Name: 一个定量聚合酶重组酶扩增法的发展与内部阳性对照 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习定量重组酶聚合酶扩增法用于DNA浓度定量分析，该方法包含内部阳性对照和实时荧光监测。此技术无需昂贵热循环仪，可在等温条件下快速完成DNA定量，适用于分子生物学研究。

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本研究由比尔 &amp;#38; 比尔及梅琳达·盖茨基金会通过全球健康重大挑战计划资助。

1. 为实时定量RPA反应设置热循环仪程序
<ol>
	<li>在热循环仪软件中创建一个新的程序。
	<ol>
		<li>加入预孵育步骤：39 °C 下孵育 1 分钟。</li>
		<li>添加第二步：39 °C 反应 20 秒，随后进行板读。</li>
		<li>最后，插入一个“GO TO”指令，使第二步重复执行59次。</li>
		<li>保存实验方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在软件的“平板编辑器”选项卡中创建一个新的平板。选择平板上与RPA反应位置相对应的孔（此处使用A1、A4-A8、B1和B4-B8孔）。 
	注意：孔中样本类型的顺序并不重要（例如， “标准品”、“NTC”）已作说明，因为数据分析是使用自定义脚本完成的。
	<ol>
		<li>对于仅包含 HIV-1 DNA 的实验，为所有孔选择“HEX”荧光染料。对于包含 HIV-1 DNA 和内参阳性对照的实验，为所有孔同时选择“HEX”和“FAM”荧光染料。保存酶标板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备HIV-1定量RPA实验
<ol>
	<li>在指定的扩增前工作区（该区域配备专用移液器、移液器吸头、涡旋振荡器和小型离心机，与qPCR操作类似）中配制RPA反应体系。由于RPA可将单拷贝DNA扩增高达十个数量级（数据未显示），因此含有扩增后DNA产物的管子必须在指定的扩增后区域进行操作和处理。
	<ol>
		<li>防止所有扩增前试剂与扩增后产物之间的任何接触。每次实验前后，均需用50%次氯酸钠溶液喷洒扩增前工作区及设备表面，并用纸巾擦去残留的次氯酸钠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从商业DNA合成公司购买正向引物序列 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 和反向引物序列 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’。探针序列 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 也从商业来源采购。所有引物和探针在使用前应分装并储存在4 °C，浓度为10 µM。 
	注意：该qRPA检测可扩增一段独特的HIV-1序列。在本概念验证实验中，使用Sutton et al. 描述的质粒pHIV-IRES-eYFPΔEnvΔVifΔVpr作为模板，其中包含目标序列16。在qRPA实验中，该质粒被分装后储存在4 °C，每管分别含有1、10、102、103 和 104 拷贝/µl，缓冲液成分为10 mM Tris、0.1 mM EDTA（pH 8.0），并添加1 ng/µl人基因组载体DNA（360486）。该载体DNA浓度相当于用于HIV-1诊断的商业化血清DNA提取试剂盒所获得的DNA浓度17。这些HIV-1稀释液在qRPA反应中用作模板以构建标准曲线。</li>
</ol>
3. 构建 HIV-1 定量RPA 标准曲线
<ol>
	<li>在配制qRPA反应体系之前，按照步骤2.1.1所述准备预扩增工作区。将一个96孔冰盒置于4 °C冰箱中预冷。</li>
	<li>准备12个反应所需的试剂：
	<ol>
		<li>将乙酸镁、复溶缓冲液和12个RPA反应干粉管转移至预扩增工作区。</li>
		<li>在室温下解冻乙酸镁和复溶缓冲液。</li>
		<li>取32.5 µl乙酸镁（每反应2.5 µl）分装至一微量离心管中。</li>
		<li>配制13倍主混合液。另取一微量离心管，加入383.5 µl复溶缓冲液（每反应29.5 µl），再加入41.6 µl无核酸酶水（每反应3.2 µl）配成主混合液。用涡旋振荡器充分混匀主混合液。</li>
		<li>将乙酸镁和复溶缓冲液放回-20 °C冰箱保存。</li>
		<li>将引物和探针分装液从冰箱转移至预扩增区域，避免过度暴露于光线下，以减少光漂白。</li>
		<li>向主混合液中各加入27.3 µl的10 µM正向引物和反向引物（每反应每种引物2.1 µl）。</li>
		<li>向主混合液中加入7.8 µl的10 µM HEX标记的HIV-1 DNA探针（每反应0.6 µl）。</li>
		<li>将引物和探针放回冰箱保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照第1.2节所述的板布局，在2条低缘8联管的最左侧各管和最右侧5个管中分别放入1粒酶颗粒。</li>
	<li>使用新的移液枪头，向每个含有酶颗粒的管中小心加入37.5 µl主混合液，并用枪头轻轻搅拌，直至颗粒完全溶解。搅拌时动作要轻柔，防止产生气泡；移出枪头时要小心，避免反应液体损失。</li>
	<li>所有酶颗粒均用主混合液复溶后，从4 °C冰箱中取出96孔冰盒，将8联管放入冰盒中预冷主混合液。</li>
	<li>在主混合液冷却期间，打开第1节所述的热循环仪软件程序和板设置。</li>
	<li>裁剪2条透明塑料微密封膜，使其略宽于PCR管；同时取出2个平顶PCR管条盖备用。</li>
	<li>从储存中取出6份模板分装液（每微升分别含有0、1、101、102、103或104拷贝的HIV-1质粒）。</li>
	<li>向指定浓度的各管中加入10 µl模板，每管使用新的移液枪头，并用枪头轻轻搅拌以充分混匀主混合液与模板。务必确保模板加入的位置与第1.2节所述板布局一致。</li>
	<li>确认微型离心机中已安装PCR管条适配器。</li>
	<li>向每个将用于qRPA反应的PCR管盖中加入2.5 µl乙酸镁。</li>
	<li>轻轻将管盖盖在PCR管上，不要完全密封，以便后续移除。乙酸镁会附着在管盖内侧，从上方可清晰观察到。</li>
	<li>将带盖的PCR管条分别插入PCR管架两侧，关闭迷你离心机盖子，离心使管盖中的乙酸镁甩入RPA反应体系中，从而启动RPA反应。离心至所有气泡消失且液体完全沉降至各管底部（约10秒）。</li>
	<li>迅速取出PCR管条并放回冰盒中，以终止qRPA反应。</li>
	<li>小心移除管盖，防止气溶胶产生，并用裁剪好的透明微密封膜将每条PCR管条密封。</li>
	<li>迅速将两条PCR管条送至热循环仪，按照板布局（A1-B8孔）放入仪器中。关闭热循环仪盖，点击“开始运行”，并为实验指定文件名。 
