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测定人类免疫缺陷病毒复制适合度的成对生长竞争实验

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DOI：

10.3791/52610

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2015年5月4日

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1Department of Microbiology, University of Washington, 2Departments of Medicine and Laboratory Medicine, University of Washington, 3U.S Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 4Henry M. Jackson Foundation

本文内容

摘要

近等基因病毒之间的生长竞争可为确定相对复制适合度提供一种灵敏的测量方法。本文所述方案包括重组HIV-1克隆的构建、病毒扩增以及优化的生长竞争实验与分析方法，以获得灵敏且一致的结果。

摘要

体外 适合度测定是确定HIV-1等病毒复制适合度的重要工具。已有多种测量方法用于推断病毒复制适合度，包括每感染单位的病毒颗粒数、细胞培养中的生长速率，以及通过多周期生长竞争实验得出的相对适合度。生长竞争实验能够提供尤为敏感的适合度测量结果，因为病毒在完全相同的生长条件下竞争细胞靶点。在进行生长竞争实验时，需考虑若干实验因素，如感染复数（MOI）、取样时间以及病毒检测和适合度计算方法。每个因素都可能影响最终结果，因此必须在实验设计阶段仔细考量。本文提供的实验方案涵盖了从构建新的重组HIV-1克隆，到开展生长竞争实验并分析实验结果的完整步骤。本方案采用此前已被证实可获得一致且可靠结果的实验参数值。同时讨论了可选方案，因为某些参数需根据所研究的细胞类型和病毒种类进行调整。本方案包含两种可选的病毒检测方法，以适应不同实验室在仪器、试剂和专业技术方面的差异。

引言

病毒复制适合度被定义为病毒在特定环境中产生具有感染性子代病毒的能力1，是决定病毒变异株在群体水平上随时间推移流行程度的重要影响因素2。由于对HIV-1等致病性人类病毒难以开展in vivo适合度研究，目前已开发出多种in vitro和ex vivo复制适合度检测方法，用于研究药物耐药性和免疫逃逸突变、上位性以及病毒群体进化对适合度的影响3-6。在各类适合度检测方法中，生长竞争实验因其更高的敏感性和有效性而被广泛认可，因为在该实验中，两种或多种病毒变异株在完全相同的环境条件下竞争同一细胞群体，类似于in vivo的情况1,7,8。在开展生长竞争实验前，需确定多个变量，包括不同的感染复数（MOI）、病毒接种比例以及采样分析的时间点。我们已研究了这些参数对病毒生长动力学及竞争实验结果的影响，并确定了在细胞培养中准确测定HIV-1适合度所需的关键因素9。

除了检测变量外，还有多种方法可用于定量生长竞争实验中的病毒变异体。可通过群体测序10,11或克隆测序12,13，根据目标位点的核苷酸频率来确定竞争病毒之间的比例。相对适应度则通过该比例随时间的变化推导得出。由于DNA测序服务广泛可得，该方法较为便捷。平行等位基因特异性测序（PASS）方法可实现多个位点的测序并检测重组子14，但需要专门开发的试剂和检测系统。总体而言，这些方法主要用于研究在目标区域内仅有少量核苷酸差异的病毒株。其他方法则使用小型报告基因15或同义突变4,16-18作为标签，通过测序、异源双链追踪分析（HTA）4,7,17,19或逆转录-定量实时聚合酶链式反应（RT-qPCR）15,16,18,20来区分竞争病毒，这些方法均可适用于研究无论序列相似性如何的病毒株。然而，这些方法需要额外步骤将标签引入病毒基因组，而RT-qPCR检测还需特定试剂和仪器。我们发现，群体Sanger测序可获得类似的结果9。

经过生长竞争后，病毒复制适合度以相对适合度表示，即两种病毒变异株之间的适合度比率。病毒的相对适合度可定义为病毒变异株在感染接种物中最终比例与其初始比例的归一化值，或定义为两种竞争病毒之间净生长速率的差异。我们发现，后一种方法仅使用指数生长期内的纵向数据点，可获得最稳健的结果9,20。

体外 适合度检测主要用于研究生物克隆6-8 和 HIV-1 的感染性分子克隆。后者易于进行遗传操作，因此常被用于研究特定突变或目标序列对适合度的影响3-5,21,22。以下方案描述了一个完整的工作流程，包括利用含有序列标签的 HIV-1 载体构建新的全长感染性 HIV-1 分子克隆、引入目标突变、制备病毒储备液、建立病毒生长动力学，直至开展生长竞争实验并计算相对适合度（图 1）。

通过优化后的实验流程，我们构建了三种重组HIV-1突变体，并测定了它们的复制适应性。首先，通过将含有HIV-1实验室毒株NL4-3全长感染性基因组的质粒pNL4-3中的HIV-1 gag-p24基因区域替换为合成的COTB（树中心，B亚型）gag-p24序列23，构建出重组分子克隆，即原型病毒。随后引入单个氨基酸替换（T186M、T242N和I256V），构建出三种突变克隆。每种突变体均与原型病毒进行竞争实验，以评估在特定遗传背景下各突变对适应性的影响。三种突变体表现出不同程度的复制适应性，均低于原型病毒，差异从轻微到显著不等。T242N突变此前已被报道具有中等程度的适应性代价24-26，本研究结果与其一致。其余两种突变的适应性代价此前尚未见报道。

