Introduction
Xenopus laevis er en mye brukt, kraftig modellorganisme for å studere utvikling en. Dette er fordi Xenopus egg er uvanlig stor (ca. 1,2 til 1,4 mm, i forhold til pattedyr motstykker være ca. 0,1 mm) og rikelig. Egg inneholder mordyret syntetiserte og lagret komponenter, som er nok til å drive embryoutvikling fram til midten av blastula overgang (MBT, som forekommer på scenen 8-8,5 med 4,000-8,000 celler). MBT er ledsaget av zygotiske genomet aktivering, som deretter produserer embryoniske genprodukter som direkte videre utvikling.
Tallrike studier mål å identifisere faktorer hos mor viktige for utvikling. Mange studier stole på injeksjon av antisensoligonukleotider (oligos) inkludert morfolino oligonukleotider inn befruktede embryoer, og i så fall degradering av mors proteiner kan observeres på gastrulastadiet 2-4. Alternativt blir mRNA injisert til befruktet embryos å forstyrre genfunksjoner eller å spore skjebnene til overuttrykt proteiner. Men injeksjon i ett-celle scene embryoer normalt ikke påvirker uttrykk nivåer av mors proteiner på et veldig tidlig embryonale stadier før MBT.
Heasman og Wylie etablert verten overføringsmetode for å overvinne dette problemet fem. I sin metode, blir manuelt defolliculated oocytter injisert med antisense oligos og overført til verts kvinner seks. Proteiner er nedregulert før befruktning, slik at rollene downregulated proteiner i tidlig embryoutvikling kan undersøkes. Dette mors uttømming metoden førte til identifisering av flere unike utviklingsmessige roller mors proteiner, som anmeldt i 7.
I denne rapporten har vi detalj vår nylig utviklet metode, der mors uttømming eller overekspresjon av mRNA før befruktning oppnås uten manuell defolliculation og vert overføring8. Manuell defolliculation krever mye tid og vert overføring trenger ofte dyktige teknikker og de spesifikke lisenser for dyr kirurgi, og dermed hindre den hyppige bruken av mors uttømming metode. Defolliculation og vert overføring blir erstattet av enzymatisk defolliculation 9,10 og intracytoplasmatisk spermieinjeksjon (ICSI) 11-13, henholdsvis. ICSI til egg ble opprinnelig brukt til å produsere transgene frosker 12. Sperm og embryonale kjerner ble også transplantert inn i vitro modnet amfibier oocytter 11,14,15. Her viser vi vår trinn-for-trinn metode for å injisere sperm til in vitro modnet ubefruktede egg som ble forhånds injisert med antisense oligos eller mRNA.
Protocol
MERK: All eksperimentering med frosker ble utført etter kravene i den britiske Home Office.
1. Utarbeidelse av Xenopus laevis Oocytter
- Omtrent en uke før eggcelle samling, injiserer kvinnelige frosker med 150 U av gravid Mare Serum gonadotropin (PMSG) for pre-priming ved å bruke 1 ml steril sprøyte med en 27 G nål. Injeksjon er gjort subkutant i rygg lymfe sac.
MERK: Det er optimalt å bruke frosker som ikke legger egg i lang tid (i alle fall mer enn halvparten år) eller som aldri har lagt egg før. - Butikken ferdig grunnet frosker i en vanntank satt til 18 ° C i lys kontrollert rom (7 am-19:00: on, 19:00-7 am: off).
- På dagen av egg samling, forberede en L av 1x Modifisert Barth løsning (MBS) fra 10x MBS lager ved å fortynne med dobbelt destillert vann (DDH 2 O), og legge til penicillin og streptomycin ved endelig konsentrasjon på 10 mikrogram / mlhver (MBS + PS). 10x MBS lager består av 880 mM NaCl, 10 mM KCI, 24 mM NaHCO3, 8,2 mM MgSO4 2 .7H O, 3,3 mM Ca (NO 3) 2 .4H 2 O, 4,1 mM CaCl2 .6H 2 O, 100 mM HEPES, pH 7,5.
- Bedøve en ferdig grunnet frosk ved subkutan injeksjon av 120 mg (i 400 ul) av Tricaine metansulfonatet (MS222). Hold den injiserte frosk i en liten tank med vann.