	注意：尽管制造商建议在孵育5分钟后振荡样品，但本实验无需此步骤，可省略。</li>
	<li>运行结束后，选择“设置”、“基线设置”、“不进行基线校正”，以显示原始荧光数据。通过选择“导出”、“导出所有数据表至Excel”将数据导出至电子表格程序。系统将生成一个附加名为“定量扩增结果”的文件，其中包含原始实时荧光数据。</li>
</ol>
4. 建立内部阳性对照
<ol>
	<li>选择一种在目标样本中不太可能存在的物种的DNA序列。该序列长度需超过目标扩增子，以确保目标序列的生成占优势。 
	注意：对于本实验， 微小隐孢子虫一种肠道寄生虫被选为IPC序列生成的模板，因为该生物体不太可能存在于血液中，且实验室中已有来自其他项目的样本。为生成IPC序列，需从中提取并纯化DNA C. parvum 卵囊，如其他文献所述18.</li>
	<li>从商业来源购买正向（5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’）和反向（5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’）引物。本实验所用的IPC PCR引物如图所示 图1 并包含一个与IPC模板DNA互补的区域（例如，C. parvum，紫色在 图1）以及一个与目标生物体互补的区域（例如， HIV-1，蓝色 图1).</li>
	<li>使用引物和IPC模板DNA进行PCR。
	<ol>
		<li>使用Phusion高保真DNA聚合酶试剂盒中的试剂（除聚合酶外），按照制造商说明书配制50 µl的PCR反应体系。每反应使用2 µl DNA模板和Phusion HF缓冲液。</li>
		<li>在98 °C热启动后，向每个反应中加入Phusion聚合酶，随后在98 °C变性60秒，再进行40个循环：98 °C 15秒、62 °C 30秒、72 °C 30秒，最后在72 °C延伸5分钟。完成热循环后，将样品置于4 °C保存。</li>
		<li>使用2% TAE琼脂糖凝胶进行凝胶电泳分析样品，然后根据试剂盒中提供的微量离心柱操作步骤，采用QIAquick Gel Extraction Kit提取并纯化DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用qRPA筛选IPC候选物的扩增能力。
	<ol>
		<li>按照第3节所述方法配制qRPA反应体系，使用HIV-1引物、针对IPC的FAM标记探针（5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’），以及总量分别为0、10、10的模板2, 103, 104，或 105 每次反应中每个IPC候选物的拷贝数，所有浓度均设两个重复。</li>
		<li>选择扩增最稳定且检测下限最低的IPC候选物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共扩增HIV-1和内参对照（IPC）以确定IPC DNA的最佳浓度。
	<ol>
		<li>与第3节类似，在每个50 μl反应体系中加入以下组分：29.5 μl复水缓冲液、2.1 μl RPA正向引物[10 μM]、2.1 μl RPA反向引物[10 μM]、0.6 μl HIV-1 HEX标记探针[10 μM]、10 μl不同浓度的HIV-1 DNA、2.5 μl醋酸镁和1粒酶粒。与3.2.4步骤中加入3.2 µl无核酸酶水不同，此处加入0.6 μl IPC FAM标记探针[10 μM]和2.6 μl IPC DNA。所用IPC DNA的浓度应为单独进行qRPA检测时的检测下限（LOD），即荧光信号生成量高于无靶标DNA样本所产生的背景荧光信号的最低浓度。</li>
		<li>按照第1.1节中所述方案孵育样品。</li>
		<li>如果内参对照（IPC）未在每个样本中扩增，可考虑使用高一个数量级的IPC浓度重新进行实验。HIV-1检测中IPC DNA的最佳浓度为10,000拷贝/μl。虽然只要出现IPC或HIV-1 DNA扩增即可认为样本有效，但理想情况下，每个反应均应检测到IPC的扩增信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 从多个实验构建标准曲线
<ol>
	<li>确保每个实验的数据均已按照第3.13节所述导出至电子表格程序。</li>
	<li>打开并运行脚本“JoVE_qRPA_standard_curve.m”。所有输入均会在命令窗口中自动提示。脚本启动后，用户将被自动提示指定用于构建标准曲线的“数据文件数量”。</li>
	<li>在命令窗口中输入用于构建标准曲线的文件数量，然后按回车键。</li>
	<li>在命令窗口中输入每个训练文件的样本数量和重复次数（每次输入后按回车键）。 
	注意：在下述的板布局中 第1.2节共有6个不同浓度的样本，每个样本设2个重复。</li>
	<li>在命令窗口中输入用于构建标准曲线的最低 DNA 浓度（以 log10 拷贝数表示），然后按回车键（对于第 1.2 节中描述的板布局，最低模板浓度为‘1’ log10 拷贝数）。</li>
	<li>在命令窗口中输入各标准品之间浓度的差值（以log10拷贝数计），然后按回车键（对于第1.2节中描述的板布局，浓度间隔为“1” log10拷贝数）。</li>
	<li>提示后，在命令窗口中输入“Slope threshold”并按回车键。</li>
	<li>在命令窗口中输入“高于背景的阳性阈值标准差数 (z)”，然后按回车。z 的典型取值范围为 1 至 5。</li>
	<li>输入数字“1”、“2”或“3”并按回车键，以指定数据是使用热循环仪（“1”）、*.tiff显微镜图像（“2”）还是*.jpg显微镜图像（“3”）采集的。</li>
	<li>提示时输入“y”或“n”以选择设置新的IPC阈值或使用默认的阈值。</li>
	<li>接下来，选择用于构建标准曲线的每个电子表格文件。 
	注意：脚本随后将自动导入 HEX 和 FAM 荧光数据；判断每个反应是否有效（即， 荧光信号是否超过HEX或FAM通道的阈值；确定r2 指数、线性及二阶多项式拟合的系数；绘制用于构建标准曲线的每个样本的“log10 拷贝数 versus 循环阈值”图；并创建一个电子表格文件，包含重建标准曲线所需的关键变量，以便在验证实验中无需用户重新输入所有参数即可复现标准曲线。</li>
</ol>
6. 使用标准曲线进行检测验证及未知样本的定量分析
<ol>
	<li>使用脚本“JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”对已知浓度的样本进行分析，以评估检测方法的精密度和准确度；或使用该脚本对浓度未知的样本进行定量。 
	注意：由于先前发表的研究表明，指数拟合可获得最高的决定系数（r-squared）18，因此本脚本采用指数拟合方式构建标准曲线。若需使用其他类型的拟合方式，可相应修改脚本。