方案

注意：如下所述的实验方案不包含任何可识别患者的信息，因此华盛顿大学机构审查委员会或人类受试者部门不将其视为人类受试者研究。

1. 嵌合型 HIV-1 NL4-3 分子克隆的构建

1.1）扩增插入DNA片段

  1. 设计嵌合引物。正向和反向引物的5’端均包含HIV-1载体序列，插入片段将被插入该位置。引物的3’端必须包含插入片段序列的末端（图2）。确保嵌合引物序列保留原始的开放阅读框。
    1. 引物长度至少为20个碱基，熔解温度大于或等于60 °C，GC含量约为50%，且形成引物二聚体、异源二聚体和/或发夹结构的倾向较低。使用OligoAnalyzer网络工具（https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/）评估这些特性。
  2. 使用PCR27和嵌合引物扩增插入DNA片段（图2）。每个PCR反应体系中加入1X高保真缓冲液、0.2 mM dNTPs、1 U高保真DNA聚合酶、0.5 µM正向嵌合引物、0.5 µM反向嵌合引物，以及1 pg–10 ng携带插入区域的DNA样本。用dH2O补足至终体积50 µl。
  3. 设定热循环程序如下：在98 °C进行初始DNA变性10秒；进行30个循环的扩增，每个循环包括98 °C变性10秒，退火温度为两个引物中较低熔解温度高3 °C，持续20秒；最后在72 °C延伸10分钟。将PCR产物保存于4 °C。
  4. 取上一步得到的5 µl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳28。
    1. 使用0.7%琼脂糖凝胶，1x TAE缓冲液（40 mM Tris-乙酸盐，1 mM EDTA），终浓度为0.5 μg/ml溴化乙锭（EtBr），并以1 kb DNA ladder作为分子量标记。设定电源电压为电极间距离每厘米5 V。当上样染料迁移至凝胶长度约2/3处时停止电泳。使用凝胶成像系统28观察结果。
      注意：溴化乙锭（EtBr）为疑似致癌物，必须按照机构规定妥善处理。操作含EtBr的凝胶时应始终佩戴手套。在处理完含EtBr的材料后、接触其他材料或设备前，应更换新手套以防止交叉污染。
  5. 若仅检测到一条大小与预期PCR产物相符的DNA条带，则使用商业纯化试剂盒（如QIAquick PCR纯化试剂盒）按照制造商说明书纯化剩余PCR产物。
    1. 若同时出现其他非特异性条带，则使用剩余PCR产物进行制备型凝胶电泳。采用与步骤1.1.4中相同的参数和条件。确保凝胶孔足够大，可加载约45 µl PCR产物。切下目标条带，并使用QIAquick凝胶回收试剂盒按照制造商说明书从凝胶中提取DNA。

1.2）将插入片段引入全长感染性 HIV-1 B 亚型载体（pNL4-3）

  1. 使用步骤 1.1.5 中纯化的 PCR 产物作为 PCR 引物。使用 pNL4-3VifA20 作为模板DNA进行一次PCR反应，并使用pNL4-3VifB20 作为另一个反应中的模板（图2)。每个PCR反应体系为50 µl，包含1×高保真缓冲液、0.2 mM dNTPs、2 U高保真DNA聚合酶、500 ng引物DNA和50 ng模板DNA。热循环参数设置如下：98 °C预变性30秒；35个循环：98 °C变性10秒、48 °C退火1分钟、72 °C延伸10分钟；最后72 °C终延伸10分钟。
  2. 加入10 U的 Dpn向50 µl PCR反应体系中加入相应试剂，37 °C孵育1小时，以消化模板DNA。确保质粒DNA来源于具有甲基化能力的细菌菌株。 例如TOP10 化学感受态细胞 大肠杆菌.
  3. 使用 Dpn我将消化产物用于转化感受态细菌细胞。使用热激法转化TOP10化学感受态细胞。 E. coli，按照制造商的说明书操作。为筛选含有重组质粒的细菌细胞，使用含有100 mg/L羧苄青霉素的LB（Luria Broth）培养板。
    1. 挑取约10个分散良好的单菌落，分别接种于3 ml含有100 mg/L羧苄青霉素的LB液体培养基中，30 °C摇床过夜培养。
    2. 使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒，按照生产商提供的操作说明从细菌液体培养物中分离质粒DNA。
  4. 使用双酶切消化29 以确定质粒DNA是否含有正确的插入片段。确保其中一个限制性酶切位点仅存在于插入片段区域内，而另一个限制性酶切位点在HIV-1载体中仅出现一次，且位于插入片段区域之外。
    1. 用10 µl终反应体系消化至少300 ng质粒DNA。根据所选限制性内切酶的生产商说明书选择合适的限制性缓冲液、孵育温度和孵育时间。取9 µl已消化的DNA，按步骤1.1.4所述进行凝胶电泳。选择具有预期大小DNA条带的重组质粒。
  5. 通过Sanger测序确认重组质粒的序列完整性。尽管罕见，但在PCR反应过程中可能引入非预期的突变。
    1. 对质粒DNA的双链进行测序。按照步骤1.1.1.1中的说明设计测序引物。此外，确保正向和反向测序引物分别在重组质粒插入片段区域的上游和下游至少50 bp处退火。
    2. 将质粒DNA和测序引物提交至商业DNA测序服务公司。按照服务公司的要求制备DNA样品和引物。
  6. 使用无内毒素质粒DNA试剂盒，按照制造商提供的方案制备突变型质粒DNA的无内毒素储备液。在下一步转染前，至少准备1 µg无内毒素的质粒DNA。

