大鼠颈动脉血管球囊损伤与管腔内给药

摘要

本方案采用球囊导管对大鼠颈动脉造成管腔内损伤，从而诱导新生内膜增生。这是一种研究血管损伤后重塑机制的成熟模型，也广泛用于评估潜在治疗策略的有效性。

摘要

大鼠颈动脉球囊损伤模型已建立二十余年，现仍为研究血管平滑肌去分化、新生内膜形成及血管重塑过程中分子与细胞机制的重要方法。雄性Sprague-Dawley大鼠是该模型最常用的实验动物，雌性大鼠因雌激素对血管疾病具有保护作用，可能引入实验变异，故不推荐使用。通常对左侧颈动脉进行损伤处理，右侧颈动脉则作为阴性对照。左侧颈动脉损伤由球囊扩张所致，球囊扩张可剥脱血管内皮并扩张血管s 血管壁。在损伤后，可评估潜在的治疗策略，例如使用药理学化合物，或进行基因或shRNA转移。通常在基因或shRNA转移过程中，将受损的血管腔局部暴露于编码特定蛋白或shRNA的病毒颗粒中，持续30分钟，以实现向受损血管壁的递送与表达。新生内膜增厚（代表增殖性血管平滑肌细胞）通常在损伤后2周达到高峰。此时点通常为收获血管组织的最佳时机，用于对细胞信号通路以及基因和蛋白表达进行细胞与分子水平的分析。根据实验目的，也可在更早的时间点收获血管，以确定特定蛋白或通路的表达起始或激活情况。可通过组织学染色、免疫组织化学、蛋白/mRNA检测以及活性检测对血管进行表征与评估。同一动物的完整右侧颈动脉是理想的内部对照。通过将受损动脉与内部右侧对照动脉进行比较，可评估损伤诱导的分子与细胞参数变化。同样，通过将经治疗的受损动脉与仅受损的对照动脉进行比较，可评估不同治疗方式的效果。

引言

球囊导管是一种用于血管成形术的医疗器械，旨在扩张血管中由动脉粥样硬化斑块或血栓引起的阻塞部位。通过球囊的膨胀迫使狭窄的血管管腔扩张，从而逐步恢复血流，缓解下游缺血症状，如心绞痛、心肌梗死和腿部疼痛。然而，尽管血管成形术取得了显著成功，但术后并发症仍限制了其疗效，例如因机械力导致的血管气压损伤（球囊损伤），进而引起血管壁重构，以及在许多情况下出现血管管腔再次狭窄（再狭窄）¹。

为了帮助研究人员理解球囊损伤相关血管壁重塑的潜在机制，已开发出多种模拟血管成形术过程的动物模型²。在所有用于建模的动物物种中，大鼠是最常使用的一种。与兔、犬和猪相比，大鼠的优势在于成本低、操作相对简便，以及目前对大鼠生理学已有较为充分的认识。尽管小鼠因拥有大量基因修饰品系而具备额外优势，但其血管过细，难以插入球囊导管。在过去三十年中，实验用大鼠使研究人员得以更深入地了解新生内膜形成和血管重塑背后的分子与细胞机制^3-6。除了球囊损伤外，血管重塑还参与大多数主要血管疾病的发生发展，例如动脉粥样硬化^7,8、高血压⁹和动脉瘤¹⁰。因此，通过球囊损伤模型获得的知识通常有助于整体血管壁疾病的研究。

大鼠球囊损伤模型的总体目标不仅是进一步理解血管疾病，而且是检验新型药物在疾病控制中的有效性^11,12目前，临床治疗....

方案

注意：以下实验所涉及的动物使用已通过机构动物照护与使用委员会（IACUC）的审查与批准。

1. 术前准备

1. 使用前对手术器械进行灭菌。
   1. 所有手术器械在手术前 24 小时或更短时间内进行高压蒸汽灭菌。若同一天进行多次手术，两次手术之间须使用干珠灭菌器对器械进行灭菌。
2. 使用前对生理盐水溶液进行过滤除菌。
3. 称量大鼠体重，并计算麻醉药物剂量（氯胺酮 80 mg/kg 和赛拉嗪 7 mg/kg）。
4. 通过腹腔内注射（i.p.）给予麻醉药物。
   1. 注射后 5–10 分钟通过夹捏足趾检查镇静程度。若镇静不充分，可追加小剂量药物（氯胺酮 7 mg/kg 和赛拉嗪 0.6 mg/kg）。
   2. 确保针头插入足够深度以实现腹腔内给药，因为未能将全部药液注入腹腔会导致镇静不足。
      注意：若药物意外注入皮下（s.c.），术后数天可在注射部位观察到皮肤溃疡和脱毛现象。
5. 皮下注射（s.c.）3 ml 无菌生理盐水溶液。使用无菌棉签，将少量眼用软膏涂抹于双眼，以防止角膜干燥。
6. 准备加热设备。通过微波炉或水浴预先加热保温垫。
7. 将动物仰卧位放置于手术台上。
   1. 去除颈部腹侧区域的毛发。用棉签涂抹脱毛剂，等待 30....

