在胶质母细胞瘤标准治疗背景下用于过继性治疗的CAR T细胞的制备

摘要

化疗和放疗作为标准治疗手段，具有淋巴清除和免疫调节作用，可被用于增强T细胞免疫治疗的抗肿瘤疗效。本文概述了一种生成针对EGFRvIII特异性的嵌合抗原受体（CAR）T细胞的方法，并介绍了在胶质母细胞瘤标准治疗背景下给予该细胞的实施方案。

摘要

过继性T细胞免疫治疗为特异性靶向并清除恶性胶质瘤提供了一种有前景的策略。T细胞可在体外（ex vivo）通过基因工程改造，表达针对胶质瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR T细胞）。标准治疗方案中的化疗和放疗具有淋巴清除和杀瘤效应，可增强过继转移的CAR T细胞的扩增与功能。本文描述了一种生成靶向EGFRvIII（一种胶质瘤特异性抗原）的CAR T细胞的方法，并评估其与小鼠胶质母细胞瘤标准治疗模型联用时的疗效。T细胞通过逆转录病毒载体转导，携带抗EGFRvIII的CAR基因进行工程化改造。荷瘤动物接受替莫唑胺治疗及全脑照射，其剂量方案设计用于模拟临床标准治疗，以进行宿主预处理。随后将CAR T细胞经静脉注射至预处理后的宿主。该方法可用于在标准治疗背景下评估CAR T细胞的抗肿瘤疗效。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性恶性脑肿瘤，且 invariably 致命。手术切除联合非特异性的标准护理化疗和放疗无法完全清除恶性细胞，导致该病患者的预后极差，中位生存期不足15个月¹。相比之下，免疫治疗提供了一种精确靶向肿瘤细胞的方法，因此有望成为一种高效且对周围组织毒性风险较低的治疗平台^2-4。通过体外（ex vivo）基因工程改造表达嵌合抗原受体（CARs）的T细胞，为肿瘤免疫治疗提供了一种多功能策略。CAR通过将抗体的胞外可变区与一个或多个胞内T细胞信号分子融合而成，从而替代全长的主要组织相容性复合体（MHC）限制性T细胞受体⁵。这种类似抗体的抗原识别模式使得反应性抗原特异性T细胞能够在无MHC参与的情况下识别并响应肿瘤抗原，并可针对几乎无限的抗原谱系进行适配。

针对多种肿瘤抗原改造的CAR T细胞已在临床前研究中显示出疗效，并在临床应用中展现出巨大前景^6-9具体而言，在胶质母细胞瘤（GBM）背景下，一种CAR T细胞平台靶向表皮生长因子受体变异体III（EGFRvIII），该变异体为在细胞表面表达的肿瘤特异性突变¹⁰可延长荷瘤胶质瘤小鼠的生存期¹¹然而，尽管CAR过继疗法具有多功能性，但其临床效益尚未完全实现，部分原因在于肿瘤相关的免疫抑制和免疫逃逸^12-16 以及在建立和维持抗原特异性T....

方案

本方案基于一项实验设计，即每只小鼠接受 10⁷ 个 CAR T 细胞的治疗，共使用 10 只小鼠。这意味着总共需要 10⁸ 个 CAR T 细胞；为弥补细胞活力损失，产量应额外多准备 5 × 10⁷ 至 1 × 10⁸ 个细胞。以下方案的规模设定为生成约 200 × 10⁶ 个细胞。随后，将这些细胞通过静脉注射给予雌性 C57BL/6 小鼠，这些小鼠已建立为期 9 天的同系 EGFRvIII 阳性颅内肿瘤，肿瘤来源于现有的 KR158B 星形细胞瘤或 B16 黑色素瘤细胞系。在生成 CAR T 细胞的同时，对荷瘤小鼠给予临床上相关的淋巴清除剂量的替莫唑胺（TMZ，60 mg/kg）和全脑照射（WBI，16.5 Gy）。

小鼠在杜克大学医学中心（DUMC）的无病原体条件下饲养和繁殖。所有动物实验均依照杜克大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。 

1. 对荷瘤小鼠给予替莫唑胺

第0至第4天：

1. 计算需要注射的小鼠总数，并将该数量乘以 0.5，以确定所需 TMZ 溶液的体积（例如， 30只小鼠 × 0.5 ml = 15 ml TMZ，另加1.5 ml以补偿溢出量（共16.5 ml TMZ）。<....