	<ol>
		<li>打开并运行脚本“JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”。脚本启动后，用户将自动被提示在命令窗口中输入所有必要信息。</li>
		<li>输入“1”以使用已知浓度样本的标准曲线验证检测方法，或输入“2”以对未知浓度样本进行定量。</li>
		<li>当系统提示时，选择一个已保存的标准曲线，或通过在命令窗口中输入系统自动提示的信息来构建新的标准曲线（所需信息与第5节中“JoVE_qRPA_standard_curve.m”脚本所要求的相同）。</li>
		<li>输入待分析的实验数量（i.e., 电子表格文件数量），用于验证或定量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 使用荧光显微镜和加热芯片进行数据采集的准备工作
<ol>
	<li>确保荧光显微镜配备载物台加热器和1通道高精度稳定温度控制器。</li>
	<li>确保荧光显微镜配备可激发并采集每种荧光染料荧光信号的滤光立方体。通过GFP滤光片（激发带通470/40 nm，发射带通520/50 nm）激发并采集IPC DNA扩增过程中产生的FAM荧光信号；通过HEX滤光片（激发带通530/30 nm，发射带通575/40 nm）激发并采集HIV-1 DNA扩增过程中产生的HEX荧光信号。</li>
	<li>使用显微镜脚本编辑软件创建自动化算法，以在热循环仪上复制数据采集过程。
	<ol>
		<li>首先插入一个“设置”步骤以关闭快门，然后添加一个“曝光”步骤，将曝光时间设为60秒。插入一个“拍摄”步骤以执行60秒延迟，实现1分钟的预孵育期。添加一个“设置”步骤，将工作组切换至GFP滤光片。再插入另一个“曝光”步骤，将曝光时间调整为200毫秒。所有使用GFP或HEX滤光立方体的曝光均设为200毫秒。</li>
		<li>在“曝光”步骤之后，添加一个“拍摄”步骤，并指定用于成像的相机。使用另一个“设置”步骤关闭快门，并添加一个“保存图像”步骤，将图像保存至用户定义的临时文件夹。</li>
		<li>接着使用另一个“设置”步骤切换至HEX滤光立方体，然后添加一个200毫秒的“曝光”步骤、“拍摄”步骤和“保存图像”步骤。</li>
		<li>重复此过程59次，但初始延迟改为20秒而非60秒（关闭快门，等待20秒，切换至GFP滤光立方体，设置曝光时间为200毫秒，拍摄，关闭快门，保存图像，切换至HEX滤光立方体，设置曝光时间为200毫秒，拍摄）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制作用于承载qRPA反应的芯片。
	<ol>
		<li>对于使用显微镜的实验，使用文件JoVE_qRPA_base.ai，在厚度为1/8英寸的黑色丙烯酸板上用激光切割机（功率100%，速度10%）切割出40 × 15 mm的矩形基底。</li>
		<li>使用文件JoVE_qRPA_well.ai，在厚度为1.5 mm的透明丙烯酸板上切割出反应孔，该反应孔为10 × 10 mm的正方形，中心带有直径5 mm的圆形孔。</li>
		<li>使用快干胶将最多三个反应孔固定在一个基底上。</li>
		<li>室温下过夜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 使用荧光显微镜进行数据采集与分析
<ol>
	<li>通过加载自动数据采集脚本 JoVE_AxioVision_Script.ziscript，准备显微镜以进行数据采集。
	<ol>
		<li>将载物台加热器设定为 48 °C，并在加热器上预热反应芯片约 20 分钟。设定温度为 48 °C 时，反应孔内的温度可维持在 39 °C（数据未显示）。</li>
		<li>使用10倍、0.45数值孔径的物镜，安装GFP滤光片后，对准反应孔内侧边缘的顶部进行聚焦。丙烯酸材料经激光切割后边缘具有自发荧光，可被清晰观察到。聚焦完成后，在所有数据采集结束前不得调整显微镜载物台的高度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在指定的预扩增工作区中，按照步骤 4.5.1 所述方法配制 qRPA 预混液。针对每个样本，在微量离心管中混合酶粒、预混液和 HIV-1 DNA 模板。向第一个反应体系中加入 2.5 µl 醋酸镁，并短暂涡旋。</li>
	<li>将含有qRPA样品的微量离心管迅速转移至荧光显微镜。
	<ol>
		<li>小心地将30 µl RPA反应液移入反应孔中，避免产生气泡。在RPA反应液上覆盖一滴PCR级矿物油，以防止蒸发。</li>
		<li>将孔板置于显微镜物镜正下方，注意仅对孔的中心区域成像，避免包含任何自荧光的丙烯酸边缘。孔板定位后，运行自动化脚本7。该脚本每隔20秒使用FAM滤光片组生成一张JPEG图像，同时使用HEX滤光 片组生成另一张JPEG图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脚本完成后，在运行其他样本之前，将这些图像从临时存储文件夹中转移出去。
	<ol>
		<li>创建两个文件夹：每个荧光染料各一个即， ‘HEX’ 和 ‘FAM’）。将这两个文件夹存储在同一父文件夹中。在每个荧光染料文件夹中，创建一个以样品中DNA拷贝数命名的文件夹例如， 0, 10, 等等。).</li>
		<li>将所有以“HEX”为前缀的文件转移至“HEX”文件夹中对应的子文件夹内。将所有以“GFP”为前缀的文件转移至“FAM”文件夹中对应的子文件夹内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 8.2–8.4，进行含 0、10、10 的 qRPA 反应2, 103, 104，和105 HIV-1 DNA 拷贝数</li>
	<li>在完成实验中所有qRPA样本的数据采集后，加载脚本“JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”。当脚本提示时，选择包含两个荧光染料文件夹的父文件夹，这两个荧光染料文件夹下又分别包含各浓度样本图像的子文件夹。 
	注意：脚本将在父目录中自动生成一个电子表格文件，其中HEX荧光数据将保存在名为“HEX”的工作表中，FAM荧光数据将保存在名为“FAM”的工作表中。在每个工作表中，循环次数列于B列，随着模板浓度递增的实时荧光数据分别列于C、D列 等等每个实时荧光数据点均为在对应时间点采集的图像的平均荧光强度。</li>
	<li>使用电子表格程序中的默认散点图功能，绘制“HEX”和“FAM”工作表中 B2:H61 单元格的数据，以可视化实时荧光信号，并生成类似于以下所示的图表 图2A、2B、3A 和 3B. 
	注意：步骤 8.6 中生成的电子表格也可用于脚本“JoVE_qRPA_standard_curve.m”和“JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

