Abstract
Trasfezione di DNA è stato prezioso per le scienze biologiche e con i recenti progressi verso organotipica preparazioni fetta cervello, l'effetto di vari geni eterologhi potrebbe quindi essere indagato facilmente pur mantenendo molti aspetti della biologia in vivo. C'è stato un crescente interesse per trasfettare neuroni terminalmente differenziate per i quali i metodi di trasfezione convenzionali sono stati irto di difficoltà, come basse rese e le perdite significative in vitalità. Trasfezione Biolistic può aggirare molti di questi problemi ma solo di recente è questa tecnica stata modificata in modo che sia suscettibile per l'uso in tessuti dei mammiferi.
Nuove modifiche alla camera di acceleratore hanno migliorato la precisione di tiro della pistola gene e aumentato la sua profondità di penetrazione consentendo anche l'uso di pressione del gas inferiore (50 psi) senza perdita di efficienza di trasfezione oltre a permettere una diffusione mirata regioselettiva della paARTICOLI per entro i 3 mm. Inoltre, questa tecnica è semplice e rapido da eseguire rispetto microiniezioni noiosi. Sia transiente ed espressione stabile sono possibili con nanoparticelle bombardamento cui espressione episomiale può essere rilevato entro 24 ore e la sopravvivenza cellulare ha dimostrato di essere migliore di, o almeno uguale, metodi convenzionali. Questa tecnica ha però un vantaggio fondamentale: permette la trasfezione di essere localizzato all'interno di un singolo raggio trattenuto permettendo così all'utente di isolare anatomicamente effetti del gene eterologo. Qui vi presentiamo un protocollo in profondità per preparare vitale adulti fette organotipiche e li presenta al regioselettiva trasfezione mediante una migliore pistola gene.
Introduction
Originariamente la tecnica biolistic, una frase turn-of-balistica per "biologici", è stata istituita per particella-mediato trasferimento genico nelle cellule vegetali 1. Questo metodo fisico di trasformazione cellulare micro o nanoparticelle accelera ad alta velocità per superare le barriere fisiche delle membrane cellulari impermeabili al fine di trasportare carichi come il DNA o coloranti. Poiché non dipende da specifici ligandi-recettori e / o le proprietà biochimiche nelle membrane di superficie cellulare, il trasferimento genico mediato da particelle può essere facilmente applicata ad una varietà di sistemi biologici come fettine cerebrali organotipica.
Uso fette organotipiche presentano vantaggi rispetto ad altri in piattaforme vitro in quanto mantengono molte proprietà anatomiche e biochimiche che sono pertinenti al vivo biologia 2-4. Le fette per lo più conservano le caratteristiche architettoniche locali da dove hanno origine e preserve l'attività neurochimica e la connettività delle sinapsi. L'uso di fette di cervello per la ricerca di base, e in sforzi farmaceutiche, ha aumentato in concomitanza con il numero di possibili manipolazioni biotecnologiche per misurare e monitorare i comportamenti neurobiologici del cervello in un contesto in vivo come 3,5-7. I principali vantaggi per l'utilizzo di sistemi di test basati fetta-organotipica è che fornisce controllo sperimentale facile e consente manipolazioni precise di ambienti extracellulari.
Fruttuosamente, sistemi di coltura fetta organotipica sono stati stabiliti da una varietà di regioni del cervello, come, ma non limitato a, la corteccia, midollo spinale, cervelletto e 8-10. Inoltre, un certo numero di co-colture sono state dimostrate, che permetta la valutazione della comunicazione intercellulare tra le regioni cerebrali distali e tra neuroni e cellule patologiche 11,12. Molti protocolli sono già stati istituiti per successfully fette cultura organotipica e in grado di mantenere la redditività a lungo termine e molti studi recenti oggi utilizzano i metodi di interfaccia membrana e le varie modifiche ad esso 13. Questo principio mantiene le fette organotipiche all'interfaccia tra il fluido e l'atmosfera umidificata dell'incubatore posizionando le fette su un filtro a membrana porosa. Il mezzo può quindi fornire nutrienti sufficienti per alimentare le fette organotipiche tramite movimento capillare. In genere le fette sono state preparate dai primi animali postnatali (3-9 giorni; P3 - 9). Tuttavia, i tessuti cerebrali da queste fette di un elevato livello di plasticità cellulare e hanno una resistenza intrinseca alle sollecitazioni meccaniche, che è utile per ottenere colture vitali, ma sinapsi mature e circuiti neuroanatomici non sono pienamente sviluppati in vivo fino a 2 o 3 settimane di età 14. Ad esempio, le osservazioni precedenti avevano mostrato che le fettine di ippocampo ottenute da P0 - 1 neonati, anche se altamente Viable dopo la preparazione, a poco a poco ha perso alcune caratteristiche morfologiche. In sostanza, essi hanno dimostrato di essere inadatto per colture a lungo termine suggeriscono cellule immature erano più probabilità di de-differenziare rispetto alle colture organotipiche da animali più vecchi 15,16. Per questo motivo il nostro metodo è stato ottimizzato per adulti fettine di cervello organotipica in cui la maturazione e lo sviluppo architettonico hanno raggiunto i loro fasi terminali 13,17-21. Tuttavia, questo metodo è adatto per neonato e fette organotipica giovanili anche.