- Etter 10 min, sjekk den bedøvet frosken ved å vri den over siden hell bedøvede frosker ikke svare på dette. Hvis anestesi er ufullstendig, legge is i tanken og vente på en annen 10 min.
- Plukk opp frosken fra den lille tank og plass i ryggleie på en fuktig tørk.
- Bruk pinsett og en liten kirurgisk saks, klype huden og gjøre et lite snitt (2 cm) i nedre del av magen, lateralt for midtlinjen. Lag en annen innsnitt på den andre siden.
- Etter å kutte huden, løfter muskelen laget with tang og gjøre snitt i muskelen laget.
- Observere eggstokk etter muskelen laget er kuttet og trekk eggstokken ut fra snittene som bruker tang.
- Overføring ekstrahert eggstokk i et 50 ml rør med MBS løsning.
MERK: Prøv å samle så mye eggstokk som mulig fra begge snittene. - Slakte den kvinnelige frosken ved blodtapping, etterfulgt av frost for påfølgende korrekt avhending.
- Skyll den utpakkede eggstokk et par ganger med MBS + PS før blodet er vasket bort. Deretter overfører eggstokken til en 9 cm petriskål inneholder MBS + PS
MERK: Kontroller kvaliteten på ubefruktede egg under et disseksjonsmikroskop på dette punktet. Hvis oocytter er tilsynelatende dårlig kvalitet, slik som oocytter med ujevn pigmentering i dyret halvdel (figur 1A), ikke bearbeide videre og i stedet oppnå en ny eggstokk. Ideelt sett bør ubefruktede egg har like pigmentert dyrehalvkuler og være omtrent like store. - Erte eggstokk i små biter(1-2 cm2) og samle 5 ml oocytter i en ny 50 ml rør.
- Skyll 5 ml revet eggstokk et par ganger med MBS + PS og legge MBS + PS til 15 ml.
- Legg syv enheter av enzymet for defolliculation til eggstokken suspensjon (se Materials List).
MERK: Rekonstituer lyofilisert enzym med 10 ml DDH 2 O (28 enheter / ml). Plasser hetteglasset i 30 min på isen med sporadiske forsiktig svingende. Delmengde 250 pl og oppbevares ved -80 ° C inntil bruk. - Inkuber eggstokk stykke med enzymet i 1 time med forsiktig risting på riste (hastighet på 15 o / min, tilsvarende ca. 0,014 x g).
MERK: For nesten fullstendig fjerning av hårsekkceller, 2 timer til 2 t 15 min inkubasjon med enzymet er vanligvis ikke nødvendig. Lengre inkubasjon er nødvendig for oocyte atomoverføring eksperiment 16. - Etter 1 time inkubasjon, plukke opp et lite antall behandlede ubefruktede egg (10-20 oocytter) og overføring til en 6 cm petriskål inneholder MBS + PS Sjekk extent av defolliculation under et disseksjonsmikroskop. Hvis oocytter er adskilt fra hverandre og i det minste delvis defolliculated (figur 1B), umiddelbart videre til neste stopp reaksjonen (trinn 18). Hvis oocytter fremdeles sterkt omgitt av hårsekkceller, inkuberes i en ekstra 15 minutter ved maksimum.
- Legg masse MBS + PS for å stoppe reaksjonen og kast supernatant. Gjenta vaskingen etter 10 ganger.
MERK: Legg MBS + PS ved å helle til veggen av et 50 ml rør, men ikke direkte til oocytter. Etter suspensjon i MBS + PS, små umodne oocytter har en tendens til å flyte på toppen av vaskebuffer og kast slike små flytende oocytter. - Etter vask, overføre til en 9 cm petriskål inneholder MBS + PS
MERK: Fra dette trinnet utover, holde ubefruktede egg ved 16-18 ° C så mye som mulig. Dette kan gjøres ved å holde oocytter holdige fatet på en temperaturkontrollert stadium. - Velg scenen VI oocytter ifølge Dumont klassifiseringfor senere bruk og overføring til en ny 9 cm petriskål inneholder MBS + PS Oocyte overføring kan gjøres ved hjelp av et glass pipette med en passende spiss størrelse (større enn eggcelle størrelse).