1.3）通过定点诱变引入小规模突变

  1. 设计包含目标突变的重叠正向和反向引物。将需要替换、插入或删除的碱基置于引物中间位置，两侧各保留10-15个同源碱基。请遵循步骤1.1.1.1中的说明。
  2. 通过PCR合成突变型质粒。每个PCR反应体系包含：1×高保真缓冲液、10 mM dNTPs、2 U高保真DNA聚合酶、0.5 µM正向诱变引物、0.5 µM反向诱变引物，以及50 ng来自步骤1.2.6的嵌合质粒pNL4-3VifB，总体积为50 µl。热循环参数设置如下：98 °C预变性30秒；进行25个循环，每循环为98 °C变性10秒、48 °C退火1分钟、72 °C延伸10分钟；最后72 °C最终延伸10分钟。
  3. 重复步骤1.2.2至1.2.6。

2. 利用转染法产生病毒原液

  1. 计算所需病毒储存液的量和质粒DNA的用量。当病毒滴度为10时4 每毫升含 IU 或更高浓度时，1.8 ml 病毒原液足以进行两组生长竞争实验，包括单独感染，每组均设三个重复。在 6 孔板中进行转染时，每孔可收集约 1.8 ml 上清液。每次在 6 孔板中进行转染需要 1 µg 质粒 DNA。
  2. 对于6孔板的每个孔，准备100 µl转染混合液， 例如，包含1 µl X-tremeGENE 9转染试剂（或同类产品）、1 µg质粒DNA和无血清DMEM。
    1. 根据每孔使用1 µg质粒DNA计算所需质粒DNA体积，确保质粒DNA的终浓度至少为50 ng/µl。
    2. 根据公式计算每孔所需的无血清培养基（DMEM）体积：DMEM 总体积（µl）= 100 µl - DNA 体积（µl）。
  3. 加入106 将 HEK 293T-17 (ATCC) 细胞以每孔 2 ml 增殖培养基（DMEM + 10% 胎牛血清 (FBS)）接种至 6 孔板中。于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时2 大气环境。根据步骤2.1确定的结果接种相应数量的孔。
  4. 为制备转染混合物，将上述计算好的适量无血清DMEM加入1.8 ml聚丙烯微量离心管中，然后加入转染试剂。
    1. 将试剂直接移液至培养基溶液中，切勿将其添加到微量离心管的塑料管壁上。质粒DNA应在最后加入。轻轻吹打混匀溶液。室温（15 °C 至 25 °C）孵育15分钟，以形成转染复合物。
    2. 将混合物逐滴加入接种于6孔板中的细胞。轻轻振荡或摇动各孔，以确保转染复合物均匀分布。
    3. 用塑料薄膜密封培养板。
  5. 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 在大气条件下孵育48小时。
  6. 使用移液器小心收集上清液，并通过0.22 µm滤膜顶部过滤后转移至15 ml离心管中.
  7. 使用移液器将250 µl或更多的过滤上清液转移至带有橡胶垫圈的1.8 ml微量离心管中。
  8. 将过滤后的上清液储存于 -80 °C，直至使用。

3. 在外周血单个核细胞（PBMCs）上测定病毒储备液的感染性滴度

  1. 用植物血凝素（PHA）刺激外周血单个核细胞（PBMCs）。每种病毒储备液，将 2 × 106 个 PBMCs 接种于完全 Iscove 改良 Dulbecco 培养基（cIMDM；IMDM 添加 20 U/ml 人白细胞介素 2（hIL-2）、10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素）中，并补充 PHA（1.5 µg/ml）。接种密度为 2 × 106 个细胞/ml。将 PBMCs 在 37 °C、5% CO2 条件下培养 72 小时。
  2. 收集经 PHA 刺激的 PBMCs。将非贴壁的 PHA-PBMCs 转移至 50 ml 圆锥形离心管中。以 228 × g 离心 10 分钟。小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。用 cIMDM 重悬细胞沉淀，最终浓度为 2 × 105 个 PBMCs/ml。
  3. 在圆底 96 孔板中，每孔加入 100 µl cIMDM，接种 2 × 104 个经 PHA 刺激的 PBMCs/孔。
  4. 将病毒储备液进行 1:10 稀释。然后，从该初次稀释液开始，在 96 孔主稀释板中连续进行 12 次三倍系列稀释。此稀释方案适用于检测每毫升 104 至 106 感染单位（IU）范围内的病毒滴度。
    1. 例如，在 1.5 ml 离心管中加入 20 µl 病毒储备液至 180 µl 培养基中。通过移液器轻柔混匀。然后将 90 µl 稀释液转移至第一孔（含 180 µl 培养基），并充分混匀。
    2. 继续系列稀释：将当前孔中的 90 µl 转移至下一孔（含 180 µl 培养基），重复此操作共 11 次。若预期滴度高于 106 IU/ml 或低于 104 IU/ml，则相应增加或减少初始稀释倍数。
  5. 从主稀释板中取 40 µl 系列稀释的病毒储备液，加入步骤 3.3 所得的 PBMCs 接种板中，每组设四个复孔。将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 16–24 小时。
  6. 小心从每孔中移除 100 µl 上清液，并补充 160 µl 新鲜 cIMDM，使每孔总体积达到 200 µl。将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育（第 1 天）。
  7. 在第 4、7、10 和 13 天，从每孔中转移 100 µl 上清液至含 100 µl 裂解缓冲液（含 2% Triton X-100 的 PBS）的收集管中，并向原孔补充 100 µl 新鲜 cIMDM。将收集的上清液储存于 -20 °C。
    1. 每隔三天持续取样并补充新鲜 cIMDM，直至滴度趋于稳定。
  8. 使用第 7 天和第 13 天的样本，通过 p24 ELISA 测定病毒储备液的 50% 组织培养感染剂量（TCID50），具体方法见步骤 4。
    1. 若第 13 天测得的 TCID50 明显高于第 7 天的滴度，则病毒储备液可能需要更长时间扩增。继续使用后续时间点的样本进行 p24 ELISA，直至两个取样时间点的感染滴度趋于稳定（或开始下降）。选择滴度最高的样本所对应的病毒储备液。