Una volta che le fette organotipiche vitali sono stati prodotti l'intera piastra contenente le fette può essere portato alla biolistic monte e presentata al regioselettiva consegna e trasfezione. Montaggio corretto della pistola genica (come descritto in figura 1), orientate a 90 ° ad una distanza di 10 mm direttamente sulle fette (dall'apertura al tessuto), permette la rapida consegna biolistic dei 40 nm andareparticella ld rivestito carichi. Questi carichi come coloranti e vettori di DNA fluorescenti, così come qualsiasi gene di interesse, vengono prontamente consegnati nelle fette vitali con facilità. Questo metodo descrive così il protocollo necessari per fornire, in maniera regioselettiva, carico rivestito nanoparticelle d'oro nella vitali fettine di cervello organotipica. La canna della pistola gene e il montaggio ottimale può essere visto in Figura 1. Per ulteriori informazioni riguardanti le botte e nanoparticelle migliori balistica, vedere O'Brien, et al. 17.
Parametri successivi sono indicati anche per l'utente di ottimizzare le condizioni quali la corretta quantità di oro consegnato per area di destinazione, definita come microcarrier Caricamento Quantità (MLQ), e per determinare la quantità di DNA caricato per mg di oro, definito come il DNA Loading Rapporto (DLR). Prima di precipitare il DNA su particelle di oro e di caricarle nel tubo Tefzel che comprende le cartucce della pistola gene reale '9 ;, è necessario calcolare la quantità di DNA e oro richiesto per ogni trasfezione che possono differire tra i tessuti e le condizioni (rapporto dovrebbe essere mantenuta tra 1 mg oro e 1 mg di DNA a 1: 5). E 'di vitale importanza per preparare la giusta proporzione di MLQ a DLR altrimenti rivestite di DNA particelle d'oro potrebbero aderire insieme formano più grande agglomerato previsto, che potrebbe ridurre l'omogeneità complessiva della diffusione biolistic come pure i danni incremento tessuti e citotossicità.
Questo metodo mostra i recenti miglioramenti nella consegna biolistic, che sono stati testati e determinati per essere suscettibili per neonati, giovani e adulti fettine di cervello organotipica. Inoltre, sfruttando ridotta diffusione biolistic della canna della pistola gene, l'utente è ora in grado di trasfettare selettivamente una regione puntuale nel cervello. Dopo il tempo di incubazione del caso, l'espressione delle proteine fluorescenti, che raggiunge i suoi tassi massimi tra 24 e 48hr, può essere visualizzato da epifluorescenza e microscopia confocale. Questi fluorofori consentono l'analisi morfologica e la localizzazione delle singole cellule all'interno di strutture biologicamente rilevanti. Tuttavia, la modulazione regioselettiva delle fette organotipiche di altri geni eterologhi può essere monitorato da eventuali altre prove suscettibili di questi preparati. Possibili strategie di lavoro per la consegna del gene localizzato sono presentati in Figura 2.
Protocol
L'uso di animali e tessuti animali dovrebbe attenersi strettamente ad approvazione del comitato etico in base alle norme locali e regolamentazione. Tutti i tessuti ottenuti nel corso di questo studio aderito alle linee guida della sperimentazione animale del MRC-LMB.
1. Preparazione dei Materiali e cultura media
- Preparare tutte le soluzioni con acqua Millipore; utilizzare solo reagenti puri per analisi. Preparare e conservare tutti i reagenti a temperatura ambiente (salvo diversamente indicato).
- Fate 500 ml di soluzione salina tamponata HEPES (10 HEPES mM, 120 mM NaCl pH 7,2). Filtrare attraverso un 0,2 micron unità filtro sterile. Conservare a 4 ° C.
- Fate 500 ml di tampone fosfato salino (PBS; 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4). Sterilizzare in autoclave.
- Preparare medio neuronale completandola DMEM (mezzo di Eagle modificato di Dulbecco) con 25 mM HEPES, siero fetale bovino al 10%, glucosio 30 mM, 1: 100 N2 supplement, penicillina-streptomicina 1.100 U / ml; pH 7.2. Filtrare con un 0,2 micron unità filtro sterile. Conservare a 4 ° C.
- Preparare la soluzione di polivinilpirrolidone (PVP) stock con 20 mg di PVP in 1 ml di etanolo al 100%. Aliquota presente in 1 ml di quantità, congelare e conservare a -20 ° C. Soluzione di lavoro è di 0,05 mg / ml, quindi aggiungere 10 ml di soluzione madre PVP per ogni 4 ml di etanolo al 100%.