MERK: God kvalitet ubefruktede egg bør ha en jevnt pigmentert dyr halvkule med klar kontrast mellom dyret halvkule og vegetal halvkule, og være omtrent like store (figur 1C). Stage VI oocytter representerer fullt utvokst ubefruktede egg som kan svare på progesteron (eggcelle diameter er ca 1,2-1,4 mm).
2. Injeksjon av Antisenseoligonukleotider eller mRNA inn Oocytter
MERK: Alle trinnene i denne delen skal gjøres ved 16-18 ° C på et mikroskop scenen utstyrt med temperaturkontrollert sirkulerende vann eller på en plastboks fylt med is.
- Overfør 200-300 utvalgte oocytter i en ny 9 cm petriskål fylt med MBS + PS, hvor mikroinjeksjon vil bli utført.
MERK: I each tilstand, 200-300 oocytter som normalt brukes. Totalt er cirka 1000 ubefruktede egg som brukes i ett eksperiment. - For å forberede injeksjon av antisense oligos eller mRNA, ta ut metallstempelet en microinjector.
- Fyll et glass kapillær med mineralolje ved hjelp av sprøyte og sett glasskapillar fylt med olje til metallstempelet microinjector.
MERK: Et glass kapillær er trukket av mikropipette avtrekker. Disse nålene er holdt i en boks uten å skade tips. - Skjær tuppen av nålen ved hjelp av små kirurgiske saks under et mikroskop ved å sikte så liten diameter tips for injeksjon som mulig.
MERK: nålespissen kan slipes ved hjelp av en mikro smie eller mikropipette beveler. For å avfase nålen i en vinkel på 25 ° forbedrer kapasiteten til å trenge inn i oocytt veggen. - Plasser en liten stripe av Parafilm på scenen av en disseksjonsmikroskop og dispensere en 3 ul dråpe av antisense oligo eller mRNA løsning.
- Flytt tip av injeksjonsnålen inn i den lille dråpe av løsningen og fylle den nål med løsningen som skal injiseres.
MERK: Hvis spissen av kanylen er for liten, bør luftbobler vises på spissen av metallet stempelet. Deretter gjør en større tips på kanylen før dette ikke skjer. - Markere kanylen ca 0,5 mm fra spissen. Dette merket er brukt som en indikator på injeksjonsdybde.
- Sett tuppen av nålen inn i en eggcelle langs ekvator grensen ved å sikte til midtpunktet av eggcelle (under Germinal vesikkel) mens forsiktig holder motsatt side av eggcelle til injeksjonspunktet med pinsett for å forebygge uønsket eggcelle bevegelse under injeksjon .
MERK: Finn området fritt for hårsekkceller (figur 1B) og stikk kanylen fra den plassen siden selv en tynn nål kan ikke ofte trenge et lag av hårsekken celler. - Eject 4,6 ng / 4.6 nl eller 9,2 ng / 9.2 nl av antisEnse oligos, eller en passende volum av mRNA (250 pg til 13,8 ng) ved hjelp av pedalen. Detaljer om antisense oligo forberedelse er beskrevet i 7.
- Overfør de injiserte ubefruktede egg inn i en 6 cm petriskål fylt med MBS + PS supplert med 0,1% BSA (Oocyte inkuberingsmediet, sterilisere løsningen ved hjelp av en 0,45 mikrometer pore filter).
- Inkuber ubefruktede egg ved 16 ° C eller 18 ° C i 1-2 dager.
NOTE: Injisert oocytter kan bli utsatt for in vitro modning flere timer etter injeksjon, i hvilket tilfelle injeksjon på 4,6 ng antisens-oligonukleotider er å foretrekke. En generell regel er at jo kortere inkubasjonstiden er, jo bedre den etterfølgende embryonisk utvikling.
3. In Vitro Modning (IVM) av Oocytter
- På kvelden den oocytmodningen eksperiment, hente progesteron stamløsning (30 mM i etanol) fra -80 ° C fryser og oppløse utfellinger på rommet temperaturen med sporadisk vortex.
MERK: progesteron lager normalt stå ved romtemperatur i 30 min til 1 time. - Tilsett 5 ul av progesteron lager i 50 ml MBS + PS (Modning medium; sluttkonsentrasjonen av progesteron på 3 um) og ristes på ristemaskin i 30 min for å fordele progesteron i løsningen på samme måte.
