方法文章

建立一种带有内参阳性对照的定量重组酶聚合酶扩增检测方法

DOI：

10.3791/52620

⸱

2015年3月30日

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Rice University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提供了一种利用实时重组酶聚合酶扩增技术定量DNA样本初始浓度的实验方案，该方法可使用热循环仪或显微镜配合载物台加热器进行。同时介绍了内参阳性对照的构建方法。此外，提供了用于处理原始实时荧光数据的脚本。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最近的研究表明，用于病原体检测的等温扩增技术——重组酶聚合酶扩增（RPA），可通过标准曲线对DNA样本浓度进行定量。本文提供了一套详细的实时定量重组酶聚合酶扩增检测（qRPA检测）的建立与实施操作流程。以HIV-1 DNA定量为例，文中描述了实时RPA反应体系的构建、内参阳性对照（IPC）序列的设计，以及目标物与IPC的共扩增方法。同时提供了利用多次实验数据构建标准曲线的操作说明及数据处理脚本，可用于预测未知样本的浓度或评估检测的性能。最后，介绍了一种替代方法：使用显微镜和载物台加热器实时采集荧光数据，作为迈向开发即时检测（point-of-care）qRPA检测的重要步骤。所提供的操作流程和脚本可用于针对任意目标DNA序列的qRPA检测方法的开发。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

定量核酸扩增技术在环境、食源性和水源性病原体检测以及临床诊断中具有重要意义。实时定量聚合酶链式反应（qPCR）是实现核酸高灵敏度、高特异性和定量检测的金标准方法。 例如， 用于HIV-1病毒载量检测、细菌病原体检测以及多种其他生物体的筛查1–3在实时定量PCR过程中，引物在循环中扩增病原体DNA，同时产生与每轮循环中样本扩增DNA量成正比的荧光信号。可通过标准曲线对含有未知浓度病原体DNA的样本进行定量，该曲线反映了标准样本的初始DNA浓度与荧光信号达到特定阈值所需循环数之间的关系即， 循环阈值，或 CT).

由于实时定量PCR需要昂贵的热循环设备，且获得结果需数小时，因此已开发出替代性的等温扩增技术，例如重组酶聚合酶扩增（RPA）4。这类平台通常可在更短时间内提供结果，并在较低且恒定的温度下扩增核酸，因而可使用成本更低、结构更简单的设备完成。RPA特别适用于即时检测（point-of-care）应用，可在几分钟内扩增DNA，所需扩增温度低（37 °C），并在存在杂质的情况下仍保持活性5,6。RPA检测已广泛应用于多种领域，包括食品分析、病原体检测、抗癌药物筛选以及生物威胁因子的检测7–12。然而，RPA在核酸定量方面的应用仍较为有限13,14。

在先前的研究中，已证明实时定量RPA（qRPA）是可行的15。本文提供了更为详细的实验方案，介绍如何利用标准曲线通过实时定量RPA对未知样本进行定量，该方法类似于使用qPCR进行定量。本方案描述了如何在热循环仪上进行RPA反应以检测HIV-1 DNA作为概念验证，以及如何构建内参阳性对照（IPC）以确保系统正常运行。同时详细说明了使用热循环仪或显微镜采集数据，并利用训练数据进行标准曲线构建的数据分析过程。最后，展示了如何通过自定义脚本结合标准曲线对未知样本进行定量。该qRPA技术能够实现对未知浓度样本的定量，相较于传统的实时qPCR具有多项优势。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 为实时定量RPA反应设置热循环仪程序