- Preparare una soluzione madre 0,05 M spermidina in acqua Millipore; regolare il pH a 7,2.
- Fare una soluzione di agarosio 2% in DMEM (2 g di agarosio grado elettroforesi in 100 ml di DMEM in una bottiglia tappo a vite sterilizzato). MICROONDE questo fino l'agarosio si è dissolto. Conservare in frigorifero a 4 ° C per diverse settimane, se necessario.
2 Preparazione di organotipica fette
- Euthanize C57 Nero 6 topi di età desiderato CO 2 asfissia seguita da decapitazione. Rimuovere il cervello con tagli laterali del cranio a partire forame magno e termina ai lobi olfattivi. Sollevare delicatamente il cranio dalla parte posteriore per esporre il cervello.
- Tagliare tra i lobi olfattivi e la corteccia frontale, e rostrale al cervelletto. Sollevare delicatamente la parte rostrale del cervello e tagliare i nervi ottici. Infine, rimuovere il cervello e metterlo in una capsula di Petri riempita con soluzione fisiologica fredda ghiaccio HEPES-buffered sul ghiaccio.
- Utilizzando un microscopio da dissezione, togliete la pia utilizzando una pinza sottile; rimuovere con cura i vasi sanguigni e le meningi intorno al cervello.
- Posizionare il cervello fresco in un piccolo stampo destinatario e coprire con la soluzione di agarosio raffreddato leggermente al di sopra RT. Poi rapidamente raffreddare lo stampo a 4 ° C ponendolo su ghiaccio.
NOTA: Elaborare le fette il più rapidamente possibile per evitare la perdita di vitalità. - Quando l'agarosio si è impostato (5 - 10 minuti), rimuovere il cervello agarosio-embedded dallo stampo (tagliare se necessario), e poi incollarla alla piattaforma vibroslicer. Mettere questo in una camera vibroslicer contenente ghiaccio sterile PBS freddo. Disinfect camera vibroslicer prima di essere utilizzato con il 70% di etanolo per minimizzare contaminazioni successive.
- Tagliare il cervello utilizzando un vibroslicer su misura o equivalente commerciale. Il concetto di modello era progettare una affettatrice tessuto che potrebbero generare grandi movimenti di ampiezza ed elevata frequenza orizzontale al bordo della lama, riducendo al minimo le vibrazioni verticali.
- Utilizzare la frequenza di oscillazione di 90 Hz, ad una ampiezza di 1,5 - 2,0 mm, la lama di taglio posizionato ad un angolo di 15 ° rispetto al piano orizzontale; impostare il blocco di montaggio tenendo il cervello agarosio-embedded a muoversi a 1,7 millimetri / min verso la lama. Raccogliere sezioni (150 micron) in una camera contenente multimediale ghiaccio coltura freddo (DMEM Pen / Strep + 10% FCS). Visualizza il taglio e la manipolazione delle fette di tessuto come video supplementare in Arsenault e O'Brien 13.
- Posizionare delicatamente le fette in inserti di coltura cellulare (0,4 micron, diametro 30 mm) in un vassoio 6 multi-bene con i med culturaia sull'esterno dell'inserto, e incubare in un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2.
NOTA: Per la vitalità del tessuto adeguato, essere estremamente delicata durante il trasferimento e manipolazione delle fette. Inoltre, troppo liquido impedirà le fette organotipiche di aderire alla membrana del filtro. In questo caso, rimuovere il liquido in eccesso o piastra di nuovo. - Sebbene fette organotipiche possono essere coltivate per un paio di settimane, procedere alla trasfezione entro e non oltre 4 giorni dopo placcatura per i migliori rendimenti di trasfezione.
NOTA: Per evitare la proliferazione gliale in condizioni di coltura a lungo termine, l'uso Arac o siero medie libero 2.
3 Preparazione di DNA rivestite Micro e Nano-proiettili
- Preparare nano-proiettili usando 40 nm di diametro particelle d'oro. In breve, aggiungere 50 ml di 0,05 M spermidina e 10 microlitri di DNA a 1 mg / ml (pEYFP-N1) a 10 mg di particelle d'oro.
- Aggiungere calcio e spermidina nel mix soluzionetura durante la DNA-oro micro particelle di preparazione al fine di facilitare il legame di molecole di DNA per le nanoparticelle d'oro.
NOTA: La quantità di DNA usato per mg di vettori oro (DLR), deve essere compresa tra 1 e 5 mg di DNA per 1 mg di oro. Inoltre, la quantità di particelle veicolo oro che verrà girato per cartuccia (MLQ), si dovrebbe comprese tra 0,1 e 0,5 mg di oro. Il DLR e MLQ devono essere provati ed ottimizzati per ogni utente a seconda del particolare sistema in esame, nonché il tipo di particella e gene pistola utilizzata.