- Forberede agarose-belagt 6 cm retter for in vitro modning behandling.
- Tilsett 1 g agarose i 50 ml 1 x MBS uten magnesium og kalsium.
- Oppløse agarose ved oppvarming i mikrobølgeovn.
- Hell et lite volum av agarose løsning på 6 cm skåler til å dekke bunnen av retter.
- Vent i minst 30 min før størkning.
- Hell 5-8 ml Modning medium til agarose-belagt retter og overføre 200-300 ubefruktede egg i hver 6 cm retter.
MERK: Prøv å overføre oocytter med en minimal mengde av egg inkuberingsmediet. - Inkuber i 16 timer ved 16 ° C.
MERK: For eksempel starte behandlingen på 17:00 og er ferdig på 9 am på neste dag.
4. Intracytoplasmatisk Sperm Injection (ICSI)
- Frossen sperm lager forberedelse
MERK: Følgende sperm forberedelser bør gjøres før du starter oocytmodningen eksperiment, og frossen sperm bestandene holdes ved -80 ° C for ICSI.- Samle testiklene fra en mannlig frosk ved å følge trinn 01.04 til 01.11, med unntak for å trekke fett og testikler ut fra snittene bruker pinsett og fjerne testiklene fra fett.
- Vask 1x testiklene i Marc modifiserte Ringers (MMR, 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,4).
- Fjerne fett end blodkar ved å rulle vasket testiklene på en ren silkepapir og deretter ved å fjerne gjenværende blodårer ved hjelp av pinsett.
- Plassere hver testikkel i en 3,5 cm petriskål som inneholder 1 ml 1x MMR.
- Skjær på langs med fine saks, og rive i små biter med pinsett til ingen store stykker forbli.
- Pipetter opp og ned ved hjelp av en ml plastspiss hvis ende er kuttet, og belastningen 1 ml av den knuste testis løsning i et glass-homogenisator.
- Homogenisere dem ved 2-3 slag og deretter helle oppløsningen på en 50 um pore-filter festet til toppen av en 15 ml sentrifugerør. Tillat løsningen å gå gjennom filteret.
- Gjenta trinn 4.1.7 ved resuspending de resterende kutt testis i en ml 1x MMR. Til slutt, vaske homogenisatoren et par ganger med 1x MMR og passerer det gjennom filteret.
- Gjenta trinn 4.1.5 til 4.1.8 for den andre testikkel og basseng to testiklene til en 15 ml sentrifugerør.
- Spinne cellene ved 800 xg ved 46; C i 20 min.
- Kast supernatanten og resuspender de pelleterte celler i 2 ml 1x MMR. Deretter overføre til et nytt rør.
MERK: Pass på at ingen synlige blodceller er til stede. - Forberede et skritt gradient i en 14 ml ultra-klar sentrifugerør. Bunnlag: 4 ml 30% iodixanol. Sekund bunnlag: 1 ml 20% iodixanol. Tredje bunnlaget: 5 ml 12% iodixanol. Topplag: testis celler i 2 ml 1x MMR. Lapper gradienter svært forsiktig med en 1 ml pipette (overlegg sakte for ikke å forstyrre den nederste fasen).
MERK: Bare ett lag 30% iodixanol bør også arbeide for bare isolere sperm. - Spinn i SW40 rotor ved hjelp av ultrasentrifuge ved 10.000 xg ved 4 ° C i 15 minutter (retardasjon uten pause).
- Fjerne røret fra ultrasentrifuge forsiktig. Bekrefte et grensesnitt mellom hvert lag av gradienten og pelleten på bunnen.
- Samle sperm brøkdel fra pelleten.
- Resuspender sperm pella i 1x MMR for å vaske ut iodixanol. Sentrifugering ved 800 x g ved 4 ° C i 20 min.
MERK: Hvis en masse sperm fortsatt i suspensjon etter å snurre, re-spin supernatanten ved 3220 xg ved 4 ° C i 20 min og bassenget på pelletert sperm. - Kast supernatanten og resuspender pelleten i en sperm ml 1x Nuclear Fremstilling Buffer (NPB; 250 mM sukrose, 0,5 mM Spermidin trihydroklorid, 0,2 mM Spermine-tetrahydroklorid, 1 mM EDTA, 15 mM Hepes, pH 7,7) 13. Deretter overføres til et Eppendorf-rør.
