建立一种带有内参阳性对照的定量重组酶聚合酶扩增检测方法

以下实验的总体目标是利用定量重组酶聚合酶扩增技术来测定未知样本的DNA浓度。首先将目标DNA、内参阳性对照、DNA引物以及荧光标记的探针加入反应体系中；第二步，将反应体系放入实时PCR仪中，仪器通过加热激活酶活性，并实时监测探针的荧光信号，从而检测目标片段和对照片段扩增产物的生成情况。

接下来，使用脚本分析荧光数据，以生成标准曲线并验证检测的准确性。结果表明，在基于用于定量HIV单靶标DNA的验证实验中，DNA样本的浓度可在正确浓度的1个数量级范围内被准确测定。该技术相较于实时定量PCR等现有方法的主要优势在于，RPA为等温扩增，因此无需使用昂贵的热循环仪。

RPA 还需要较低的扩增温度，可耐受杂质较多的样本，在几分钟内即可将目标扩增至可检测水平，并使用冻干酶，便于在室温下运输和储存。首先，用50%的漂白液清洁所有实验台面和设备表面，以创建一个洁净的扩增前工作区；从-20°C冰箱中取出280毫摩尔的乙酸镁溶液、重悬缓冲液和反应冻干颗粒，在室温下解冻。然后通过将383.5微升重悬缓冲液转移至新的微量离心管中，加入41.6微升无核酸酶水至缓冲液中，涡旋混匀；再将35微升乙酸镁加入另一单独管中，配制总反应混合液。

将再水化缓冲液储存液中的乙酸镁放回冷冻柜中。然后从4摄氏度冰箱中取出引物和探针。将它们放置于预扩增工作区，并关闭灯光以减少光照暴露。向主混合液中加入各27.3 µL的10 µmol/L正向和反向引物。

接下来，向主混合液中加入7.8微升的10微摩尔荧光素标记的HIV-1 DNA探针，并涡旋振荡该离心管。然后将引物和探针的储备液放回储存条件。内部阳性对照的试剂可按照文本方案中的说明在此步骤加入，以完成QRPA反应体系的配制。首先，将冻干的酶小球分别放入两个低缘八联PCR管条的各个管中，再用移液器向含有酶小球的管中加入37.5微升主混合液。

用移液枪枪头轻轻搅动管内物质，以溶解沉淀，注意避免产生气泡。小心地将枪头从反应管中取出，防止液体损失，并确保每根试管之间更换新的移液枪头。将试管转移至预冷的96孔冷块中，至少冷却5分钟，使预混液降温。

同时，将热循环仪软件加载程序，并按照文本方案中指示的板布局进行设置。接下来，裁剪两条透明塑料微孔密封胶带，使其略宽于PCR管。同时准备两个平盖PCR管条形盖，按照文本方案中的指示分装HIV-1质粒模板。

然后向相应的PCR管中加入10 µL模板。再次用移液枪枪头轻轻搅拌混合。接着，向每个管盖中加入2.5 µL乙酸镁，然后轻轻将管盖盖在反应管上，使其未完全密封。

通过管盖应能清晰看到乙酸镁。将PCR管条放入微量离心机中，离心10秒，使所有液体聚集于管底，并去除任何气泡。将乙酸镁溶液与主混合液混合可启动QRPA反应。

迅速将PCR管转移至冷块中以终止反应。接下来，缓慢打开管盖，防止污染反应体系，并使用透明微量密封膜密封管子。根据板布局中的位置，将管子转移至热循环仪中。

关闭热循环仪的盖子，然后点击开始运行。运行结束后，务必为实验指定一个文件名。查看原始荧光数据，并将其导出至电子表格，这将生成一个名为“定量扩增结果”的文件。

为建立标准曲线，首先下载标准曲线脚本，然后打开 MATLAB 或类似的数据分析程序。打开该脚本并点击运行以执行脚本。

提示时输入要分析的数据文件数量。然后，在命令窗口中输入每个训练文件中的样本数量和每个样本的重复次数。

输入用于构建标准曲线的最低 DNA 浓度（以 10 的幂次拷贝数表示），然后按回车键。在此示例中，最低浓度为 1 个以 10 为底的对数拷贝数。

然后在命令提示符中输入每个DNA标准品之间的浓度差异，然后在此处按回车键。浓度间隔为基于10拷贝的对数级差。接下来，在命令窗口中输入斜率阈值，并按回车键。

该值通常介于三到五之间。在“阳性阈值”（也称为 Z）中输入高于背景的倍数标准差数值，然后按回车键，典型的 Z 值范围为一到五。接下来，指定用于采集此数据的设备。

输入1作为梯度PCR仪的类型，然后按回车键。如果有内参阳性对照，请根据是否需要设定新的阈值，输入Y或N来选择默认值或新阈值。最后，选择所有将用于构建标准曲线的电子表格文件。

该脚本将自动导入并分析所有数据。对含有不同拷贝数HIV 1D NA的重复样本进行实时定量PCR扩增分析。可检测扩增的起始时间通过荧光信号的增加来指示，对于DNA拷贝数较高的样本，荧光信号的上升早于拷贝数较低的样本。利用原始荧光数据，通过已知浓度HIV 1D NA的扩增结果生成标准曲线。这些数据被拟合为指数曲线，R²值表明拟合度很高。

标准曲线用于预测已知浓度的其他DNA样本的浓度。将Z值调整为1可准确预测低浓度DNA。相比之下，Z值为5时对高浓度DNA的预测效果更佳。

进行此操作时，需注意RPA缺乏真正的循环过程来限制DNA扩增速率，因此必须精确控制扩增速率。实验间的可重复性至关重要，因此务必在所有实验中使用相同的引物分装样品。

避免反应组分接触热源和光照。在开始数据采集前立即加入乙酸镁，并在开始实验前将反应体系始终置于冷块中。