- Aggiungere calcio e spermidina nel mix soluzionetura durante la DNA-oro micro particelle di preparazione al fine di facilitare il legame di molecole di DNA per le nanoparticelle d'oro.
- Mescolare con un vortice mentre lentamente aggiungendo 50 ml di 1 M CaCl 2 in frazioni di 10 - 15 ml. Dopo 5 min di vortex occasionale, centrifugare a 1000 xg per 30 secondi, quindi rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet di particelle d'oro in 3,5 ml di 0,075 M PVP.
- Disegna questa sospensione in tubo (diametro 2,36 millimetri interno) utilizzando una siringa. Posizionare il tubo nella stazione di preparazione tubo. Lasciare che ilparticelle d'oro di stabilirsi e rimuovere il surnatante tramite aspirazione con una siringa. Ruotare il tubo per diffondere uniformemente le particelle d'oro, che sono stati successivamente essiccato sotto un flusso di azoto costante a 5 l per min.
- Per creare DNA-proiettili, tagliare il tubo con un cutter tubo di 1 cm di lunghezza. O inserire immediatamente nella cartuccia della pistola gene o mantenere essiccata (4 ° C) fino al momento.
4. Biolistic trasfezione su Organotipica Slices
- Eseguire i seguenti passaggi all'interno di una cappa a flusso laminare sterile.
- Inserire una batteria da 9 V e un supporto della cartuccia vuota nel gene pistola Helios.
- Fissare la pistola gene al serbatoio di elio con il tubo elio. Fuoco 2 - 3 spazi (slot vuoto) a 50 psi per pressurizzare il tubo di elio e serbatoi nella pistola.
- Caricare le cartucce contenenti l'oro rivestite di DNA nei supporti della cartuccia e caricare il supporto nella pistola gene.
- Svitare la pistola distanziale gene e allegarela canna della pistola gene modificato alla pistola genica.
- Utilizzando pinze sterili, posizionare un inserto filtro contenente la fetta organotipica in un piatto di plastica sterile.
- Rimuovere i supporti dalle fette organotipiche.
- Impostare la pressione del gas a 50 psi.
NOTA: La protezione degli occhi è essenziale e protezione per le orecchie consigliabile. - Inserire la pistola genica a distanze opportune utilizzando il montaggio misurata a 10 mm. Mirare accuratamente il centro della canna sopra la regione desiderata per la consegna genetica.
- Dopo la cottura, sostituire gli inserti di nuovo nel loro piatto con mezzi freschi e restituirli alle condizioni di crescita normali, vale a dire, 37 ° C con il 5% di CO 2 incubatore.
- Una volta terminato, chiudere il serbatoio di elio, rilasciare la pressione dalla pistola gene e staccare la pistola gene dal serbatoio di elio.
- Rimuovere il supporto della cartuccia e gettare le cartucce e pulire la pistola gene.
- Controllare il tessuto per la morfologia e per la penetrazione di successo da Visuanalizzare le fette utilizzando un microscopio invertito. Se si utilizza microparticelle, in modo uniforme disperdere l'oro; non ci dovrebbero essere aree dense di particelle d'oro visto sulla fetta. Nanoparticelle a causa delle loro piccole dimensioni non possono essere visti come singole unità di tecniche di microscopia convenzionale.
- Dopo l'intervallo di tempo appropriato (di solito 1 - 2 giorni), sistemare le fette in 4% paraformaldeide (PFA) per l'osservazione al microscopio.
NOTA: Fissaggio in PFA non è sempre desiderato. Per l'imaging cellulare dal vivo evitare questo passaggio.
5 Fissaggio e visualizzazione di cervello fette
- Dopo la trasfezione biolistic, lavare le fette due volte in PBS per 2 min.
- Fissare fette incubando in fresco, freddo ghiaccio 4% PFA in PBS per 20 min.
- Lavare le fette due volte in PBS per 2 min.
- Tagliare delicatamente intorno alla membrana supporta l'utilizzo di un bisturi, senza disturbare le fette montati su di essi. Utilizzare pinze per posizionare ogni membrana supporto / fetta su un vetrino da microscopio. Appoggiare la organotypfette ic sulla parte superiore della membrana sul vetrino.
- Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sulla parte superiore della fetta e aggiungere un coprioggetto delicatamente, senza alcuna forza direttamente in contatto con la fetta organotipica.
- Fissare il vetrino con un sottile strato di smalto.
- Guarda le fette su un microscopio adeguato.
6. Applicazioni confocale
- Visualizza le fette utilizzando un laser a scansione microscopio confocale in posizione verticale con un 60X / 1,4 apertura numerica (NA) immersione in olio lente dell'obiettivo.