- Tilsett 50 pl av 10 mg / ml løsning i Digitonin 1x NPB (Resuspender Digitonin pulver i DMSO ved 50 mg / ml og fryse alikvoter ved -80 ° C. Før bruk fortynnes 50 mg / ml prøve til 10 mg / ml med 1x NPB. Ubrukt 10 mg / ml Digitonin kan fryses og lagres ved -20 ° C og gjenbrukt) til 1 ml av sperm-løsning.
- Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Sjekk en permeabilization renten med DAPI farging (0,3 mikrogram / ml DAPI som en final konsentrasjon). Hvis mindre enn 95% av cellene er permeabilized, ruge litt lenger.
MERK: Noen ganger hvis for mange spermceller blir inkubert samtidig (spesielt når sæden er samlet fra flere testikler), er det vanskelig å permeabilisere, og i dette tilfelle kan det være nødvendig å legge til en ytterligere liten mengde Digitonin; For eksempel hvis 20% av sæd ikke permeabilisert, er ytterligere 20 ul av Digitonin tilsatt. - Stoppe permeabilization ved tilsetning av 10% BSA til 3% sluttkonsentrasjon.
- Spinne cellene ved 4 ° C.
MERK: Prøv så lite sentrifugehastighet som mulig ved å starte med 100 xg i 5 min. Hvis ikke tilstrekkelig, øke hastigheten og / eller tid. - Vask cellene med 0,3% BSA i 1x NPB og sentrifuger ved samme hastighet som steg 4.1.22. Tiden forbereder den Sperm Storage Buffer (SSB, 2 ml 2x NPB, 120 pl 10% BSA, 1,2 ml autoklaveres Glyserol, 680 mL av H 2 O).
- Legg 500 mL av SSB til spermpellet. Pipettes flere ganger opp og ned for å suspendere med et kutt tips for ikke å skade cellene.
- Tillate å stabilisere seg over natten ved 4 ° C.
- Pipette cellene opp og ned flere ganger med et kutt tips.
- Fortynne et par mikroliter 10 ganger i 1x MMR eller i 1x PBS å telle celler ved hjelp hemocytometer.
- Fryse som porsjoner på 30.000 sperm / mikroliter (eller høyere) direkte ved -80 ° C og oppbevares ved -80 ° C i en enkelt bruker mengdene.
- ICSI til in vitro modnet oocytter
MERK: Alle prosesser som involverer oocytter bør gjøres ved 16-18 ° C.- Forberede et glass pipette for overføring modnet eggceller.
MERK: glass pipette må være bred nok til å romme ubefruktede egg uten å klemme. - Seksten timer etter flytting eggceller til progesteron holdig medium, overføring modnet ubefruktede egg inn i en 6 cm agarose-belagt tallerken fylt med MBS + PS for vasking.
MERK: Viktigere, matured eggceller må behandles svært nøye. Røff behandling av ubefruktede egg kan indusere spontan aktivering før spermieinjeksjon. - Telle modnet ubefruktede egg ved å bekrefte utseendet på hvite flekker, som innebærer Germinal vesikkel sammenbrudd (figur 2). Hvis modningen hastighet er mindre enn 80%, er det lite sannsynlig å oppnå nok antall overlevende embryoer for videre analyser.
MERK: Gjenværende hårsekkceller blir skrellet av etter oocytmodningen (figur 2). - Overfør oocytter fra MBS vasking i et nytt agarose-overtrukket 6 cm plate fylt med injeksjonsmedium (Forbered 500 ml: 30 g Ficoll (6%), 20 ml 10x MMR og 500 ul av 1,000x PS stock).
- Inkuber i minst 30 minutter før oppstart ICSI.
- Sett opp microinjector som beskrevet i trinn 2.2 til 2.4.
MERK: dysestørrelse til injeksjonsnålen er holdt så liten som mulig ved å følge prosedyren beskrevet i trinn 2.6. Diameterenav nålen er 20-40 mikrometer. For å avfase nålespissen som beskrevet i trinn 2.4 kan tillate effektiv injeksjon. - Hente sperm delmengde og fortynne sperm suspensjon i Sperm fortynningsbuffer (SDB, 250 mM Sukrose, 75 mM KCl, 0,5 mM Spermidin, 0,2 mM Spermine, 200fiM HEPES pH 7,5).