结果

CAR T 细胞通过 EGFRvIII CAR 逆转录病毒载体转导生成¹¹。该载体 MSGV1 是由 SFGtcLuc_ITE4 载体发展而来³⁵，后者包含小鼠干细胞病毒（MSCV）长末端重复序列、延长的 gag 区域和包膜剪接位点（剪接供体 sd 和剪接受体 sa），以及病毒包装信号（ψ）。携带人源抗 EGFRvIII 单链可变区片段（scFv）139 的 EGFRvIII CAR，与小鼠 CD8TM、CD28、4-1BB 和 CD3ζ 胞内区串联排列，被克隆至逆转录病毒载体 NcoI 位点的下游（图 3）。

转导后，可通过流式细胞术对CAR T细胞进行定量和表型分析。EGFRvIII CAR T细胞可使用双色抗体组合进行检测，该组合包括与藻红蛋白（SA/PE）偶联的生物素化EGFRvIII来源多聚体以及抗CD3 FITC抗体。采用本文所述的培养与转导方案，我们通常可在55%–70%的小鼠脾细胞中检测到CAR表达（图4A）¹¹。此外，也可使用山羊抗.......

讨论

此处描述的治疗时间线旨在模拟临床标准治疗方案，并利用其效应来增强CAR过继性治疗的效果。CAR T细胞剂量、替莫唑胺（TMZ）给药方案以及放射治疗的实施均可进行调整，以增强in vivo T细胞活性、淋巴细胞清除和肿瘤杀伤作用。TMZ方案可加强以实现宿主骨髓消融，从而促进过继转移细胞的扩增³⁰。此外，TMZ的淋巴清除效应可通过低剂量（4–6 Gy）单次全身照射（TBI）来模拟，从而规避标准治疗方案（SOC）中的肿瘤杀伤特性。本研究中采用的放疗方案模拟了生物学等效剂量60 Gy；然而，分次次数和每次剂量可进行调整，以模拟其他临床剂量（表2）。重要的是，我们的标准治疗（SOC）模型采用的是全脑照射（WBI）的生物学等效剂量，而非临床上常用于肿瘤及其边缘区域的局部外照射放疗，因此可能导致对肿瘤的照射剂量较低，同时增加对健康小鼠脑组织毒性的风险。尽管存在这些局限性，全脑照射（WBI）仍是一种在临床前环境中模拟临床放疗的公认技术。

可通过增加或减少CAR T细胞剂量，观察其对肿瘤杀伤效果和总体生存率的影响^11.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pCL-Eco 逆转录病毒包装载体	Imgenex	10045P	用于生成CAR逆转录病毒的辅助载体
刀豆蛋白A	Sigma Aldrich	C2010	非特异性有丝分裂原，用于诱导T细胞增殖和病毒转导
Retronectin	ClonTech/Takara	T100B	促进T细胞的逆转录病毒转导
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019	转染试剂
DMEM，高糖，丙酮酸	Life technologies	11995-065	HEK293细胞培养基
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	T细胞培养基
Opti-MEM I 减血清培养基	Life technologies	11058-021	转染培养基
200 mM L-谷氨酰胺	Life technologies	25030-081	T细胞培养基添加剂
100 mM 丙酮酸钠	Life technologies	11360-070	T细胞培养基添加剂
100X MEM 非必需氨基酸溶液	Life technologies	11140-050	T细胞培养基添加剂
55 mM 2-巯基乙醇	Life technologies	21985-023	清除自由基的还原剂
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Life technologies	15140-122	T细胞培养基添加剂
庆大霉素（50 mg/ml）	Life technologies	15750-060	T细胞培养基添加剂
GemCell 美国来源胎牛血清	Gemini Bio Products	100-500	为体外细胞生长提供生长因子和营养物质
牛血清白蛋白（BSA），第五组分–标准级	Gemini Bio Products	700-100P	阻断逆转录病毒在Retronectin包被板上的非特异性结合
Pharm Lyse（10倍浓缩液）	BD Biosciences	555899	在脾细胞处理过程中裂解红细胞
70 μm 无菌细胞筛	Corning	352350	在脾细胞处理过程中过滤掉大块组织颗粒
100 mm 多聚-D-赖氨酸包被培养皿	Corning	356469	促进HEK293细胞贴壁，以实现转染后最大增殖
[header]
替莫唑胺	Best Pharmatech	N/A	在给药当天配制的冻干粉末
二甲基亚砜	Sigma Life Sciences	D2650	完全溶解替莫唑胺所必需
生理盐水	Hospira	IM 0132 (5/04)	替莫唑胺和氯胺酮/赛拉嗪的溶剂
Ketathesia HCl	Henry Schein Animal Health	11695-0701-1	氯胺酮溶液
AnaSed	Lloyd Inc	N/A	赛拉嗪无菌溶液，100 mg/ml