NOTA: La caratteristica più problematica del microscopio confocale è la dimensione foro stenopeico (impostato a 1 UA), che è in grado di isolare e raccogliere un piano di messa a fuoco, eliminando così il fuori fuoco 'foschia' normalmente visto con un campione fluorescente. Dettagli raffinati sono spesso oscurati da questa foschia e non possono essere rilevati in un microscopio nonconfocal. - Impostare il laser Argon di lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e ottimizzare per la raccolta di emluce itted nella banda 500-520 nm. In genere, raccogliere le immagini a 1.024 x 1.024 pixel e con pile di z-sezioni a 0.5 micron intervalli fino a comprendere l'intera larghezza di ciascuna cellula nervosa che è stata analizzata.
- Per osservare la morfologia del nucleo, contatore macchia queste cellule con DAPI (lunghezza d'onda di eccitazione fissati a 405 nm ed emissione di luce raccolta tra 420-4 40 nm). Infine, per l'esame di fluorescenza rossa, impostare il laser a 561 nm per l'eccitazione e 565-620 nm di emissione.
- In genere, acquisire immagini utilizzando uno zoom 4X scansione che copriva una superficie di 57,6 micron 2; le dimensioni delle immagini sono stati nella regione di 1.024 x 1.024 pixel. Pile record di z-sezioni in 0,5 micron intervalli e proiezioni di 5-8 fotogrammi combinati.
Representative Results
Redditività fetta Organotipica può essere monitorato con l'attività di lattato deidrogenasi, etichettatura ioduro di propidio, e dUTP colorazione come è stato precedentemente riportato 13,22. Evidentemente, la vitalità e l'integrità delle fette sono importanti per l'espressione sostenuta a lungo termine del carico trasportato genetica. Dopo la consegna biolistic nelle fette organotipiche, l'espressione del gene eterologo fluorescenza è stata monitorata mediante microscopia confocale. La tenuta della diffusione biolistic con la canna modificata può essere visto in Figura 3A. Figura 3B mostra un'immagine rappresentativa della regione dell'ippocampo transfettate con DNA rivestito nanoparticelle d'oro. Figura 4 mostra immagini rappresentative di trasfettate fette organotipica topo adulto. Come si vede in Figura 4A, un neurone Purkinje con un notevole porto dendritica trovato all'interfaccia dello strato di Purkinje e lo strato molecolare del cerebellum mostra etichettatura pronunciata dopo trasfezione transiente biolistic con pEGFP-N1. figura 4B mostra un ingrandimento maggiore di questi dendriti, dove si possono osservare spine. figura 4C mostra una cellula piramidale della regione CA1 dell'ippocampo dopo la consegna biolistic di nanoparticelle d'oro rivestite pDSredFP .
Coloranti fluorescenti anziché codificato carichi di DNA possono anche essere utilizzati in modo simile a visualizzare caratteristiche morfologiche in fettine organotipiche. DiO, che etichetta le membrane plasmatiche, può più rapidamente delineare morfologie delle singole celle oppure può essere utilizzato in combinazione con un biolistic DNA rivestito consegnato alla stessa regione per confermare la regioselection. Come si vede nella Figura 5A un neurone tinto con DiO nell'ippocampo mostra anche lunghi dendriti con numerose spine. Una freccia indica l'assone che viene identificato dalla presenza di bottoni sinaptici rispetto al dentritic spine sulle altre neuriti. Figura 5B mostra un altro esempio di CA1, che evidenzia numerose proiezioni ippocampali con una macchia contatore DAPI per etichettare il nucleo. Figura 5C mostra un ingrandimento maggiore di questi tipi di dendriti paralleli con numerose spine.
Evidentemente, queste immagini illustrano caratteristiche morfologiche seguente etichettatura cellulare. Nulla osta a che la stessa metodologia venga applicata a consegnare qualsiasi numero di geni esogeni rivestiti sulle nanoparticelle d'oro. Per consentire una conferma visiva di trasfezione successo, un singolo plasmide può essere costruito a co-esprimere sia il gene di interesse ed una proteina reporter fluorescente sullo stesso vettore.
