一个定量聚合酶重组酶扩增法的发展与内部阳性对照

Summary

提供是一种开发实时重组酶聚合酶扩增测定的方案，以使用热循环仪或显微镜和载物台加热器定量 DNA 样品的初始浓度。还描述了内部阳性对照的开发。提供了用于处理原始实时荧光数据的脚本。

Abstract

最近证明，重组酶聚合酶扩增 （RPA） 是一种用于病原体检测的等温扩增平台，可用于使用标准曲线定量 DNA 样品浓度。在本手稿中，提供了开发和实施实时定量重组酶聚合酶扩增测定 （qRPA 测定） 的详细方案。以 HIV-1 DNA 定量为例，描述了实时 RPA 反应的组装、内部阳性对照 （IPC） 序列的设计以及 IPC 和目标靶标的共扩增。提供了使用来自多个实验的数据构建标准曲线的说明和数据处理脚本，可用于预测未知样品的浓度或评估检测性能。最后，描述了一种使用显微镜和载物台加热器收集实时荧光数据的替代方法，作为开发即时 qRPA 测定的一个步骤。提供的实验步骤和脚本可用于开发任何目标 DNA 靶标的 qRPA 检测。

Introduction

定量核酸扩增是用于检测环境，食源性和水生病原体，以及用于临床诊断的一项重要技术。实时定量聚合酶链反应（qPCR的）可以灵敏，特异和定量检测的核酸， 例如，HIV-1的病毒载量检测，检测的细菌病原体，并筛选许多其他生物体¹的金标准方法^{- 3。}在实时定量PCR，引物扩增在周期病原体的DNA和荧光信号被产生成比例的扩增的DNA的样​​品，在每个循环中的量。将含有未知浓度的病原体的DNA的样品可以使用涉及标准样品的初始DNA浓度和在该荧光信号达到一定的阈值的时间（ 即，循环阈值，或（C _T））的标准曲线进行定量。

因为实时定量PCR需要昂贵的热循环设备及几个小时来接收结果，替代等温扩增技术，如重组酶聚合酶扩增（RPA），已经开发了^4。这些平台通常提供结果更快和扩增核酸在一个较低的，单一的温度，其可以实现与更便宜，更简单的设备。 RPA，其用于护理点的应用特别有吸引力的，放大的DNA在几分钟内，需要低放大温度（37℃），并且在杂质^5,6存在下保持有效。 RPA试验已经开发了用于范围广泛的应用，包括食品分析，病原体检测，癌症药物筛选，并检测生物威胁因子^{7 - 12。}然而，使用的RPA的用于核酸定量一直局限于^13,14。

在以往的工作，这是笑WN的....

Protocol

1.程序的实时qRPA反应的热循环仪

1. 创建在热循环仪软件的新协议。
   1. 插入预孵育步骤:39℃，1分钟。
   2. 添加第二个步骤:39℃，20秒，接着是板读。
   3. 最后，插入一个"GO TO"，重复第二步59次以上。
   4. 保存的协议。
2. 在软件的"板块编辑器"选项卡中创建一个新的板块。选择上板孔对应于​​RPA反应的位置（这里，利用井A1，A4-A8，B1和B4-B8）。
   注:是否指定井（ 例如，"标准"，"NTC"）的样品类型，使用自定义脚本来完成数据分析并不重要。
   1. 对于含有HIV-1 DNA只实验，选择"HEX"荧光所有井。对于含有HIV-1 DNA和内部积极合作实验ntrol，同时选中"HEX"和"FAM"荧光所有井。存盘。

2.准备HIV-1 qRPA实验

1. 组装RPA反应在含有指定移液器，移液管尖端，涡流混合器，和微型离心机，作为用于定量PCR指定的前置放大工作区。如RPA可由幅度高达10个数量扩增DNA的单拷贝（数据未示出），处理和处置含有DNA后的扩增产物在一指定的后扩增区管。
   1. 防止所有预扩增试剂和扩增后的产品之间的接触。之前和所有实验后喷预放大工作空间和设备，用50％的漂白剂。用纸巾擦去多余的漂白剂。
2. 购买正....

Results

选择一个序列作为IPC在qRPA实验目标之前（HIV-1）的DNA，内部阳性对照（IPC）的候选人中产生和筛选它们放大的qRPA反应无HIV-1 DNA存在的能力。 IPC考生比目标（HIV-1）的DNA，以防止出竞争的HIV-1扩增子形成IPC形成更长的时间。 如图2A所示 ，两个C的代孢子虫 IPC候选人是由使 ​​用凝胶电泳415和435 bp的条带的存在验证。在qRPA反应，较短的IPC候选呈现小的扩增（ 图2B），而较长的候补一致扩增时共有10 ⁴和10 ^5个拷贝人出席（ 图2C）。因此，时间越长候选人被选为了IPC的HIV-1 qRPA实验。

实时qRPA可以使用感兴趣的靶单独使用或使用来执行两个目标和IPC。 图3示出了使用两个HIV-1的DNA和C.关于热循环仪的实验孢子虫 IPC。在该实验中，2.6×10 ^.......