4. 用于确定病毒感染滴度的 HIV-1 p24 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测

注意：以下实验方案使用的是本实验室制备的p24抗原捕获板30。也可使用商业化的HIV-1 p24 ELISA板或试剂盒，具体操作请遵循生产商提供的说明书。

  1. 在处理样本前，配制一抗工作液（兔抗 HIV-1 SF2 p24 抗血清）。
    1. 在室温下解冻 p24 抗血清。
    2. 将 2.5 ml 甘油与 2 ml 含 10% 胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）混合。
    3. 加入 0.5 ml 抗血清并混匀。
    4. 将 1 ml 分装液储存于 -20 °C。
  2. 在 37 °C 培养箱中解冻步骤 3.7 的样本。
  3. 用洗涤缓冲液（含 0.05% Tween-20 的 1× PBS）洗涤 p24 捕获板 5 次。
  4. 每孔加入 50 µl 样本稀释液（含 1% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.2% Tween-20 的 RPMI-1640），然后向相应孔中加入 50 µl 样本。设置至少三个仅含样本稀释液的孔作为模拟/阴性对照。在 37 °C 孵育 2 小时，或在 4 °C 过夜孵育。
  5. 使用前新鲜配制一抗溶液。用一抗稀释液（含 12% FBS 的 RPMI-1640）将一抗工作液按 1:2,000 比例稀释。确保配制足够体积，使每块 96 孔板的每个样本/对照孔可加入 100 µl 溶液。
    1. 例如，为一块 96 孔板配制足够溶液时，将 5 µl 一抗工作液加入一抗稀释液中，定容至 10 ml。
  6. 用洗涤缓冲液洗涤捕获板 5 次。
  7. 每孔加入 100 µl 一抗溶液。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。
  8. 使用前新鲜配制二抗溶液。用二抗稀释液（含 7% FBS 和 0.01% Tween-20 的 RPMI-1640）将二抗（1 mg/ml 羊抗兔 HRP）按 1:14,400 比例稀释。为减少移液误差，建议采用两步连续稀释法。确保配制足够体积，使每块 96 孔板的每个样本/对照孔可加入 100 µl 溶液。
    1. 例如，为一块 96 孔板配制足够溶液时，首先将 1 µl 二抗加入 99 µl 二抗稀释液中；然后取 70 µl 第一次稀释液加入二抗稀释液中，定容至 10 ml。
  9. 用洗涤缓冲液洗涤捕获板 5 次。
  10. 每孔加入 100 µl 二抗溶液。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。
  11. 用洗涤缓冲液洗涤板 5 次。
  12. 每孔加入 100 µl 室温 TMB 底物溶液。在避光的密闭容器中于室温孵育 30 分钟。
  13. 每孔加入 100 µl 室温 终止液（1 N H2SO4）。
  14. 使用酶标仪读取各孔在 450–650 nm 波长下的吸光度值。根据吸光度值判断各孔是否感染。若某孔的吸光度值至少为模拟/阴性对照孔的 3 倍，则认为该孔含有具有感染性的病毒。采用 Reed-Meunch 法31计算病毒储备液的 TCID50。

5. 建立病毒生长动力学

5.1）单一感染

  1. 在48孔板中，每孔接种3 × 105个PHA刺激的PBMC，总体积为500 µl/孔。将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，直至接种病毒。
  2. 针对每种病毒，用2 ml cIMDM配制含有6,000 IU的接种液。
  3. 取500 µl接种液（含1,500 IU）加入已接种细胞的孔中，每种病毒设三个重复孔。感染后细胞培养终体积为1 ml/孔，MOI为0.005。
  4. 将剩余接种液分装至两块96孔板中，每孔200 µl，用于RNA提取，其中一块作为备份保存。
  5. 将培养物置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育16–24小时。
  6. 接种后16–24小时对培养物进行洗涤。
    1. 移除并弃去750 µl培养上清液。
    2. 加入750 µl新鲜cIMDM。用封口膜包裹培养板，在300 × g下离心10分钟。移除并弃去750 µl上清液。
    3. 加入750 µl新鲜cIMDM。在37 °C、5% CO2条件下孵育（第1天）。
  7. 从第2天至第7天每天取样。
    1. 将500 µl培养上清液转移至1.8 ml离心管中，在3,000 × g下离心1分钟。
    2. 将200 µl无细胞上清液转移至两块96孔样品板中用于RNA提取，其中一块作为备份保存。将上清液储存于-80 °C，直至进行RNA提取。
    3. 向每孔培养物中加入500 µl新鲜cIMDM。在37 °C、5% CO2条件下继续孵育。
    4. 实验结束后，将培养物弃入Wescodyne溶液中。
    5. 使用200 µl上清液提取RNA（可采用商业试剂盒，如QIAamp Viral RNA Mini Kit），按照制造商的标准操作流程进行。若样本量较大，可使用Qiagen QIAxtractor系统。
    6. 将RNA样本储存于-80 °C，直至进行cDNA合成。