为了使用 MATLAB 算法获得有意义的定量数据，用户必须在程序提示时选择合适的输入值。在启动第 5 和第 6 节中的每个脚本后，所有输入变量将自动在命令窗口中被请求，输出结果也将自动生成。在第 5.7 节中，用户会被提示选择一个斜率阈值。该斜率阈值的取值会影响拟合结果的相关系数平方（r2）。当使用从热循环仪导出的原始荧光数据时，取值在 2.0 到 5.0 之间通常可获得较高的 r2 系数。在第 5.8 节中，用户必须指定高于背景信号的阳性阈值所对应的标准差倍数。为了判断样本为阳性或阴性，脚本会自动利用热循环仪导出的原始荧光数据，计算每个样本的最大与最小荧光值之间的差值 Δsample。随后，脚本计算所有无靶标对照样本的平均差值 Δbackground 及其标准差 σbackground。若 Δsample 超过 Δbackground 加上 z × σbackground，则该样本被判定为阳性。在第 5.10 节中，用户需决定使用默认阈值还是设定新的阈值。若用户...

定量核酸扩增技术在环境、食源性和水源性病原体检测以及临床诊断中具有重要意义。实时定量聚合酶链式反应（qPCR）是实现核酸高灵敏度、高特异性和定量检测的金标准方法。 例如， 用于HIV-1病毒载量检测、细菌病原体检测以及多种其他生物体的筛查1–3在实时定量PCR过程中，引物在循环中扩增病原体DNA，同时产生与每轮循环中样本扩增DNA量成正比的荧光信号。可通过标准曲线对含有未知浓度病原体DNA的样本进行定量，该曲线反映了标准样本的初始DNA浓度与荧光信号达到特定阈值所需循环数之间的关系即， 循环阈值，或 CT).
由于实时定量PCR需要昂贵的热循环设备，且获得结果需数小时，因此已开发出替代性的等温扩增技术，例如重组酶聚合酶扩增（RPA）4。这类平台通常可在更短时间内提供结果，并在较低且恒定的温度下扩增核酸，因而可使用成本更低、结构更简单的设备完成。RPA特别适用于即时检测（point-of-care）应用，可在几分钟内扩增DNA，所需扩增温度低（37 °C），并在存在杂质的情况下仍保持活性5,6。RPA检测已广泛应用于多种领域，包括食品分析、病原体检测、抗癌药物筛选以及生物威胁因子的检测7–12。然而，RPA在核酸定量方面的应用仍较为有限13,14。
在先前的研究中，已证明实时定量RPA（qRPA）是可行的15。本文提供了更为详细的实验方案，介绍如何利用标准曲线通过实时定量RPA对未知样本进行定量，该方法类似于使用qPCR进行定量。本方案描述了如何在热循环仪上进行RPA反应以检测HIV-1 DNA作为概念验证，以及如何构建内参阳性对照（IPC）以确保系统正常运行。同时详细说明了使用热循环仪或显微镜采集数据，并利用训练数据进行标准曲线构建的数据分析过程。最后，展示了如何通过自定义脚本结合标准曲线对未知样本进行定量。该qRPA技术能够实现对未知浓度样本的定量，相较于传统的实时qPCR具有多项优势。