  1. 在热循环仪软件中创建一个新的程序。
    1. 加入预孵育步骤：39 °C 下孵育 1 分钟。
    2. 添加第二步：39 °C 反应 20 秒，随后进行板读。
    3. 最后，插入一个“GO TO”指令，使第二步重复执行59次。
    4. 保存实验方案。
  2. 在软件的“平板编辑器”选项卡中创建一个新的平板。选择平板上与RPA反应位置相对应的孔（此处使用A1、A4-A8、B1和B4-B8孔）。
    注意：孔中样本类型的顺序并不重要（例如， “标准品”、“NTC”）已作说明，因为数据分析是使用自定义脚本完成的。
    1. 对于仅包含 HIV-1 DNA 的实验，为所有孔选择“HEX”荧光染料。对于包含 HIV-1 DNA 和内参阳性对照的实验，为所有孔同时选择“HEX”和“FAM”荧光染料。保存酶标板。

2. 准备HIV-1定量RPA实验

  1. 在指定的扩增前工作区（该区域配备专用移液器、移液器吸头、涡旋振荡器和小型离心机，与qPCR操作类似）中配制RPA反应体系。由于RPA可将单拷贝DNA扩增高达十个数量级（数据未显示），因此含有扩增后DNA产物的管子必须在指定的扩增后区域进行操作和处理。
    1. 防止所有扩增前试剂与扩增后产物之间的任何接触。每次实验前后，均需用50%次氯酸钠溶液喷洒扩增前工作区及设备表面，并用纸巾擦去残留的次氯酸钠。
  2. 从商业DNA合成公司购买正向引物序列 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 和反向引物序列 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’。探针序列 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 也从商业来源采购。所有引物和探针在使用前应分装并储存在4 °C，浓度为10 µM。
    注意：该qRPA检测可扩增一段独特的HIV-1序列。在本概念验证实验中，使用Sutton et al. 描述的质粒pHIV-IRES-eYFPΔEnvΔVifΔVpr作为模板，其中包含目标序列16。在qRPA实验中，该质粒被分装后储存在4 °C，每管分别含有1、10、102、103 和 104 拷贝/µl，缓冲液成分为10 mM Tris、0.1 mM EDTA（pH 8.0），并添加1 ng/µl人基因组载体DNA（360486）。该载体DNA浓度相当于用于HIV-1诊断的商业化血清DNA提取试剂盒所获得的DNA浓度17。这些HIV-1稀释液在qRPA反应中用作模板以构建标准曲线。