5.2）cDNA 合成（逆转录）

  1. 对于每个RNA样本，向10 µl病毒RNA中加入1.2 nmol dNTP和1.2 pmol cDNA合成引物（5’-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3’，对应HXB2核苷酸7968至7995），加水至终体积为14 µl。轻弹管壁混匀，短暂离心使液体沉降至管底。
  2. 在65 °C孵育5分钟，然后置于4 °C保存，直至完成主混合液的配制。
  3. 使用5x第一链缓冲液（250 mM Tris-HCl，pH 8.3，375 mM KCl，15 mM MgCl2）、5 mM DTT、120 U SuperScriptIII和240 U Rnase抑制剂配制主混合液，加水至终体积为10 µl。
  4. 向RNA混合物中加入10 µl主混合液，轻弹混匀后离心收集。
  5. 在50 °C孵育90分钟以完成cDNA合成，随后在70 °C孵育15分钟以灭活逆转录酶。根据需要可暂存于4 °C。
  6. 加入2 U Rnase H，轻弹混匀，然后离心收集。
  7. 在37 °C孵育20分钟，将cDNA储存于-20 °C。

5.3）使用 qPCR 系统进行 cDNA 定量

  1. 制备标准品稀释系列。对pNL4-3VifA进行10倍梯度稀释，从3 × 106 拷贝/µl稀释至30 拷贝/µl。使用蒸馏水进行稀释。使用前新鲜配制标准品稀释系列，或预先分装成小份并保存于-20 °C。标准品冻融次数不得超过三次。
  2. 设置一个96孔qPCR反应板。确保每块板至少包含一个阴性对照孔、标准品稀释系列的三复孔，以及每个cDNA样本至少双复孔。
  3. 每个qPCR反应使用12.5 µl qPCR预混液，0.2 µM探针，正向引物和反向引物各0.8 µM，以及1 µl cDNA、标准品稀释液或水/缓冲液（用于阴性对照孔）。加水至终体积为25 µl。qPCR探针对光敏感，请将其保存在密闭容器中。
    1. 为检测来源于基于pNL4-3VifA分子克隆的cDNA，使用VifA引物-探针组合：VifAB正向引物（GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT）、VifA反向引物（5’-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3’）和VifAB探针（6FAM-5’-CTCCATTCTATGGAGACTC-3’-MGBNFQ）。对于来源于基于pNL4-3VifB克隆的cDNA，使用VifB引物-探针组合：VifAB正向引物、VifAB探针和VifB反向引物（5’-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3’）。
  4. 设定PCR扩增程序：50 °C孵育2分钟，95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火延伸1分钟）。具体操作请参考qPCR仪器制造商提供的技术文档。
  5. 利用标准品稀释系列的三复孔数据绘制标准曲线，并将cDNA样本的扩增数据与标准曲线比较，以确定其拷贝数。数据处理方法请参阅仪器制造商提供的支持文件。

5.4）确定病毒指数生长期

  1. 以采样天数为横轴（X轴），cDNA拷贝数为纵轴（Y轴）绘制病毒生长动力学曲线，并确定病毒的指数生长期。 即当病毒cDNA拷贝数呈指数级增长时。
  2. 使用 GRC 网络工具（http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/）以计算病毒生长速率（g）。在此应用中，GRC 工具接受来自至少两个时间点的 cDNA 拷贝数作为输入，并输出病毒生长速率（g）。仅使用指数生长期的时间点数据（见上述步骤 5.4.1）以获得准确的生长速率。有关 GRC 网络工具中所用数学模型的详细描述，请参见20.