<table><tbody><tr><td>qRPA 检测</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 正向引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制DNA寡核苷酸</td><td>5&amp;rsquo;-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 逆转录引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制DNA寡核苷酸</td><td>5&amp;rsquo;-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 探针</td><td>BioSearch Technologies&amp;nbsp;</td><td>定制DNA寡核苷酸</td><td>5&amp;rsquo;- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IPC探针</td><td>BioSearch Technologies&amp;nbsp;</td><td>定制DNA寡核苷酸</td><td>5&amp;rsquo;-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>RPA exo 试剂（小球，重悬缓冲液，乙酸镁）</td><td>TwistDx</td><td>TwistAmp exo</td><td></td></tr><tr><td>PCR管条</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>PCR 平盖管条</td><td>BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>微密封胶</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>558/MJ&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 靶标 (pHIV-IRES-eYFP)&amp;Delta;Env&amp;Delta;Vif&amp;Delta;Vpr</td><td></td><td></td><td>定制质粒，参见：Segall, H. I., Yoo, E. &amp;& 萨顿，R. E. 改变宿主范围的人工复制型慢病毒的表征与检测。《分子治疗》8，118&amp;ndash;129，doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003)。</td></tr><tr><td>人类男性基因组DNA</td><td>应用生物系统公司</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>96孔冷块</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris 缓冲液，pH 8.0</td><td>EMD Millipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M，pH 8.0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>IPC 开发</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微小隐孢子虫 IPC 模板</td><td>水传播公司</td><td>P102C</td><td>如果使用者不具备处理隐孢子虫（C. parvum，一种生物安全二级病原体）的条件，可从IDT订购双链合成靶标。用于隐孢子虫的PCR和RPA引物设计基于GenBank登录号AF115377.1。</td></tr><tr><td>PCR长正向引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制DNA寡核苷酸</td><td>5&amp;rsquo;-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR长反向引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制DNA寡核苷酸</td><td>5&amp;rsquo;- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X 缓冲液</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>显微镜实验</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>直立式荧光显微镜</td><td>蔡司</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>载物台加热器</td><td>生物科学工具</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>1-通道高精度高稳定性温度控制器</td><td>生物科学工具</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>FAM/GFP滤光片组</td><td>蔡司</td><td>滤光片组 38 (000000-1031-346)</td><td>激发带通 470/40 nm，发射带通 520/50 nm</td></tr><tr><td>HEX滤光片组</td><td>色度</td><td>49014</td><td>激发带通 530/30 nm，发射带通 575/40 nm</td></tr><tr><td>激光切割机</td><td>雕刻师网络</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8&quot; 黑色亚克力</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 毫米透明亚克力</td><td>McMaster Carr</td><td>PD-72268940&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>办公用品仓库</td><td>Duro 超强胶水&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PCR级矿物油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>数据分析</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>微软</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 脚本： &quot;JoVE_qRPA_标准曲线.m&amp;rdquo;</td><td>包含在补充信息中</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 脚本： &quot;JoVE_qRPA验证与定量.m&amp;rdquo;</td><td>包含在补充信息中</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 脚本： &quot;JoVE_real_time_intensity_to_excel.m&amp;rdquo;</td><td>包含在补充信息中</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>包含在补充信息中</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>包含在补充信息中</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioVision 软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>包含在补充信息中</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

