得该细胞中该蛋白的总中心粒水平。
    3. 通过计算目标蛋白的总中心粒强度与其内部参照蛋白的总中心粒强度的比值，获得目标蛋白的归一化强度。
  5. 对每种实验条件至少分析15-25个细胞，并在电子表格中绘制图表。

6. 使用蛋白质印迹法分析总蛋白

  1. 将细胞重悬于含有 50 mM Tris-HCl（pH 8）、150 mM NaCl、1% Nonidet P-40、1% 脱氧胆酸钠和 0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS）的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中，冰上孵育 10 分钟以裂解细胞。
    1. 在 10,000 × g 下离心 10 分钟，分离上清裂解液与沉淀组分，并使用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒测定各裂解液的总蛋白浓度。
  2. 取 40 µg 裂解液与 4× SDS-PAGE 上样缓冲液（50 mM Tris-Cl，pH 6.8，2% SDS，10% 甘油，100 mM 二硫苏糖醇，0.1% 溴酚蓝）混合。
    1. 样品于沸水浴中加热 10 分钟，随后在 12.5% 变性 SDS-PAGE 凝胶中以恒定电压 200 V 电泳分离。
  3. 采用 Western 印迹技术，将 SDS-PAGE 分离后的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上（在低温条件下以恒定电压 90 V 转移 1 小时）。
    1. 用含 3% 脱脂奶粉的 1× PBS 封闭膜，随后在室温下与稀释的一抗溶液（此处为兔抗 VDAC3、兔抗 γ-微管蛋白和鼠抗 α-微管蛋白）孵育 1 小时。
    2. 使用 PBS-T 缓冲液（1× PBS 加 0.2% Tween-20）洗涤膜三次，每次振荡孵育 5 分钟，然后将膜与近红外（IR）荧光染料标记的抗兔和 IR 荧光染料标记的抗鼠二抗混合液（用 PBS-T 稀释）在室温下孵育 1 小时。
    3. 再次洗涤膜三次，随后使用适用于免疫印迹检测的红外荧光成像系统扫描膜以分析条带。

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结果

我们最近的研究发现，VDAC3（一种线粒体孔蛋白）具有新的中心体定位和功能16,28。使用特异性针对VDAC3的抗体对包括RPE1细胞在内的多种哺乳动物细胞进行免疫染色，结果显示中心体部位有明显的染色信号，而线粒体染色相对较弱。我们还发现，中心体定位的VDAC3优先与母中心粒相关，且内源性及异位表达的VDAC3在中心体的分布均受到降解机制的调控16。为了验证定量免疫荧光（IIF）检测方法的可靠性，我们检测了处于S期细胞中与中心体相关联的VDAC3蛋白水平的变化。

在此实验中，对异步生长的RPE1细胞分别用蛋白酶体抑制剂MG115或对照溶剂DMSO处理4小时。为了将分析限定在处于S期并正在进行中心体组装的细胞，我们仅检测了在相同4小时内掺入BrdU且具有两个间距较近的中心体（彼此间距在2 µm以内）的细胞。我们观察了经BrdU和细胞核染色的对照组与MG115处理组的多个随机视野（图1A），结果表明，与对照处理（约56%）相比，MG115短时间处理对RPE1细胞中BrdU的掺入率（约58%）无显著影响。由于我...

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讨论

细胞生物学中的定量显微技术通常与活细胞成像实验相关，例如荧光共振能量转移（FRET）、光漂白后荧光恢复（FRAP） 等等。 然而，近年来越来越多的细胞生物学家开发出针对固定细胞的不同定量显微镜检测方法27,34-36重要的是，深入了解中心体生物学通常需要明确某些蛋白质在中心体内的特异性功能，而这些蛋白质在中心体内的亚群可能受到与其他亚群不同的调控。因此，我们建立了一种定量免疫荧光（IIF）检测方法，用于特异性分析同一蛋白质在两种不同处理样本中相对的中心体定位水平。由于该方法要求细胞分别固定并处理在不同的盖玻片上，我们引入了内参标准用于归一化，以更好地控制因必须分别操作两组实验细胞群体而可能产生的技术偏差，从而提高检测的准确性。此前仅有少数研究37 已使用此类内参标准来测定待测蛋白相对荧光强度的研究。

虽然选择内参标准物对保证检测的准确性至关重要，但这可能是最具挑战性的环节。理想情况下，中心粒对在S期进行复制，随后在G2期积累额外的中心体周围物质（PCM）组分，包括γ-微管蛋白，从而使两个成熟的中心体成为有丝分裂纺锤体的两...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院基金（GM77311）和俄亥俄癌症研究协会种子基金（资助给 H.A.F.）资助。SM 部分由俄亥俄州立大学综合癌症中心人类癌症遗传学项目提供的“Up on the Roof”奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纤连蛋白SigmaF81411 mg/ml 水溶液储存液
DMSOSigmaD2650
MG115SigmaSCP000510 mM DMSO 储存液
BrdUSigmaB500210 mM DMSO 储存液
抗-γ-微管蛋白（小鼠单克隆，克隆号 GTU 88）SigmaT 6557IIF 封闭缓冲液中 1:200 稀释 
抗-VDAC3（兔多克隆） Aviva Systems BiologyARP35180-P050IIF 封闭缓冲液中 1:50 稀释，WB 封闭缓冲液中 1:1,000 稀释
抗-Sas6（小鼠单克隆） Santa Cruz Biotechnologysc-81431IIF 封闭缓冲液中 1:100 稀释
抗-Cep135（兔多克隆）Abcamab-75005IIF 封闭缓冲液中 1:500 稀释
抗-BrdU（大鼠单克隆） Abcamab6326IIF 封闭缓冲液中 1:250 稀释
Alexa Fluor 350 山羊抗大鼠 IgG (H+L)Life TechnologiesA21093IIF 封闭缓冲液中 1:200 稀释
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG (H+L) 抗体Life TechnologiesA21202IIF 封闭缓冲液中 1:1,000 稀释
Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG (H+L) 抗体Life TechnologiesA21203IIF 封闭缓冲液中 1:1,000 稀释
Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG (H+L) 抗体Life TechnologiesA21206IIF 封闭缓冲液中 1:1,000 稀释
Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG (H+L) 抗体Life TechnologiesA21207IIF 封闭缓冲液中 1:1,000 稀释
抗-γ-微管蛋白（兔多克隆）SigmaT5192WB 封闭缓冲液中 1:1,000 稀释
抗-α-微管蛋白（小鼠单克隆，DM1A）SigmaT9026WB 封闭缓冲液中 1:20,000 稀释
Alexa Fluor 680 驴抗兔 IgG (H+L)Life TechnologiesA10043WB 封闭缓冲液中 1:10,000 稀释
IRDye800CW 标记的小鼠 IgG (H&L) 抗体Rockland Antibodies610-731-002WB 封闭缓冲液中 1:10,000 稀释
SlowFade Gold 抗荧光淬灭封片剂 Life TechnologiesS36936封片介质
圆形盖玻片 12CIR.-1Fisherbrand12-545-80
Olympus IX-81 显微镜Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR 相机QImaging 32-0082B-238
100X Plan Apo 油浸物镜Olympus数值孔径 1.4
Slidebook 软件包Intelligent Imaging Innovations
Odyssey 红外成像系统Li-cor Biosciences
双辛可宁酸（BCA）测定法Thermo Scientific23227
U-MNU2 窄带紫外滤光立方OlympusU-M622滤光片
U-MNU2 窄带蓝光滤光立方OlympusU-M643滤光片
U-MNU2 窄带绿光滤光立方OlympusU-M663滤光片

参考文献

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