MERK: Fortynning kan varieres avhengig av en nål størrelse og så videre. Fortynne 120 ganger av 30.000 sperm / ul stam som en innledende prøve og justere ytterligere hvis det er nødvendig. - Plasser en liten stripe av Parafilm på scenen av en disseksjonsmikroskop. Bland spermieinjeksjon løsning ved pipettering og dispensere noen mL dråpe sperm løsning.
- Suge den fortynnede sæden suspensjon inn nålen, injisere 4,6 nl i 10 påfølgende dråper som inneholder 0,3 mikrogram / ml DAPI på et objektglass, og raskt telle antall sædceller levert per injeksjon på en fluorescerende mikroskop.
MERK: Mål 1-2 sædceller per injeksjon. Om nødvendig, fortynne spermieinjeksjon løsning merog kontrollere antall spermier per injeksjon igjen før å oppnå en ønsket konsentrasjon. - Løs ut testen injeksjonsoppløsningen og fylle en ny spermieinjeksjon løsning med en skikkelig konsentrasjon.
- Injisere 4.6 nl av sperm løsning til 100 modnet eggceller.
MERK: Det er viktig å kontinuerlig injisere løsningen. Først finne den tiden som kreves for å mate 4.6 nl (normalt 1-2 sek). Gjenta følgende prosess; injisere i en eggcelle, vent noen sekunder, ta en nål og mock-injeksjon i injeksjonsoppløsningen, vent noen sekunder, injisere i en eggcelle. Dette kontinuerlig injeksjon hindrer også blokkering av nålespissen. Alternativt kan metoden ved hjelp av en pumpe brukes 13. - Etter ca 100 injeksjoner, løse ut de resterende sperm løsning og fylle på sperm løsning (bruke samme sperm løsning, men pipette opp og ned før det leveres).
MERK: Hvis nålen ikke suge sperm løsning godt, kutte spissen av behovetle. Hvis dette ikke forbedrer situasjonen, forberede en ny nål. - Gjenta injeksjon prosessen til alle eggceller blir injisert.
MERK: Hvis eggcelle kvaliteten er god og injeksjonen er vellykket, sammentrekning av injisert ubefruktede egg sett innen 20 minutter etter injeksjonen tid. - Flytt de injiserte retter til 16 ° C eller 18 ° C inkubator.
- 4-5 timer etter injeksjonen, sjekk cleavage frekvensen av ICSI embryoer.
MERK: Cleavage furer av disse embryoer kan ikke være så klare som de av normale befruktede embryoer. Noen embryoer viser også unormale splittelsene, som kan være forårsaket av multippel spermieinjeksjon. - Overfør kløyvet embryoer inkludert unormalt spaltede embryoer for inkubasjon medium (Forbered 500 ml: 20 g Ficoll (4%), 5 ml 10x MMR og 500 mL av 1,000x PS lager).
- Inkuber embryoer enten i 16 ° C eller 18 ° C inkubator over natten.
- Neste morgen, overføring Embryos til 0.1x MMR og telle overlevende embryoer.
- I gjennomsnitt kan ca 10% av sperm-injisert eggceller utvikle til svømme rumpetroll scenen (figur 3A).
- Forberede et glass pipette for overføring modnet eggceller.