建立一种带有内参阳性对照的定量重组酶聚合酶扩增检测方法

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

最近的研究表明，用于病原体检测的等温扩增技术——重组酶聚合酶扩增（RPA），可通过标准曲线对DNA样本浓度进行定量。本文提供了一套详细的实时定量重组酶聚合酶扩增检测（qRPA检测）的建立与实施操作流程。以HIV-1 DNA定量为例，文中描述了实时RPA反应体系的构建、内参阳性对照（IPC）序列的设计，以及目标物与IPC的共扩增方法。同时提供了利用多次实验数据构建标准曲线的操作说明及数据处理脚本，可用于预测未知样本的浓度或评估检测的性能。最后，介绍了一种替代方法：使用显微镜和载物台加热器实时采集荧光数据，作为迈向开发即时检测（point-of-care）qRPA检测的重要步骤。所提供的操作流程和脚本可用于针对任意目标DNA序列的qRPA检测方法的开发。

在选择用于靶标（HIV-1）DNA 的 qRPA 实验中的内源性阳性对照（IPC）序列之前，需先设计并筛选一系列 IPC 候选序列，评估其在无 HIV-1 DNA 存在时能否在 qRPA 反应中扩增。IPC 候选序列的长度需超过靶标（HIV-1）DNA，以防止 IPC 扩增产物的生成与 HIV-1 扩增产物竞争反应资源。如图 2A所示，通过凝胶电泳检测到 415 和 435 bp 条带，验证了两个C. parvum IPC 候选序列的成功构建。在 qRPA 反应中，较短的 IPC 候选序列扩增信号微弱（图 2B），而较长的候选序列在模板量为 104 和 105 拷贝时均能稳定扩增（图 2C）。因此，选择较长的候选序列作为 HIV-1 qRPA 实验的 IPC。
实时定量RPA可单独使用目标序列进行，也可同时使用目标序列和内参对照（IPC）进行。图3展示了一项在热循环仪上同时检测HIV-1...