Figura 1 Gene canna della pistola e il montaggio. (A) Il miglioramento d barile sviluppato dal Dr. O'Brien al MRC-LMB che ha uno spread biolistic limitato che riduce al minimo i danni ai tessuti abbassando la pressione necessaria per l'accelerazione di particelle. (B) La vista laterale di una pistola gene ottimizzato montaggio sviluppato dal Dr. Henderson e il dottor Andras Nagy presso l'Università di Toronto. Il montaggio tiene la pistola gene precisamente 90˚ perpendicolare alle fette organotipiche pur permettendo all'utente di controllare con precisione la distanza della consegna biolistic. Per le condizioni ottimali Biolistic l'apertura canna deve essere posizionato direttamente sopra la regione di interesse ad una distanza di 10 mm dal fette organotipica. (C) Torna vista del montaggio della pistola gene. La regione di interesse per essere transfettate deve essere posizionata direttamente sotto il diaframma canna. Targeting può essere confermata con colorante (DiOLISTIC) o proteine tranfection fluorescente (biolistic).ank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Organotipica preparazione fetta e il targeting regioselettiva. (A) A DMEM integrato topo adulto cervello pronto per il taglio. (B) Lo stampo è stato incollato sul montaggio con la lama pronta a tagliare una fetta del vibroslicer. (C) regioselettiva espressione genica eterologa strategie per la consegna biolistic in coronali fette di cervello organotipica. Immagini preparati con le immagini ottenute dalle atlante di riferimento anatomico Allen Cervello Atlas 23. Pannello di sinistra mostra due diverse regioni del cervello mirati come esempio. Per limitare l'espressione genica (1) alla zona corticale dell'emisfero sinistro. Per limitare l'espressione del gene eterologo (2) alla regione ipotalamo del cervello. Pannello centrale mostra that l'espressione di due geni eterologhi (3 e 4) può essere isolato e confronta l'ippocampo dei due emisferi nella stessa fetta organotipica, eliminando sostanzialmente ogni pregiudizio di utilizzare diverse sezioni e / o concedere la possibilità di affrontare crosstalk distale dagli effetti della quei geni. Pannello di destra mostra la possibile sovrapposizione di consegna transgenici per esprimere il primo gene (5) in una precisa regione corticale pur esprimendo un altro gene (6) in una disparata zona corticale ancora sovrapposizione. Questo permette di analizzare l'effetto di modulazione genetica di ogni gene eterologo da solo e in combinazione all'interno della stessa sezione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 Biolistic modello spargimento visto su filter immagine basso ingrandimento e carta. (A) La canna migliore è stato licenziato su carta da filtro per determinare la diffusione di particelle d'oro. Lato sinistro mostra la distribuzione della canna migliorato mentre il pannello di destra mostra la canna normale. Nero bar: 1 centimetro. Immagine presa da O'Brien, et al. 17. (B) immagine di ingrandimento basso che mostra lo scalpiccio trasfezione stocastico entro i 3 millimetri diffusione biolistic all'interno della regione ippocampale di 6 settimane i topi. Bianco bar:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4 Biolistic consegna della proteina fluorescente DNA codificato a fettine organotipiche di 6 settimane i topi. (A) Inverted immagini confocali di una fetta organotipica fisso del cervelletto di una cella di Purkinje pEGFP-N1 particelle di oro rivestite trasfettate. Immagine è stata scattata a 40X di ingrandimento. Nero bar:. 30 micron (B) mostra una 60x di ingrandimento del porto dendritiche di un'altra cellula di Purkinje per evidenziare le spine. Nero bar:. 5 micron (C) mostra una immagine confocale di fette fissi presi dalla regione ippocampale a 60x di ingrandimento di quattro DSredFP transfettate cellule piramidali. Nero bar:. 10 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5 consegna DiOLISTIC di coloranti fluorescenti etichettatura membrana a fettine organotipiche. (A) mostra l'imaging dal vivo di un neurone dell'ippocampo labeled con DiO sotto 20X di ingrandimento. Le spine dendritiche possono chiaramente osservare come l'assone come individuato dall'assenza di spine dendritiche e la presenza di bottoni sinaptici indicate da una freccia bianca. Bianco bar:. 30 micron (B) colorazione Pronunciate della regione ippocampale etichettata con DiO e counterstained con DAPI. Bianco bar:. 30 micron (C) Maggiore ingrandimento (60x) delle spine dendritiche si trovano nella regione CA1 dell'ippocampo. Bianco bar:. 5 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il protocollo descrive gli approcci per fornire coloranti e materiali genetici a fette organotipiche adulti utilizzando una pistola gene potenziato. Essenzialmente, i tipi di coloranti e la varietà di possibili geni rendono questo metodo poliedrico e suscettibili di rispondere ad una vasta gamma di questioni biologiche. Il metodo di consegna regioselettiva utilizzato, in questo caso a regione specifica del cervello, apre nuove strade per la sperimentazione come la modulazione del gene eterologo di aree localizzate all'interno di un'architettura biologicamente rilevante non è stata facilmente realizzabile prima. Abbiamo già stabilito che questo metodo può essere utilizzato su fette organotipiche adulti, dove sinapsi mature sono completamente formate, come ha mostrato una migliore sopravvivenza cellulare e l'espressione genica eterologa per molte settimane 13. Con l'avvento di nuove e migliori condizioni di coltura per il cervello dei mammiferi e anche altri tessuti, l'uso di modulazioni genetiche regioselettiva sarà sempre più utile per un'ampia varietà di biocheMICAL analisi.