6. 生长竞争实验

  1. 在48孔平底板中，每孔以500 µl总体积接种3 × 105个PHA刺激的PBMCs（或1 × 105个CEMx174细胞）。
  2. 将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，直至接种病毒。
  3. 针对每种病毒，制备含有6,000 IU的3 ml接种液。
  4. 将每种病毒接种液各取1.5 ml转移至无菌离心管中，制备双病毒感染接种液。取500 µl双病毒感染接种液（含1,500 IU）加入含3 × 105个细胞的48孔板中，最终培养体积为1 ml/孔。取200 µl接种液分装至两个96孔板中用于RNA提取；保留一个板作为备份。
  5. 将接种后的细胞在37 °C、5% CO2的环境中孵育16–24小时。
  6. 接种后16–24小时对培养物进行洗涤。
    1. 移除并弃去750 µl培养上清液。
    2. 加入750 µl新鲜cIMDM培养基。用封口膜包裹培养板，在300 × g条件下离心10分钟。移除并弃去750 µl上清液。
    3. 加入750 µl新鲜cIMDM培养基，在37 °C、5% CO2的环境中孵育（第1天）。
  7. 选择采样时间点，至少包含在步骤5.4.1中观察到的指数生长期内的3个时间点。
    1. 每次采样时，按照步骤5.1.7进行操作。
  8. 按照第5.2节所述方法进行cDNA合成。
  9. 使用qPCR测定病毒变异体比例。
    1. 制备标准品系列稀释液，从3 × 106 拷贝/µl到30 拷贝/µl，每步10倍稀释，每个浓度设三个重复。
    2. 设置96孔qPCR反应板。确保每块板至少包含一个阴性对照、标准品系列稀释液（三个重复）以及每个cDNA样本的两个重复。
    3. 每个qPCR反应体系包含12.5 µl qPCR Master Mix、0.2 µM探针、0.8 µM正向引物和反向引物，以及1 µl cDNA、标准品稀释液或水/缓冲液（阴性对照孔）。加水至终体积为25 µl。qPCR探针对光敏感，应保存在密闭容器中。
      1. 使用VifA引物-探针对阴性对照、标准品稀释系列以及一份cDNA样本重复进行检测；使用VifB引物-探针对另一份cDNA样本重复进行检测。
    4. 设定PCR扩增程序：50 °C孵育2分钟，95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火延伸1分钟）。具体操作请参考qPCR仪器制造商提供的使用说明文档。
    5. 利用标准品稀释系列的扩增数据绘制标准曲线，并将cDNA样本的扩增数据与标准曲线比对，以确定拷贝数。数据处理方法请参考制造商提供的支持文档。
    6. 使用GRC网络工具（http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/）计算相对病毒适应性（d）。
      注：GRC工具接受至少两个时间点的cDNA拷贝数或测序图谱峰高作为输入，输出两种病毒之间的净生长速率差异（d）。虽然该工具可基于两个时间点的数据计算净生长速率，但强烈建议输入三个或更多时间点的数据。为获得准确的生长速率，仅使用指数生长期（见步骤5.4）内的时间点数据。关于GRC网络工具所用数学模型的详细描述，请参见文献20。
  10. 利用测序图谱峰高测定病毒比例
    1. 使用VifFwd（5′-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3′；HXB2位点5266–5291）和VifRev引物（5′-GTCTTCTGGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3′；HXB2位点5579–5553）对含有VifAB序列标签的HIV-1 vif 片段进行PCR扩增。
      1. 每个PCR反应体系包含1 µl cDNA、1× NH4缓冲液、1.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、2.5 U Taq DNA聚合酶以及0.45 µM的每种引物。加水至终体积为50 µl。
      2. 设定PCR扩增程序：先进行3个循环（94 °C变性1分钟，55 °C退火1分钟，70 °C延伸1分钟），随后进行34个循环（94 °C变性15秒，58 °C退火30秒，70 °C延伸1分钟），最后在4 °C保存。
    2. 按照试剂盒说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
    3. 将纯化的PCR产物送至DNA测序服务机构进行Sanger测序。
    4. 检查测序服务提供的平均读长质量分数。若平均碱基识别准确率低于85%，则需重新执行步骤6.10.1至6.10.3。
    5. 使用ChromatQuan网络工具（http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi）计算每个时间点的病毒比例。该工具需要输入测序图谱文件（*.ab1）以及目标核苷酸位点上游的序列信息，用于测量指定位点的峰强度。峰强度的比值即对应两种病毒的比例（图4B）。
    6. 使用GRC网络工具（http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/），以记录的峰强度作为输入，计算病毒相对适应性（d）。参见步骤6.10.620。

结果

为了研究 HIV-1 Gag-p24 中单个氨基酸变化对病毒适应性的影响，我们采用寡核苷酸介导的定点突变技术，将突变引入含有 HIV-1 COTB-p24 基因的 pNL4-3 质粒中23,32,33。通过转染 293T 细胞并在 48 小时后收集，制备病毒原液。我们采用 Reed-Muench 方法31估算每种病毒原液的 50% 组织培养感染剂量（TCID50）。原型病毒与突变病毒的 TCID50 值介于 104 至 105 IU/ml 之间（图 3A）。

在单一供体的PBMC中，以0.005的感染复数（MOI）建立了重组病毒的生长动力学。采用RT-qPCR每日检测病毒cDNA拷贝数，持续六天。所有突变株及原型病毒在第2天至第4天期间呈指数增长，此后病毒生长减缓，表现为病毒RNA拷贝数增长斜率降低（图3B）。从第0天（对应接种物）到第2天cDNA拷贝数的减少，是由于病毒吸附至细胞以及第1天洗涤步骤（步骤5.1.6）去除了未结合的病毒颗粒所致。在指数生长期，三种突变株的生长速率（g）均低于原型病毒（图3C）。

在总感染复数（MOI）为0.005的条件下，通过生长竞争实验将三种突变体与原型病毒进行竞争。双重感染培养物中的病毒生长动力学与单重感染相似；病毒的指数生长期出现在第2至第4天之间，病毒生长在第5天左右达到平台期（图4A）。

病毒生长速率差异是根据病毒比例随时间的变化计算得出的。病毒比例通过RT-qPCR检测参考病毒与突变病毒的cDNA拷贝数，并结合两种病毒在区分核苷酸位点处测序色谱图峰高的比较来确定（图4B）。采用峰高法与病毒RNA拷贝数法所测定的生长速率差异结果相似（图4C）。三种突变体的复制适应性均低于原型病毒，其中I256V突变体的适应性最低（图4C）。