本文提供了一种利用实时重组酶聚合酶扩增技术定量DNA样本初始浓度的实验方案，该方法可使用热循环仪或显微镜配合载物台加热器进行。同时介绍了内参阳性对照的构建方法。此外，提供了用于处理原始实时荧光数据的脚本。

最近已证明，重组酶聚合酶扩增（RPA）——一种用于病原体检测的等温扩增平台——可被用于……

以下实验的总体目标是利用定量重组酶聚合酶扩增技术来测定未知样本的DNA浓度。首先将目标DNA、内参阳性对照、DNA引物以及荧光标记的探针加入反应体系中。第二步，将反应体系放入实时PCR仪中，仪器通过加热激活酶活性，并实时监测探针的荧光信号，从而检测目标片段和对照扩增产物的生成情况。接下来，使用脚本分析荧光数据，以生成标准曲线并验证检测方法。结果表明，在基于用于定量HIV单靶标DNA的验证实验中，DNA样本的浓度可在正确浓度的1个数量级范围内被准确测定。该技术相较于实时定量PCR等现有方法的主要优势在于，RPA为等温扩增，因此无需使用昂贵的热循环仪。RPA 还具有扩增所需温度较低、耐受杂质样本、可在数分钟内将目标扩增至可检测水平，以及使用冻干酶从而便于在室温下运输和储存的优点。首先，使用 50% 漂白液溶液清洁所有实验台面和设备表面，以创建一个洁净的扩增前工作环境；从 -20 °C 冰箱中取出 280 毫摩尔的乙酸镁溶液、复溶缓冲液和反应冻干颗粒，在室温下解冻溶液。然后，通过将 383.5 µL 复溶缓冲液转移至新的微量离心管中，加入 41.6 µL 无核酸酶水至缓冲液中，并涡旋混匀；再将 35 µL 乙酸镁加入另一单独管中，完成主混合液的配制。将再水化缓冲液储存溶液中的乙酸镁放回冷冻室。然后从4摄氏度冰箱中取出引物和探针。将它们放置于预扩增工作区，并关闭灯光以尽量减少光照。向主混合液中加入各27.3微升的10微摩尔正向和反向引物。接下来，在主混合液中加入7.8微升的10微摩尔荧光素标记的HIV-1 DNA探针，并涡旋振荡该离心管。然后将引物和探针的储备液放回储存条件。根据文本方案中的说明，此处可加入内参阳性对照的储存试剂，以完成QRPA反应体系的配制。首先，将冻干的酶小球分别放入两个低缘八联PCR管条的各个管中，再用移液器向含有酶小球的管中加入37.5微升主混合液。用移液枪枪头轻轻搅动管内物质，以溶解沉淀，同时避免产生气泡。小心地将枪头从反应管中取出，防止液体体积损失，并确保每支试管之间更换新的移液枪枪头。将试管转移至预冷的96孔冰块中，至少静置五分钟，使预混液充分冷却。同时，将热循环仪软件加载程序，并按照文本方案中指示的板布局进行设置。接下来，裁剪两条透明塑料微孔密封胶带，使其宽度略宽于PCR管。同时准备两个平顶PCR管条形盖，按照文本方案中指示分装HIV-1质粒模板。然后向相应的PCR管中加入10 µL模板。再次用移液器吸头轻轻搅拌混合物。接着，向每个管盖中加入2.5 µL乙酸镁，然后轻轻将管盖盖在反应管上，使其未完全密封。通过管盖应能清晰看到乙酸镁。将 PCR 管条放入微量离心机中，离心 10 秒，使所有液体聚集于管底，并去除任何气泡。将乙酸镁溶液与主混合液混合即可启动 QRPA 反应。迅速将PCR管转移至冷块中以终止反应。接下来，缓慢打开管盖，防止污染反应体系，并使用透明微型密封膜密封各管。根据板布局中的位置，将PCR管转移至热循环仪中。关闭热循环仪的盖子，然后点击开始运行。运行结束后，务必为实验指定一个文件名。查看原始荧光数据，并将其导出至电子表格，这将生成一个名为“定量扩增结果”的文件。为建立标准曲线，首先下载标准曲线脚本，然后打开 MATLAB 或类似的数据分析程序。打开该脚本并点击运行以执行脚本。提示时输入要分析的数据文件数量。然后，在命令窗口中输入每个训练文件中的样本数量和每个样本的重复次数。输入用于构建标准曲线的最低 DNA 浓度（以 10 的幂次拷贝数表示），然后按回车键。在此示例中，最低浓度为 1 个以 10 为底的对数拷贝数。然后在命令提示符中输入每个DNA标准品之间的浓度差异，然后在此处按回车键。浓度间隔为基于10拷贝的对数级差。接下来，在命令窗口中输入斜率阈值，并按回车键。该值通常介于三到五之间。在“阳性阈值”（也称为 Z）中输入高于背景的倍数标准差数值，然后按回车键，典型的 Z 值范围为一到五。接下来，指定用于采集此数据的设备。输入热循环仪的型号，然后按回车键。如果有内参阳性对照，请根据是否需要设置新的阈值，输入 Y 或 N 来选择默认值或新阈值。最后，选择所有将用于构建标准曲线的电子表格文件。该脚本将自动导入并分析所有数据。对含有不同拷贝数HIV 1D NA的重复样本进行实时定量PCR扩增分析。可检测扩增的起始时间通过荧光信号的增加来指示，对于DNA拷贝数较高的样本，荧光信号的上升早于拷贝数较低的样本。利用原始荧光数据，通过已知浓度HIV 1D NA的扩增结果生成标准曲线。这些数据被拟合为指数曲线，R²值表明拟合度很高。标准曲线用于预测已知浓度的其他DNA样本的浓度。将Z值调整为1可准确预测低浓度DNA。相反，高浓度DNA在Z值为5时预测效果更佳。进行此操作时，需注意RPA缺乏真正的循环过程来限制DNA扩增速率，因此必须精确控制扩增速率。实验间的可重复性至关重要，因此务必在所有实验中使用相同的引物分装样品。避免反应组分接触热源和光照。在开始数据采集前立即加入乙酸镁，并在开始实验前将反应体系置于冷块中保存。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一个定量聚合酶重组酶扩增法的发展与内部阳性对照