3. 构建 HIV-1 定量RPA 标准曲线

  1. 在配制qRPA反应体系之前，按照步骤2.1.1所述准备预扩增工作区。将一个96孔冰盒置于4 °C冰箱中预冷。
  2. 准备12个反应所需的试剂：
    1. 将乙酸镁、复溶缓冲液和12个RPA反应干粉管转移至预扩增工作区。
    2. 在室温下解冻乙酸镁和复溶缓冲液。
    3. 取32.5 µl乙酸镁（每反应2.5 µl）分装至一微量离心管中。
    4. 配制13倍主混合液。另取一微量离心管，加入383.5 µl复溶缓冲液（每反应29.5 µl），再加入41.6 µl无核酸酶水（每反应3.2 µl）配成主混合液。用涡旋振荡器充分混匀主混合液。
    5. 将乙酸镁和复溶缓冲液放回-20 °C冰箱保存。
    6. 将引物和探针分装液从冰箱转移至预扩增区域，避免过度暴露于光线下，以减少光漂白。
    7. 向主混合液中各加入27.3 µl的10 µM正向引物和反向引物（每反应每种引物2.1 µl）。
    8. 向主混合液中加入7.8 µl的10 µM HEX标记的HIV-1 DNA探针（每反应0.6 µl）。
    9. 将引物和探针放回冰箱保存。
  3. 按照第1.2节所述的板布局，在2条低缘8联管的最左侧各管和最右侧5个管中分别放入1粒酶颗粒。
  4. 使用新的移液枪头，向每个含有酶颗粒的管中小心加入37.5 µl主混合液，并用枪头轻轻搅拌，直至颗粒完全溶解。搅拌时动作要轻柔，防止产生气泡；移出枪头时要小心，避免反应液体损失。
  5. 所有酶颗粒均用主混合液复溶后，从4 °C冰箱中取出96孔冰盒，将8联管放入冰盒中预冷主混合液。
  6. 在主混合液冷却期间，打开第1节所述的热循环仪软件程序和板设置。
  7. 裁剪2条透明塑料微密封膜，使其略宽于PCR管；同时取出2个平顶PCR管条盖备用。
  8. 从储存中取出6份模板分装液（每微升分别含有0、1、101、102、103或104拷贝的HIV-1质粒）。
  9. 向指定浓度的各管中加入10 µl模板，每管使用新的移液枪头，并用枪头轻轻搅拌以充分混匀主混合液与模板。务必确保模板加入的位置与第1.2节所述板布局一致。
  10. 确认微型离心机中已安装PCR管条适配器。
  11. 向每个将用于qRPA反应的PCR管盖中加入2.5 µl乙酸镁。
  12. 轻轻将管盖盖在PCR管上，不要完全密封，以便后续移除。乙酸镁会附着在管盖内侧，从上方可清晰观察到。
  13. 将带盖的PCR管条分别插入PCR管架两侧，关闭迷你离心机盖子，离心使管盖中的乙酸镁甩入RPA反应体系中，从而启动RPA反应。离心至所有气泡消失且液体完全沉降至各管底部（约10秒）。
  14. 迅速取出PCR管条并放回冰盒中，以终止qRPA反应。
  15. 小心移除管盖，防止气溶胶产生，并用裁剪好的透明微密封膜将每条PCR管条密封。
  16. 迅速将两条PCR管条送至热循环仪，按照板布局（A1-B8孔）放入仪器中。关闭热循环仪盖，点击“开始运行”，并为实验指定文件名。
    注意：尽管制造商建议在孵育5分钟后振荡样品，但本实验无需此步骤，可省略。
  17. 运行结束后，选择“设置”、“基线设置”、“不进行基线校正”，以显示原始荧光数据。通过选择“导出”、“导出所有数据表至Excel”将数据导出至电子表格程序。系统将生成一个附加名为“定量扩增结果”的文件，其中包含原始实时荧光数据。

4. 建立内部阳性对照

  1. 选择一种在目标样本中不太可能存在的物种的DNA序列。该序列长度需超过目标扩增子，以确保目标序列的生成占优势。
    注意：对于本实验， 微小隐孢子虫一种肠道寄生虫被选为IPC序列生成的模板，因为该生物体不太可能存在于血液中，且实验室中已有来自其他项目的样本。为生成IPC序列，需从中提取并纯化DNA C. parvum 卵囊，如其他文献所述18.
  2. 从商业来源购买正向（5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’）和反向（5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’）引物。本实验所用的IPC PCR引物如图所示 图1 并包含一个与IPC模板DNA互补的区域（例如，C. parvum，紫色在 图1）以及一个与目标生物体互补的区域（例如， HIV-1，蓝色 图1).
  3. 使用引物和IPC模板DNA进行PCR。
    1. 使用Phusion高保真DNA聚合酶试剂盒中的试剂（除聚合酶外），按照制造商说明书配制50 µl的PCR反应体系。每反应使用2 µl DNA模板和Phusion HF缓冲液。
    2. 在98 °C热启动后，向每个反应中加入Phusion聚合酶，随后在98 °C变性60秒，再进行40个循环：98 °C 15秒、62 °C 30秒、72 °C 30秒，最后在72 °C延伸5分钟。完成热循环后，将样品置于4 °C保存。
    3. 使用2% TAE琼脂糖凝胶进行凝胶电泳分析样品，然后根据试剂盒中提供的微量离心柱操作步骤，采用QIAquick Gel Extraction Kit提取并纯化DNA。
  4. 使用qRPA筛选IPC候选物的扩增能力。
    1. 按照第3节所述方法配制qRPA反应体系，使用HIV-1引物、针对IPC的FAM标记探针（5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’），以及总量分别为0、10、10的模板2, 103, 104，或 105 每次反应中每个IPC候选物的拷贝数，所有浓度均设两个重复。
    2. 选择扩增最稳定且检测下限最低的IPC候选物。
  5. 共扩增HIV-1和内参对照（IPC）以确定IPC DNA的最佳浓度。
    1. 与第3节类似，在每个50 μl反应体系中加入以下组分：29.5 μl复水缓冲液、2.1 μl RPA正向引物[10 μM]、2.1 μl RPA反向引物[10 μM]、0.6 μl HIV-1 HEX标记探针[10 μM]、10 μl不同浓度的HIV-1 DNA、2.5 μl醋酸镁和1粒酶粒。与3.2.4步骤中加入3.2 µl无核酸酶水不同，此处加入0.6 μl IPC FAM标记探针[10 μM]和2.6 μl IPC DNA。所用IPC DNA的浓度应为单独进行qRPA检测时的检测下限（LOD），即荧光信号生成量高于无靶标DNA样本所产生的背景荧光信号的最低浓度。
    2. 按照第1.1节中所述方案孵育样品。
    3. 如果内参对照（IPC）未在每个样本中扩增，可考虑使用高一个数量级的IPC浓度重新进行实验。HIV-1检测中IPC DNA的最佳浓度为10,000拷贝/μl。虽然只要出现IPC或HIV-1 DNA扩增即可认为样本有效，但理想情况下，每个反应均应检测到IPC的扩增信号。