Come vedremo in evidenza qui e già citato da altri 24, molti fattori diversi possono facilmente influenzare la precisione e l'affidabilità di consegna biolistic. In primo luogo, la preparazione della particella oro legato ai coloranti o DNA deve essere adeguatamente bilanciati per evitare aggregazione e facilitare l'espulsione cartuccia carico. Calcio e spermidina nella soluzione di micro particelle di DNA-oro possono aiutare il legame delle molecole di DNA per le nanoparticelle d'oro. La possibilità per le nanoparticelle di penetrare le cellule sotto pressione ridotta è stato precedentemente determinato 17. In secondo luogo, la pistola genica deve essere montato il più costante possibile con l'angolo e la distanza corretta. Un manometro affidabile è anche necessario per la riproducibilità, per mantenere l'integrità dei tessuti, e per accelerare adeguatamente le particelle d'oro ai loro obiettivi. Infatti, la distanza, l'orientamento e la stabilità delle apparecchiature sono anche fattori cruciali per il targeting e precisione di consegna regioselettiva. Poiché queste strutture cerebrali sono molto piccole, piccole variazioni dell'angolo cottura potrebbe facilmente rendere l'intera procedura meno affidabile. E, infine, la preparazione e la manutenzione delle fette organotipiche vitali sono state irto di difficoltà per molti decenni ancora protocolli abbondanti e affidabili per diversi animali, regioni del cervello, età e co-colture sono attualmente disponibili 2,4,25,26. Tali procedure dovrebbero essere ottimizzato per l'utente prima di presentare i tessuti alle procedure Biolistic. Questo sarà più facilmente consentire all'utente di verificare unbiasedly l'impatto delle particelle Biolistic e l'effetto del gene eterologo sulle proprie culture. A tal fine, l'uso di geni fluorescenti come EYFP e EGFP può consentire sia un romanzo utente per testare la precisione di targeting e anche seguire la vitalità cellulare attraverso l'espressione genica eterologa per un periodo prolungato di tempo 13. Molti dei passaggi critici per affidabilitàe l'uso riproducibile di questo protocollo sono evidenziati nei tre paragrafi seguenti.
Per la trasfezione efficiente, la concentrazione di DNA deve essere adeguata. Concentrazioni troppo basse avrebbero ostacolare la resa di trasfezione mentre le concentrazioni troppo elevate possono causare agglomerazione delle nanoparticelle. Aggregati di oro possono ridurre drasticamente l'efficienza di trasfezione, causare distribuzioni irregolari, e possono portare ad un aumento citotossicità e dello stress ossidativo. Problemi con efficienza rivestimento sono probabilmente a causa della scadenza della soluzione spermidina (dovrebbe essere sostituito ogni 2 o 3 mesi). Per un'adeguata diffusione biolistic, l'etichettatura deve essere pari. Una etichettatura non omogenea della sospensione di nanoparticelle di oro / DNA può essere dovuto alla soluzione PVP. Dovrebbe anche essere sostituito ogni 2 o 3 mesi. Rivestimento delle nanoparticelle d'oro può essere visto su elettroforesi su gel di agarosio come una banda MW superiore 27.
Ogni Syst biologicoem sotto inchiesta così come ogni altro strumento utilizzato potrebbe richiedere piccole variazioni di pressione del gas di raggiungere livelli ottimali di trasfezione e la diffusione biolistic. Il parametro critico è la pressione del polso elio necessaria per togliere la micro o nano-vettori dalla cartuccia di plastica e li spingono nel tessuto. Un alta pressione del gas influenzerà la sopravvivenza delle cellule, perché crea onde d'urto in tutto il bersaglio e disturbare o staccare il tessuto dalla matrice 17. Mirare la canna della pistola genica ed aventi l'apparato esattamente perpendicolare al tessuto è importante per la consegna biolistic accurata. L'area selezionata deve essere collocato direttamente nel centro della canna precisamente 10 mm dal diaframma esterno. Ciò si traduce in un diametro di 3 mm consegna particelle d'oro intorno dell'epicentro. La canna della pistola gene deve essere pulito con etanolo al 70% dopo ogni utilizzo. Per proteggere il tessuto da grandi aggregati di particelle, la canna contiene anche una rete di nylon che shoULD essere sostituiti regolarmente per mantenere prestazioni ottimali. Per sostituire le maglie svitare il tappo quindi inserire una nuova rete di nylon tra il tappo e l'O-ring.
Fluorescente cellule marcate devono essere visibili almeno 1 - 2 giorni dopo la trasfezione intorno all'epicentro. Assenza o disallineamento di etichettatura possono derivare da preparazione inadeguata e l'instabilità del montaggio gene pistola. Le osservazioni di celle utilizzando microscopia confocale dipende da una serie di fattori: la lunghezza d'onda della luce di eccitazione / emissione, dimensioni pinhole, NA della lente obiettivo, indice di rifrazione dei componenti nel percorso ottico, profondità del tessuto, e l'allineamento dei lo strumento. Questi fattori dovrebbero essere ottimizzate per ogni sistema in esame.