Discussion

为了获得使用MATLAB算法有意义的量化数据，系统提示时，用户必须选择合适的输入值。开始在第5和第6的每个脚本之后，所有的输入变量自动征求在命令窗口中，并自动生成输出。在第5.7节中提示用户选择斜率阈值。的斜率阈值影响契合的相关系数（R ^2）的平方。当使用从热循环仪导出原始荧光数据，在2.0和5.0的值趋向于产生高R ²系数。在第5.8节，用户必须指定背景以上的标准偏差的数量来设置正阈值。得分的样品为阳性或阴性，该脚本自动确定使用从THERMA导出的原始荧光数据的最大和最小荧光各样品之间的差Δ _样本升循环仪。它计算平均差Δ _背景和标准偏差σ _背景对于所有无目标的对照样品。样品被认为是阳性的，如果Δ _样本是大于Z×σ _背景之上Δ _背景 。在第5.10节用户决定是否使用默认的阈值或设定新的门槛。如果用户希望设置一个新的阈值，通过实验进行3个实验各自含有12 RPA反应，没有任何的HIV-1的DNA本确定新的阈值。从这些实验中加3个标准差中的荧光强度的平均增加设置的阈值.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qRPA 检测
HIV-1 正向引物	Integrated DNA Technologies	定制 DNA 寡核苷酸	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT AAA AAA GAA AAG G-3'
HIV-1 反向引物	Integrated DNA Technologies	定制 DNA 寡核苷酸	5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3'
HIV-1 探针	BioSearch Technologies	定制 DNA 寡核苷酸	5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TCC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3'
IPC 探针	BioSearch Technologies	定制 DNA 寡核苷酸	5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'
RPA exo 试剂（沉淀、再水化缓冲液、乙酸镁	TwistDx	TwistAmp exo
PCR 联排	BioRad	TLS0801
PCR 平盖联排	BioRad	TCS0803
微密封胶粘剂	BioRad	558/MJ
HIV-1 靶标 （pHIV-IRES- eYFPΔ环境&增量;VifΔVpr）			定制质粒，参见：Segall， H. I.， Yoo， E. &Sutton， RE 改变宿主范围的人工复制能力慢病毒的表征和检测。分子疗法 8， 118–129， doi：10.1016/S1525-0016（03）00134-5 （2003）.
人雄性基因组 DNA	Applied Biosystems	360486
96 孔冷模块	Cole Parmer	EW-36700-48
热循环仪	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
涡旋	VWR	58816-121
Tris 缓冲液 1.0 M，pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M，pH 值 8.0	Promega	V4321
无核酸酶水	Ambion	AM9937
IPC 开发
小隐孢子虫 IPC 模板	Waterborne Inc	P102C	如果用户不具备使用小隐孢子虫（一种 BSL-2 感染源）的能力，也可以从 IDT 订购双链合成靶标。使用 GenBank 登录号 AF115377.1
PCR 长正向引物	Integrated DNA Technologies	定制 DNA 寡核苷酸	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'
PCR 长链反向引物	Integrated DNA Technologies	定制 DNA 寡核苷酸	5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTT TTG TAA TTT GTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick 凝胶提取试剂盒	Qiagen	28704
TAE 10X 缓冲液	EMD Millipore	574797
琼脂糖	Sigma Aldrich	A9539
显微镜实验
正置荧光显微镜	蔡司	蔡司 Imager.J1
载物台加热器	生物科学工具	TC-GSH
1 通道精密高稳定性温度控制器	生物科学工具	TC-1100S
FAM/GFP 滤光片立方体	蔡司	滤光片套装 38 （000000-1031-346）	激发光 470/40 nm，发射光 BP 520/50 nm
六角滤光片立方体	Chroma	49014	激发光 BP 530/30 nm，发射 BP 575/40 nm
激光切割机	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" 黑色亚克力	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm 透明亚克力	McMaster Carr	PD-72268940
超级胶	Office Depot	Duro 超级胶水
PCR 级矿物油	Sigma Aldrich	M8662-5VL
数据分析
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
脚本："JoVE_qRPA_standard_curve.m"	包含在 SI
MATLAB 脚本中："JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"	包含在 SI
MATLAB 脚本中："JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"	包含在 SI
中 Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	包含在 SI
中 JoVE_qRPA_base.ai	包含在 SI
AxioVision 软件	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	包含在 SI