5. 从多个实验构建标准曲线

  1. 确保每个实验的数据均已按照第3.13节所述导出至电子表格程序。
  2. 打开并运行脚本“JoVE_qRPA_standard_curve.m”。所有输入均会在命令窗口中自动提示。脚本启动后，用户将被自动提示指定用于构建标准曲线的“数据文件数量”。
  3. 在命令窗口中输入用于构建标准曲线的文件数量，然后按回车键。
  4. 在命令窗口中输入每个训练文件的样本数量和重复次数（每次输入后按回车键）。
    注意：在下述的板布局中 第1.2节共有6个不同浓度的样本，每个样本设2个重复。
  5. 在命令窗口中输入用于构建标准曲线的最低 DNA 浓度（以 log10 拷贝数表示），然后按回车键（对于第 1.2 节中描述的板布局，最低模板浓度为‘1’ log10 拷贝数）。
  6. 在命令窗口中输入各标准品之间浓度的差值（以log10拷贝数计），然后按回车键（对于第1.2节中描述的板布局，浓度间隔为“1” log10拷贝数）。
  7. 提示后，在命令窗口中输入“Slope threshold”并按回车键。
  8. 在命令窗口中输入“高于背景的阳性阈值标准差数 (z)”，然后按回车。z 的典型取值范围为 1 至 5。
  9. 输入数字“1”、“2”或“3”并按回车键，以指定数据是使用热循环仪（“1”）、*.tiff显微镜图像（“2”）还是*.jpg显微镜图像（“3”）采集的。
  10. 提示时输入“y”或“n”以选择设置新的IPC阈值或使用默认的阈值。
  11. 接下来，选择用于构建标准曲线的每个电子表格文件。
    注意：脚本随后将自动导入 HEX 和 FAM 荧光数据；判断每个反应是否有效（即， 荧光信号是否超过HEX或FAM通道的阈值；确定r2 指数、线性及二阶多项式拟合的系数；绘制用于构建标准曲线的每个样本的“log10 拷贝数 versus 循环阈值”图；并创建一个电子表格文件，包含重建标准曲线所需的关键变量，以便在验证实验中无需用户重新输入所有参数即可复现标准曲线。