I recenti progressi nella biolistics sono stati sfruttati per il successo di questo metodo. La canna gene pistola usata in questo studio è stato modificato in modo da ridurre la pressione necessaria così come imbuto la biolisticmodello di dispersione in un'area più vincolata e specifico 17,19. Altre modifiche barile hanno cercato di limitare la diffusione biolistic e ridurre la pressione di efflusso 28 ancora questa canna della pistola gene progettato su misura progettato dal Dr. O'Brien è un singolo componente montato sulla pistola Helios Gene standard. Successivamente, particelle d'oro sub-micrometriche sono stati utilizzati per ridurre l'invasività di particelle micrometriche che avevamo determinati in precedenza causato danni cellulari e, in definitiva, la perdita di espressione genica eterologa sostenuta. Queste modifiche alla procedura biolistic migliorato la fattibilità complessiva e la riproducibilità del metodo 13. Altri miglioramenti sulla preparazione fetta, come in profondità la risoluzione dei problemi della procedura di affettamento, utilizzando una matrice DMEM-Agarose per preservare il cervello, e numerose altre innovazioni utili in organotipica preparazione fetta cervello precedentemente segnalati 13 ci ha permesso di esplorare l'uso di fette di adulti che hanno sviluppato maturoreti sinaptiche.
Nel nostro studio abbiamo utilizzato principalmente coloranti e geni eterologhi fluorescenti di visualizzare la morfologia delle cellule come una lettura sulla efficienza di trasfezione e la capacità di un'immagine le caratteristiche morfologiche dei neuroni nei tessuti cerebrali del mouse. Il rapporto segnale-rumore della consegna stocastico entro un raggio definito ci ha permesso di isolare completamente il porto dendritiche di una singola cella nel suo contesto originario. Come numerosi sforzi vengono usati per studiare queste caratteristiche morfologiche, mappatura 'connectomics' o per etichettare le singole cellule per varie analisi, questo metodo potrebbe facilmente essere combinato con i protocolli esistenti quali elettrofisiologia e neuriti misurazioni 29,30. Evidentemente, combinazioni di geni eterologhi fluorescenti potrebbero consentire una delimitazione molto più robusto di singole cellule come la distribuzione stocastica delle proteine fluorescenti, e la loro combinazione sarebbe determinare il colore delle singole celle 31,32. L'uso di cellulari promotori specifici come sinapsina e proteina gliale fibrillare acida monte dell'esone gene eterologo può anche limitare l'espressione di sottopopolazioni 33. Infatti, la varietà infinita di materiale genetico può essere consegnato anche in maniera regioselettiva da nanoparticelle d'oro con la stessa procedura. Le regioni totale trasfettate potrebbero quindi essere analizzati con metodi tradizionali, come la dissezione e la presentazione che regione Western immunoblotting per analizzare l'effetto localizzato del gene eterologo.
Miglioramenti delle procedure fetta organotipica saranno inoltre consentire un più ampio uso di tessuti cerebrali per la sperimentazione a lungo termine, nonché permesso l'uso di altri tessuti e co-colture e faciliterebbe le procedure di trasfezione. Lipidi e polimeri di trasfezione sono stati precedentemente segnalati per influenzare l'omeostasi di membrana, interiorizzazione, proteine permeabilità 34 e spesso mostrano molto bassa efficienza di trasfezione terminally differenziata neuroni. Cella gestione mirata carico è anche suscettibile solo alle cellule che esprimono i recettori della superficie cellulare necessari per interiorizzazione, e anche se questo metodo può essere altamente selettivo, si può mancare regioselettività 35 mirati. Vettori virali altrimenti sono spesso difficili e costosi da produrre, richiedono norme rigorose e hanno a volte dimostrato problemi di sicurezza. Consegna Biolistic ha quindi una capacità senza pari di transfettare regioselettivamente neuroni e di altri tipi di cellule all'interno dei tessuti vitali. Come l'oro è non tossici, ulteriori progressi nell'uso della biolistics potrebbe aprire la strada per usi biomedici come la consegna transdermico farmaceutico, non invasiva in vivo consegna del gene, così come le terapie geniche non virali localizzate.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il workshop MRC-LMB per la produzione della canna maggiore gene della pistola. Vorremmo anche ringraziare il Dr. David R. Hampson presso l'Università di Toronto per l'uso di attrezzature e di risorse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
| HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
| NaCl | Sigma | S7653-250G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
| 0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
| Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
| Spermidine | Sigma | S2626 | |
| Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
| Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
| Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
| Humidified cell culture incubator | |||
| Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
| pEYFP-N1 | Clontech | ||
| Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
| Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
| Barrel | Custom made by the LMB | ||
| Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
| Dissecting microscope | for convenience | ||
| Confocal microscope | user defined for usage | ||
| Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
| Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
| Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |
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