Representative Results
Embryoutvikling av ICSI embryoer som bruker in vitro modnet oocytter ble undersøkt (figur 3A). Modning priser av GV eggceller til MII scenen er variabel og i stor grad avhenger av eggcelle kvalitet. I gode eksperimenter, nesten 100% av GV oocytter svare på progesteron og vise tegn på oocytmodningen, endelig blir egg på MII scenen. Alle modnede oocytter ble utsatt for ICSI, og ca 25% av injiserte egg spaltes (figur 3A, n = 13 for kontroll egge oligo-injiserte oocytter og n = 7 til ingen oligo-injiserte oocytter). Omtrent 60% eller 80% av spaltede embryoer, produsert fra kontroll oligo-injisert eggceller eller ikke injisert eggcelle, henholdsvis, nådde blastula / gastrulastadiet. Blant de blastula / gastrula embryoer, omtrent halvparten av embryoene i oligo-injiserte prøvene var av god kvalitet (nesten ingen tegn til unormal cleavage og apoptose), mens 82% av blastula / gastrula embryoer var av god kvalitet i non-injiserte prøvene (figur 3A). Til slutt, 41% og 11% av spaltede embryoer i oligo-injiserte prøvene nådde muskelrespons og svømme rumpetroll faser, henholdsvis, mens 60% og 29% av spaltede embryoer i ikke-injiserte prøver gjorde (figur 3A). Disse ICSI embryoer er blandingen av normale og unormale embryoer (Figur 3B). Noen av dem gjennomgå metamorfose og utvikle seg til modne frosker 8. Disse resultatene tyder på at injeksjon av antisense oligonukleotider til GV oocytter, etterfulgt av IVM og ICSI, tillater effektiv tidlige embryoutvikling. Selv om injeksjon av antisense oligos seg minsker embryoutvikling, er vi fortsatt i stand til å skaffe nok embryoer for mange eksperimentelle formål som å sjekke utviklings priser, RT-PCR, western blot og så videre.
Fig ure 1: Typiske eksempler på Xenopus laevis ubefruktede egg av god kvalitet eller dårlig kvalitet for in vitro modning eksperimenter. (A) Et eksempel på dårlig kvalitet ubefruktede egg. For eksempel er ubefruktede egg som viser usammenhengende pigmentering ikke brukes for senere eksperimenter. Hver Xenopus laevis eggcelle er ca 1,2-1,4 mm i diameter. (B) En delvis defolliculated eggcelle. Den høyre halvdel av oocytten er dekket av hårsekkceller, som kan skjelnes ved nærvær av blodkar. En pil viser et område fritt for hårsekkceller og inn som kanylen er injisert. (C) Et eksempel på god kvalitet ubefruktede egg, som er like store og viser jevnt pigmentert dyrehalvkuler med klar kontrast mellom dyret halvkule og vegetal halvkule.
2496 / 52496fig2highres.jpg "/>
Figur 2:. Xenopus laevis ubefruktede egg før og etter modning Etter oocytmodningen, klare hvite flekker vises på toppen av dyrehalvkuler og hårsekkceller blir skrelt av. Hver Xenopus laevis oocytter er omtrent 1 mm i diameter.
Figur 3: Utvikling av ICSI embryoer, produsert fra in vitro modnet eggceller. (A) Utvikling av ICSI embryoer til hvert trinn er oppsummert. Oocytter ble injisert med kontroll eggeantisense oligonukleotider (kontroll oligo injeksjon) eller uten injeksjon (non-injeksjon), etterfulgt av IVM og ICSI. Det tilsvarende antall embryoer på hvert trinn er vist over stengene. Gjennomsnitt ± SEM er vist. N = 4-13 uavhengige eksperimenter / annen females. (B) Eksempler på overlevende ICSI embryoer. Disse tailbud trinns embryoer ble produsert i ett eksperiment, hvori omtrent 200 oocytter ble anvendt som et utgangsmateriale.
Discussion
Vi her detalj en ny metode for å utarme mors faktorer eller å overuttrykke eksogene faktorer før befruktning. Dette systemet krever to microinjections, men i stedet hopper kirurgi av frosker, som brukes i vertsoverføringsmetode 7,17. Det er optimalt å fjerne frosken kirurgi skritt i form av dyr omsorg. Videre trenger vi ikke å ta hensyn til kvaliteten på verten kvinnelige frosker for overføring eksperimenter, noe som betyr at vi kan bli kvitt en biologisk faktor som påvirker suksessen til eksperimenter. Derfor er i dette systemet kvaliteten på oocytter erholdt fra ikke-primede PMSG frosker er en viktig biologisk faktor som er avgjørende for et vellykket forsøk. Kvaliteten av oocytter kan bedømmes etter samling av eggstokk eller etter defolliculation. Hvis noe unormalt observert ved disse stadiene, er det optimalt å samle annen eggstokk fra en ny frosk. Et annet punkt når du kan sjekke eggcelle kvalitet er etter oocytmodningen. Hvis mindre enn 80% av progesterone-behandlet oocytter viser tegn på modning, kan du ikke være i stand til å skaffe nok antall embryoer for videre analyser. Bruken av enzymatisk defolliculation stedet for manuell defolliculation er også en annen fordel med å bruke dette systemet for å redusere arbeid som kreves for defolliculation. Det er imidlertid fortsatt mulig at manuell defolliculation kan gi en bedre utvikling enn den enzymatiske behandling.