6. 使用标准曲线进行检测验证及未知样本的定量分析

  1. 使用脚本“JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”对已知浓度的样本进行分析，以评估检测方法的精密度和准确度；或使用该脚本对浓度未知的样本进行定量。
    注意：由于先前发表的研究表明，指数拟合可获得最高的决定系数（r-squared）18，因此本脚本采用指数拟合方式构建标准曲线。若需使用其他类型的拟合方式，可相应修改脚本。
    1. 打开并运行脚本“JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”。脚本启动后，用户将自动被提示在命令窗口中输入所有必要信息。
    2. 输入“1”以使用已知浓度样本的标准曲线验证检测方法，或输入“2”以对未知浓度样本进行定量。
    3. 当系统提示时，选择一个已保存的标准曲线，或通过在命令窗口中输入系统自动提示的信息来构建新的标准曲线（所需信息与第5节中“JoVE_qRPA_standard_curve.m”脚本所要求的相同）。
    4. 输入待分析的实验数量（i.e., 电子表格文件数量），用于验证或定量。

7. 使用荧光显微镜和加热芯片进行数据采集的准备工作

  1. 确保荧光显微镜配备载物台加热器和1通道高精度稳定温度控制器。
  2. 确保荧光显微镜配备可激发并采集每种荧光染料荧光信号的滤光立方体。通过GFP滤光片（激发带通470/40 nm，发射带通520/50 nm）激发并采集IPC DNA扩增过程中产生的FAM荧光信号；通过HEX滤光片（激发带通530/30 nm，发射带通575/40 nm）激发并采集HIV-1 DNA扩增过程中产生的HEX荧光信号。
  3. 使用显微镜脚本编辑软件创建自动化算法，以在热循环仪上复制数据采集过程。
    1. 首先插入一个“设置”步骤以关闭快门，然后添加一个“曝光”步骤，将曝光时间设为60秒。插入一个“拍摄”步骤以执行60秒延迟，实现1分钟的预孵育期。添加一个“设置”步骤，将工作组切换至GFP滤光片。再插入另一个“曝光”步骤，将曝光时间调整为200毫秒。所有使用GFP或HEX滤光立方体的曝光均设为200毫秒。
    2. 在“曝光”步骤之后，添加一个“拍摄”步骤，并指定用于成像的相机。使用另一个“设置”步骤关闭快门，并添加一个“保存图像”步骤，将图像保存至用户定义的临时文件夹。
    3. 接着使用另一个“设置”步骤切换至HEX滤光立方体，然后添加一个200毫秒的“曝光”步骤、“拍摄”步骤和“保存图像”步骤。
    4. 重复此过程59次，但初始延迟改为20秒而非60秒（关闭快门，等待20秒，切换至GFP滤光立方体，设置曝光时间为200毫秒，拍摄，关闭快门，保存图像，切换至HEX滤光立方体，设置曝光时间为200毫秒，拍摄）。
  4. 制作用于承载qRPA反应的芯片。
    1. 对于使用显微镜的实验，使用文件JoVE_qRPA_base.ai，在厚度为1/8英寸的黑色丙烯酸板上用激光切割机（功率100%，速度10%）切割出40 × 15 mm的矩形基底。
    2. 使用文件JoVE_qRPA_well.ai，在厚度为1.5 mm的透明丙烯酸板上切割出反应孔，该反应孔为10 × 10 mm的正方形，中心带有直径5 mm的圆形孔。
    3. 使用快干胶将最多三个反应孔固定在一个基底上。
    4. 室温下过夜干燥。