病毒制备流程图；质粒载体、定点突变、转染、病毒生长动力学分析。
图 1： 本文所述实验方案的流程图。 病毒制备方案涉及构建 HIV-1 重组克隆及制备病毒储备液。适合度检测方案用于建立病毒生长动力学曲线并确定相对病毒适合度。虚线表示方案的可选流程。例如，可直接将突变引入 HIV-1 NL4-3 分子克隆，而无需构建重组克隆。

PCR基因编辑示意图；显示引物、插入片段、重组质粒构建步骤。
图2： 利用重叠延伸PCR构建HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24重组分子克隆。（A）设计嵌合引物。引物的5’端包含NL4-3载体序列，3’端包含插入片段序列的末端。（B）使用嵌合引物扩增插入片段COTB Gag-p24。（C）将插入片段用作引物进行第二轮PCR，以生成新的重组质粒。

病毒突变研究；柱状图与折线图；比较TCID50、cDNA、生长速率；突变影响。
图3：病毒在PBMCs中的生长特性。（A）病毒毒种的Log10 TCID50。（B）从MOI = 0.005起始的单一感染中病毒的生长动力学。（C）六天内的病毒生长速率，包括根据图（B）得出的指数生长期（第2–4天）。所示数值为一次实验中三个重复样本的平均值，误差线表示95%置信区间。

cDNA合成与PCR图表；RNA提取过程；病毒株生长速率图；数据分析。
图4： 病毒生长及相对适应性测定。（A）双重感染的PBMC培养物中的病毒生长情况。（B）通过RT-qPCR或测序峰高法测定的T242N突变株与原型病毒的比例。（C）在双重感染培养物中，突变株与原型病毒之间的净病毒生长速率差异（d），如图（A）所示。d值由（B）中所示的病毒比例数据计算得出。图中数值代表一次实验中三个重复样本的平均值。误差线表示95%置信区间。

讨论

本方案包含两个主要部分：重组HIV-1分子克隆的构建和生长竞争实验。为了在双重感染的细胞培养体系中区分两种病毒，至关重要的是竞争性分子克隆需包含可被RT-qPCR引物-探针检测或Sanger测序识别的序列标签。本方案采用VifA和VifB标签，它们位于HIV-1 NL4-3 vif 基因的相同区域，编码相同的氨基酸序列，但存在六个同义突变。已有研究表明，这些突变不会影响 病毒复制适合度20。与基于限制性酶切位点的克隆方法相比，本方案所使用的基于PCR的克隆方法在选择克隆位点方面具有更高的灵活性。然而，随着插入片段长度的增加，PCR克隆的效率会下降。目前插入片段长度的上限约为5 kb34。对于基于PCR的克隆和定点突变，使用高保真DNA聚合酶至关重要，以降低引入额外突变的可能性。同时建议使用最少的PCR循环次数，以获得足够量的产物。根据我们的经验，在完成本方案所述的基于PCR的克隆和定点突变步骤后，未检测到任何额外突变。尽管如此，仍应对PCR产物进行测序，以检查是否存在非预期突变。理想情况下，应重新测序整个HIV编码区。

在指数生长期应至少检测三个取样时间点9。必须首先通过每日取样确定病毒的生长动力学，以明确生长竞争实验所需的培养周期和取样时间点。影响病毒生长动力学的一个因素是感染复数（multiplicity of infection, MOI）。本方案对单一感染和生长竞争均采用总MOI为0.005，因为已有研究表明该条件比更低的MOI能获得更稳健的结果9。然而，若需要更长的指数生长期，也可使用更低的MOI，但会牺牲结果的一致性。本方案建议初始感染比例为50:50，前提是病毒之间的适应性差异通常在实验前未知。但是，当已有初步数据表明病毒复制动力学存在显著差异时，可采用不等的输入比例。在此类情况下，建议采用70:30的感染比例，以便在较弱适应性的病毒过量存在时仍能检测到较大的适应性差异9。

测定TCID50的实验方案50病毒生长动力学以及竞争性生长实验的条件，均使用HIV-1 B亚型NL4-3 COTB-p24及来自单一供体的外周血单个核细胞（PBMC）进行优化，该供体的PBMC对HIV-1感染表现出稳定易感性 体外本方案中提供的培养周期和取样时间点可能适用于在人外周血单个核细胞（PBMCs）中研究HIV-1 M组病毒。建议使用单一来源的PBMCs以获得一致的结果，因为病毒复制在不同供体的细胞中可能存在差异。35尽管效果较差，但可使用来自多个供体的PBMC混合物作为替代，前提是所有实验中使用相同的混合样本。另一种替代方案是使用细胞系。本方案已成功应用于T细胞系CEMx174。23,36然而，必须重新优化接种细胞的数量，以获得稳定的细胞生长。此外，病毒生长动力学也需重新确定，因其在不同细胞系中可能存在差异，从而确定生长竞争步骤中的合适取样时间点。