Som vist i figur 3, nesten 10% av in vitro modning oocytter kan nå svømme tadpole trinnet. Disse dataene er samlet inn fra 13 uavhengige eksperimenter, inkludert de som er rapportert i 8 og nye injeksjons eksperimenter. Host overføringsmetode trenger 75-150 ubefruktede egg i hver behandling for å få meningsfylte data siden 30-60% av de overførte ubefruktede egg kan nå neurula scenen 17. Vår metode starter normalt med 200-300 ubefruktede egg i hver forsøksgruppe siden ca 40-60% av spaltede embryoer kan nåmuskulær respons scenen. Disse dataene tyder på at begge metodene støtte en rimelig utviklingshastighet. Vi har så langt fått 10 levende frosker fra kontroll mRNA-injisert og kontroll antisense oligo-injisert ubefruktede egg ved hjelp av denne teknikken, noe som indikerer at denne tilnærmingen støtter utvikling gjennom metamorfose.
Vår eggcelle manipulasjon-ICSI-metoden gir en mulighet til å teste den rollen mors faktorer under svært tidlig embryoutvikling, snart etter befruktning. I tillegg kan overuttrykte kromatin modifiserende faktorer før befruktning gjøre det mulig å fornye mors kromatin før befruktning for å forstå mors kromatin stater nødvendig for utvikling. Denne strategien kan også fungere godt med dagens genet redigering systemer som transkripsjon aktivator lignende effektor nuclease (TALEN) 18,19 og CRISPR / CAS9 20,21 siden disse kan uttrykkes selv før befruktning. Derfor har vår nye opplegget potential som skal brukes for mange anvendelser i fremtiden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | MSD Animal Health | Vm 01708/4309 | PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222) | Sigma | A5040 | For anesthesia |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | For oocyte defolliculation. Store at -20 °C. |
| Drummond Nanoject | Drummond Scientific Company | 3-000-205/206 | For microinjection |
| glass capillary | Alpha laboratories | 7” Drummond #3-000-203-G/XL | For microinjection |
| Micropipette Puller | SUTTER Instrument | Model D-97 | For microinjection |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | For in vitro maturation and ICSI |
| 14 ml ultra-clear centrifuge tube | Beckman Coulter United Kingdom Ltd | 344060 | For sperm purification |
| OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol) | Sigma | D1556 | For sperm purification |
| Digitonin | Sigma | D141 | Cell permeabilization reagent |
| Shaker | Hybaid | HB-SHK-1 | For oocyte defolliculation |
| Dissecting microscope (Stereo zoom microscope) | ZEISS | Semi SV6 | For oocyte collection and microinjection |
| 50 μm pore filter | CellTrics | 04-0042-2317 | For sperm purification |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100XP | For sperm purification |
| 50 ml centrifuge tube | Cellstar Greiner Bio-One | 227261 or 210261 | Oocyte collection and defolliculation reaction |
| 15 ml centrifuge tube | FALCON | 352097 | For sperm purification |
| 90 mm Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20/C | |
| Easy-Grip Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Easy-Grip Cell Culture Dish, 35 x 15 mm | FALCON | 351008 |
References
- Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).
- Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos. Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).
- Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus. Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).
- Heasman, J., et al. Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos. Cell. 79 (5), 791-803 (1994).
- Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes. Methods. 51 (1), 75-81 (2010).
- Miyamoto, K., et al. Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development. Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).
- Halley-Stott, R. P., et al. Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming. Methods. 51 (1), 56-65 (2010).
- Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter. Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).
- Amaya, E., Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).
- Kroll, K. L., Amaya, E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).
- Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection. Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).
- Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis. Cell. 4 (3), 269-274 (1975).
- Smith, L. D., Ecker, R. E. Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens. Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).
- Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes. Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).
- Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis). Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Sakane, Y., et al. Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases. Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