8. 使用荧光显微镜进行数据采集与分析

  1. 通过加载自动数据采集脚本 JoVE_AxioVision_Script.ziscript，准备显微镜以进行数据采集。
    1. 将载物台加热器设定为 48 °C，并在加热器上预热反应芯片约 20 分钟。设定温度为 48 °C 时，反应孔内的温度可维持在 39 °C（数据未显示）。
    2. 使用10倍、0.45数值孔径的物镜，安装GFP滤光片后，对准反应孔内侧边缘的顶部进行聚焦。丙烯酸材料经激光切割后边缘具有自发荧光，可被清晰观察到。聚焦完成后，在所有数据采集结束前不得调整显微镜载物台的高度。
  2. 在指定的预扩增工作区中，按照步骤 4.5.1 所述方法配制 qRPA 预混液。针对每个样本，在微量离心管中混合酶粒、预混液和 HIV-1 DNA 模板。向第一个反应体系中加入 2.5 µl 醋酸镁，并短暂涡旋。
  3. 将含有qRPA样品的微量离心管迅速转移至荧光显微镜。
    1. 小心地将30 µl RPA反应液移入反应孔中，避免产生气泡。在RPA反应液上覆盖一滴PCR级矿物油，以防止蒸发。
    2. 将孔板置于显微镜物镜正下方，注意仅对孔的中心区域成像，避免包含任何自荧光的丙烯酸边缘。孔板定位后，运行自动化脚本7。该脚本每隔20秒使用FAM滤光片组生成一张JPEG图像，同时使用HEX滤光 片组生成另一张JPEG图像。
  4. 脚本完成后，在运行其他样本之前，将这些图像从临时存储文件夹中转移出去。
    1. 创建两个文件夹：每个荧光染料各一个即， ‘HEX’ 和 ‘FAM’）。将这两个文件夹存储在同一父文件夹中。在每个荧光染料文件夹中，创建一个以样品中DNA拷贝数命名的文件夹例如， 0, 10, 等等。).
    2. 将所有以“HEX”为前缀的文件转移至“HEX”文件夹中对应的子文件夹内。将所有以“GFP”为前缀的文件转移至“FAM”文件夹中对应的子文件夹内。
  5. 重复步骤 8.2–8.4，进行含 0、10、10 的 qRPA 反应2, 103, 104，和105 HIV-1 DNA 拷贝数
  6. 在完成实验中所有qRPA样本的数据采集后，加载脚本“JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”。当脚本提示时，选择包含两个荧光染料文件夹的父文件夹，这两个荧光染料文件夹下又分别包含各浓度样本图像的子文件夹。
    注意：脚本将在父目录中自动生成一个电子表格文件，其中HEX荧光数据将保存在名为“HEX”的工作表中，FAM荧光数据将保存在名为“FAM”的工作表中。在每个工作表中，循环次数列于B列，随着模板浓度递增的实时荧光数据分别列于C、D列 等等每个实时荧光数据点均为在对应时间点采集的图像的平均荧光强度。
  7. 使用电子表格程序中的默认散点图功能，绘制“HEX”和“FAM”工作表中 B2:H61 单元格的数据，以可视化实时荧光信号，并生成类似于以下所示的图表 图2A、2B、3A 和 3B.
    注意：步骤 8.6 中生成的电子表格也可用于脚本“JoVE_qRPA_standard_curve.m”和“JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在选择用于靶标（HIV-1）DNA 的 qRPA 实验中的内源性阳性对照（IPC）序列之前，需先设计并筛选一系列 IPC 候选序列，评估其在无 HIV-1 DNA 存在时能否在 qRPA 反应中扩增。IPC 候选序列的长度需超过靶标（HIV-1）DNA，以防止 IPC 扩增产物的生成与 HIV-1 扩增产物竞争反应资源。如图 2A所示，通过凝胶电泳检测到 415 和 435 bp 条带，验证了两个C. parvum IPC 候选序列的成功构建。在 qRPA 反应中，较短的 IPC 候选序列扩增信号微弱（图 2B），而较长的候选序列在模板量为 104 和 105 拷贝时均能稳定扩增（图 2C）。因此，选择较长的候选序列作为 HIV-1 qRPA 实验的 IPC。