本文描述了一种低成本、高通量的方法，可同时检测多达43个分子靶标。多重PCR/反向线性杂交（mPCR/RLB）的应用包括微生物分型以及从临床样本中检测多种病原体。...

多重PCR与反向线点杂交分析（mPCR/RLB）

该研究描述了一种经济有效的方法，利用qPCR对人类/猪/牛源DNA病毒（腺病毒和多瘤病毒）进行特异性定量，以确定水中粪便/尿液污染或硝酸盐污染的来源，上述病毒被提议作为微生物源追踪（MST）工具。...

一种利用特异性人源和动物源病毒进行微生物源追踪的经济高效方法

本文介绍了一种同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）的方法。TREC/KREC检测可作为胸腺和骨髓输出功能的标志物。...

通过实时PCR同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）

我们描述了一种具有简化（模拟）读出方式的终点数字检测方法，用于定量核酸。我们使用标准的qPCR仪对基于液滴的数字检测进行整体荧光测量，并通过显微镜确认结果。...

数字核酸定量检测的简易批量读取方法

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马疱疹病毒2型呼吸道样本诊断定量PCR方法的开发与验证

本文描述了一种用于肿瘤学样本靶向二代测序的集成系统。该跨平台系统针对质量差、数量少的肿瘤活检样本进行了优化，可兼容低量DNA输入，包含经过充分表征的多变异对照，并采用一种新型变异检出算法，该算法结合了定量的分析前质量控制指标。...

湿实验与干实验流程的整合优化了低质量与低数量肿瘤活检样本的靶向下一代测序

本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。...

双向逆转录病毒整合位点PCR方法及定量数据分析流程

环境DNA检测在开始野外数据采集之前，必须经过严格的设计、测试、优化和验证。本文提供了一套实验方案，指导用户完成针对目标物种DNA的特异性探针法qPCR检测与定量分析的每一步设计流程。...

环境DNA应用中物种特异性定量PCR检测方法的开发与验证

提供了详细的说明，用于构建一种开源的模块化荧光仪，该荧光仪可与多种低成本加热装置兼容，用于进行实时、定量的等温核酸扩增。...

开源微型荧光仪用于资源有限环境下实时监测等温核酸扩增反应

D-环捕获（DLC）和D-环延伸（DLE）实验利用邻近连接原理结合定量PCR，用于定量检测酿酒酵母（Saccharomyces...

同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

为了实现对Acinetobacter baumannii的快速且精准检测，我们提出了一种结合重组酶聚合酶扩增技术（RPA）与LbaCas12a内切酶的检测方案，用于鉴定A.

基于重组酶聚合酶扩增/Cas12a系统的Acinetobacter baumannii感染快速特异性检测

学习定量重组酶聚合酶扩增法用于DNA浓度定量分析，该方法包含内部阳性对照和实时荧光监测。此技术无需昂贵热循环仪，可在等温条件下快速完成DNA定量，适用于分子生物学研究。

建立一种带有内参阳性对照的定量重组酶聚合酶扩增检测方法

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