结果

损伤后两周，取颈动脉进行切片并进行形态学分析。颈动脉横切后采用苏木精-伊红（H&E）染色（图1、图2B、C和图3）。大鼠颈动脉管壁包含四层弹性膜，染色后呈粉红色条带。最外层为外弹性膜（EEL），最内层为内弹性膜（IEL），二者之间的区域为中膜平滑肌层（图1）。IEL内侧区域为内膜，在完整血管中为单层内皮细胞；而在损伤血管中则表现为内膜增生。在损伤的颈动脉中，由于平滑肌细胞增殖，中膜厚度较对照血管增加。新生内膜的厚度等于或大于同一动脉中膜的厚度。外膜也因大量胶原沉积而增厚（图1B、D）。对于使用待检测试剂处理以评估其抑制新生内膜形成能力的动脉（本例中为STIM1 shRNA），其横切面的新生内膜面积较对照损伤动脉更小（图2）。STIM1 shRNA介导的STIM1基因敲低效果明确，与对照损伤血管相比，损伤血管新生内膜及中膜中的STIM1表达水平显著降低。

正如讨论部分将提到的，外科医生应谨慎避免过度扩张球囊而导致血管过度损伤。这会造成血管壁破.......

讨论

大鼠颈动脉球囊损伤模型在2007年由Tulis进行了详细描述³⁴。Tulis博士对该手术操作的各个细节均作了全面阐述。建议有意开展该实验操作的读者仔细阅读Tulis的实验方案。然而，我们在一点上与Tulis博士的建议不同：我们建议使用空气而非生理盐水或其他液体来充盈球囊。根据我们的实践经验，使用液体充盈时几乎难以避免气泡的产生。此外，在损伤过程中更难灵活调节压力，可能对动脉造成额外的应力和损伤。另一个 技术要点是在手术期间使用一个小“垫枕”（可用纸巾或纱布制成）支撑动物的颈部。

根据既往文献报道以及作者多年大鼠球囊损伤手术的经验，本文作者建立了一种稍作修改并简化的实验方案³⁵。此外，本文还展示了在损伤后立即进行腔内给药治疗的技术。该操作使该存活手术的总时长增加了一倍左右，因此需要操作者具备更丰富的实际操作经验。手术时间延长后的主要关注点在于麻醉深度的维持。初始麻醉剂量通常可维持大鼠镇静状态30–45分钟，因此在30分钟的灌注期间应频繁通过夹趾反射检查动物的麻醉状态。本手术选择注射类麻醉药物而非吸入性麻醉的主要原因在于大鼠头部的摆放方向。根据作者经验，当大鼠头部朝向术者仰卧时，球囊导管插入颈动脉的操作更为简便。手.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 法式 Fogarty 球囊取栓导管	Edwards Lifesciences，德国	120602F
Deltaphase 操作板 - 包含 2 个垫片 &和 2 种绝缘体	Braintree Scientific, Inc.	39OP
LED光源	Fisher Scientific	12-563-501
哈特曼蚊式止血钳 4” 弯曲的	Apiary Medical, Inc. 美国加利福尼亚州圣地亚哥	gS 22.1670
克里尔牵开器 4” 双端	Apiary Medical, Inc.	gS 34.1934
其他外科器械	Roboz外科器械公司，美国马里兰州盖瑟斯堡
外周静脉留置针，24 G	BD	381312
盐酸氯胺酮，100 mg/ml，10 ml	Ketaset- Patterson Vet	07-803-6637
赛拉嗪（AnaSed），20 mg/ml，20 ml	Ketaset- Patterson Vet	07-808-1947
布托啡诺，0.3 mg/1 ml（5支/盒）	Ketaset- Patterson Vet	07-850-2280
Nair 婴儿润肤油脱毛乳液 - 9 盎司	亚马逊/沃尔玛/CVS	N/A
充气装置	Demax Medical	DID30
D300 三通止流夹	B.Braun Medical Inc.	4599543
人工泪液软膏	Rugby Laboratories，美国佐治亚州杜鲁斯	N/A