实时定量RPA可单独使用目标序列进行，也可同时使用目标序列和内参对照（IPC）进行。图3展示了一项在热循环仪上同时检测HIV-1...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了使用 MATLAB 算法获得有意义的定量数据，用户必须在程序提示时选择合适的输入值。在启动第 5 和第 6 节中的每个脚本后，所有输入变量将自动在命令窗口中被请求，输出结果也将自动生成。在第 5.7 节中，用户会被提示选择一个斜率阈值。该斜率阈值的取值会影响拟合结果的相关系数平方（r2）。当使用从热循环仪导出的原始荧光数据时，取值在 2.0 到 5.0 之间通常可获得较高的 r2 系数。在第 5.8 节中，用户必须指定高于背景信号的阳性阈值所对应的标准差倍数。为了判断样本为阳性或阴性，脚本会自动利用热循环仪导出的原始荧光数据，计算每个样本的最大与最小荧光值之间的差值 Δsample。随后，脚本计算所有无靶标对照样本的平均差值 Δbackground 及其标准差 σbackground。若 Δsample 超过 Δbackground 加上 z × σbackground，则该样本被判定为阳性。在第 5.10 节中，用户需决定使用默认阈值还是设定新的阈值。若用户...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由比尔 & 比尔及梅琳达·盖茨基金会通过全球健康重大挑战计划资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
qRPA 检测
HIV-1 正向引物Integrated DNA Technologies定制DNA寡核苷酸5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 逆转录引物Integrated DNA Technologies定制DNA寡核苷酸5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 探针BioSearch Technologies 定制DNA寡核苷酸5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC探针BioSearch Technologies 定制DNA寡核苷酸5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo 试剂（小球，重悬缓冲液，乙酸镁）TwistDxTwistAmp exo
PCR管条伯乐（BioRad）TLS0801
PCR 平盖管条BioRadTCS0803
微密封胶伯乐（BioRad）558/MJ 
HIV-1 靶标 (pHIV-IRES-eYFP)ΔEnvΔVifΔVpr定制质粒，参见：Segall, H. I., Yoo, E. && 萨顿，R. E. 改变宿主范围的人工复制型慢病毒的表征与检测。《分子治疗》8，118–129，doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003)。
人类男性基因组DNA应用生物系统公司360486
96孔冷块Cole ParmerEW-36700-48
热循环仪BioRadCFX96
MiniFugeVWR93000-196
涡旋混合VWR58816-121
1.0 M Tris 缓冲液，pH 8.0EMD Millipore648314
EDTA 0.5 M，pH 8.0PromegaV4321
无核酸酶水AmbionAM9937
IPC 开发
微小隐孢子虫 IPC 模板水传播公司P102C如果使用者不具备处理隐孢子虫（C. parvum，一种生物安全二级病原体）的条件，可从IDT订购双链合成靶标。用于隐孢子虫的PCR和RPA引物设计基于GenBank登录号AF115377.1。
PCR长正向引物Integrated DNA Technologies定制DNA寡核苷酸5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR长反向引物Integrated DNA Technologies定制DNA寡核苷酸5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion 高保真 DNA 聚合酶New England BiolabsM0530S
Qiaquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704
TAE 10X 缓冲液EMD Millipore574797
琼脂糖Sigma AldrichA9539
显微镜实验
直立式荧光显微镜蔡司Zeiss Imager.J1
载物台加热器生物科学工具TC-GSH
1-通道高精度高稳定性温度控制器生物科学工具TC-1100S
FAM/GFP滤光片组蔡司滤光片组 38 (000000-1031-346)激发带通 470/40 nm，发射带通 520/50 nm
HEX滤光片组色度49014激发带通 530/30 nm，发射带通 575/40 nm
激光切割机雕刻师网络VLS3.60
1/8" 黑色亚克力McMaster Carr8505K113
1.5 毫米透明亚克力McMaster CarrPD-72268940 
超级胶水办公用品仓库Duro 超强胶水 
PCR级矿物油Sigma AldrichM8662-5VL
数据分析
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参考文献

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