本方案中包含两种用于计算适合度的病毒比例测定方法。第一种方法采用RT-qPCR，在每个采样时间点测定病毒cDNA拷贝数，并基于cDNA拷贝数计算病毒复制适合度。另一种方法则基于VifAB标签位点处测序色谱图峰高的比例来确定病毒比例。这两种方法所得结果具有可比性（图4）。色谱图峰高法可应用于无工程化序列标签的其他HIV-1毒株。对于RT-qPCR方法，必须首先仔细评估引物或探针区分病毒变异体的能力（见20）。然而，RT-qPCR对病毒RNA含量较低的样本具有更高的灵敏度，例如指数生长期首个时间点的样本。直接测定病毒cDNA还可检测RNA提取和cDNA合成过程中可能出现的技术问题。使用带有序列标签的分子克隆为RT-qPCR方法提供了成本效益较高的解决方案，因为只需两对引物和探针即可研究多种病毒。该策略还可避免由于邻近碱基影响导致测序色谱图中峰高变异的问题37，因为所有病毒的测序均在同一位置进行。RT-qPCR和Sanger测序所产生的PCR产物也可用于其他病毒比例测定方法，例如单个克隆的大规模测序12,13、HTA4,7,17,19或寡核苷酸连接检测（OLA）38。

披露

作者声明不存在竞争性经济利益。本文表达的观点仅为作者个人观点，不应被解释为美国国防部或美国陆军的官方立场，也不代表其观点。 

致谢

这些研究由美国公共卫生服务基金 P01AI057005、R01AI047734、R01AI111806 以及华盛顿大学艾滋病研究中心的功能分析与计算生物学核心（P30 AI027757）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
重组克隆的构建
嵌合引物/突变引物/测序引物IDT定制DNA寡核苷酸
pNL4-3VifA 和 pNL4-3VifB 质粒请联系 James I Mullins 博士 (jmullins@uw.edu)
高保真DNA聚合酶赛默飞世尔科技F-549S
高保真缓冲液赛默飞世尔科技F-549S
dNTPBiolineBio-39026
热循环仪Life Technologies应用生物系统公司® GeneAmp® PCR System 9700
DNA上样染料赛默飞世尔科技R0631
1 kb Plus DNA 标准品Invitrogen10787-018
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704
DpnI 酶新英格兰生物实验室R0176S
TOP10 化学感受态细胞 大肠杆菌InvitrogenC4040-10
Luria肉汤基础粉末Invitrogen12795-084
羧苄青霉素研究产品国际公司C46000-25.0
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 Qiagen27104
EndoFree 质粒大提试剂盒Qiagen12362
转染
X-tremeGENE 9 DNA 转染试剂罗氏6365787001
HEK 293T-17ATCCCRL-11268http://www.atcc.org/
0.22 μm 滤膜上层管VWR International89220-716 
细胞培养
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Life Technologies10566016
艾斯科夫′s 改良杜尔贝科培养基′s Medium（IMDM）Life Technologies31980-030
RPMI-1640 培养基Life Technologies61870-036
植物血凝素（PHA）赛默飞世尔科技R30852801
人白细胞介素-2罗氏11147528001
胎牛血清JR Scientific43640
青霉素和链霉素Corning Cellgro30-001-CI
6孔板VWR Scientific73520-906
48孔板VWR Scientific62407-338
96孔平底板ISC BioexpressT-3015-4
96孔圆底板BD Falcon353077
1.5 ml 微型离心管贝克山生物MBD-1500
带O形圈的1.5 ml离心管VWR Scientific89004-290
50 ml 一次性塑料离心管ISC BioexpressC-3317-6
酶联免疫吸附测定
Triton-X 100Sigma-AldrichX100
磷酸盐缓冲液（PBS）Invitrogen14190-250
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF0392
甘油Sigma-AldrichG5516
Tween 20Sigma-AldrichP1379
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA2153
兔抗HIV-1 SF2 p24抗血清美国国立卫生研究院艾滋病试剂项目4250
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体KPL474-1516
TMB 微孔板过氧化物酶底物KPL52-00-01
H2SO4Fisher ScientificA300-500经任何途径接触均可引起严重灼伤。使用个人防护装备。仅可在化学通风橱中操作。立即用大量水冲洗至少15分钟。
HIV p24 标准品艾滋病与癌症病毒项目（NCI-Frederick）有关订购详情，请联系 Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov)；http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx
酶标仪Molecular DevicesVMax 动力学 ELISA 微孔板读板仪
RNA提取与cDNA合成
QIAxtractorQiagenhttp://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor
QIAamp病毒RNA小型试剂盒Qiagen52906
dNTPBiolineBio-39026
上标IIIInvitrogen18080-085
第一链缓冲液 Invitrogen18080-085
二硫苏糖醇（DTT）Invitrogen18080-085
RNase 抑制剂罗氏3335402001
RnaseHInvitrogen18021-071
qPCR
实时荧光定量PCR仪Life TechnologiesApplied Biosystems 7300 实时荧光定量 PCR 仪 
TaqMan® 基因表达预混液Life Technologies4369016
正向引物、反向引物IDT定制订单
探针Life Technologies定制订单
光学96孔反应板Life TechnologiesI19N3Q216
PCR+测序
Taq DNA 聚合酶（Biolase）BiolineBio-21043
NH4缓冲液 BiolineBio-21043
MgCl₂2BiolineBio-21043
测序引物IDT定制订单
QIAxcelQiagenhttp://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system
DNA测序服务提供商http://www.htseq.org/
GRC 网络工具http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/
ChromatQuan 网络工具http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi

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