一个定量聚合酶重组酶扩增法的发展与内部阳性对照
March 30th, 2015
提供是一种开发实时重组酶聚合酶扩增测定的方案，以使用热循环仪或显微镜和载物台加热器定量 DNA 样品的初始浓度。还描述了内部阳性对照的开发。提供了用于处理原始实时荧光数据的脚本。
以下实验的总体目标是使用定量重组酶聚合酶简化来定量未知样品的 DNA 浓度。这是通过首先向反应中加入靶 DNA 内部阳性对照、DNA 引物和荧光标记探针来实现的。作为第二步，将反应置于实时 PCR 机器中，该机器加热反应以激活酶并监测探针的荧光以检测靶标和对照扩增子的产生。
接下来，使用脚本分析荧光数据以生成标准曲线并验证分析。结果表明，基于用于定量 HIV 单靶 DNA 的验证实验，DNA 样品可以在正确浓度的一个数量级内准确定量。与实时定量 PCR 等现有方法相比，该技术的主要优点是 RPA 是等温的，因此不需要昂贵的热循环仪。
RPA 还需要较低的温度扩增，对脏样品具有耐受性，可在几分钟内将靶标扩增至可检测水平，并利用 lly 酶在室温下轻松运输和储存。要开始使用 50% 漂白剂溶液清洁所有工作台和设备表面以创建干净的预扩增工作空间，请从零下 20 摄氏度的冰箱中取出 280 毫摩尔乙酸镁溶液、再水化缓冲液和反应沉淀，并在室温下解冻溶液。然后，将 383.5 μL 的再水化缓冲液转移到新的微量离心管中，将 41.6 μL 无核酸酶的水转移到缓冲液中，并涡旋以 35 μL 乙酸镁混合到单独的试管中，从而组装预混液。
将再水化缓冲液中的乙酸镁放回冰箱。然后从 4 摄氏度的冰箱中获取引物和问题。将它们放在预扩增工作区中并关灯，以尽量减少 10 微摩尔正向和反向引物中每种 27.3 微升的光照到预混液中。
接下来在 7.8 微升标记的 HIV 1D NA 的 10 微摩尔六角形中。探测预混液并涡旋试管。然后将引物和探针储备溶液放回储存试剂中，可以在此处添加内部阳性对照，如文本方案所示，以组装 QRPA 反应。首先，将冻干酶沉淀放入两个低位八孔 PCR 试管的单独试管中，将 37.5 微升预混液移液到含有沉淀的试管中。
用移液器吸头轻轻搅拌管中的内容物，以溶解沉淀而不产生气泡。小心地从反应中取出吸头，以防止体积损失，并确保在每个试管之间更换移液器吸头。将试管转移到冷藏的 96 孔冷模块中至少 5 分钟，以冷却预混液。
同时，使用协议加载 Thermal Cycler 软件，板布局在文本协议中指示。接下来，剪下两条透明塑料微密封粘合剂，使其比 PCR 管略宽。并获得两个扁平的 PCR 试管条盖，如文本方案所示，分装 HIV 一个质粒模板。
然后将 10 微升模板添加到适当的 PCR 管中。再次，用移液器吸头轻轻搅拌混合物。接下来，向每个管盖中加入 2.5 微升乙酸镁，然后轻轻地将瓶盖放在反应管的顶部，使其不完全密封。
醋酸镁应透过瓶盖清晰可见。将 PCR 联管放入微量离心机中，离心管 10 秒，以收集管底的所有液体并去除任何气泡。将乙酸镁溶液与预混液混合可引发 QRPA 反应。
快速将 PCR 管移至冷块以终止反应。接下来，慢慢取下盖子以防止污染反应，并用透明的 micros 密封膜密封试管。根据板布局中的位置将管子转移到热循环仪。
合上热循环仪的盖子，然后单击开始运行。确保在运行完成后为实验指定文件名。查看原始荧光数据并将其导出到电子表格中，该电子表格将创建一个名为 Quantification Amplification Results 的文件。
构建标准曲线。首先，下载标准曲线脚本，然后打开 MATLAB 或类似的数据分析程序。打开脚本并按 run 运行脚本。
出现提示时，键入要分析的数据文件数。接下来，键入每个训练文件中的样本数和仿行数。在命令窗口中。
输入用于构建标准曲线的最低 DNA 浓度（以基于对数的 10 个拷贝为单位），然后按 Enter 键。在示例中。最低浓度是基于 1 个对数的 10 个拷贝。
然后在命令提示符中输入每种 DNA 标准品之间的浓度差异，并在此处按 Enter。集中间隔是一个基于对数的 10 个副本。接下来，在命令窗口中输入坡度阈值，然后按 Enter 键。
此值通常介于 3 到 5 之间。在正阈值的背景上方键入数字标准差（也称为 Z），然后按 Enter typical Z values 范围从 1 到 5。接下来，指定在本例中用于收集数据的设备。
为 Thermal Cycler 键入一个，然后按 Enter。如果存在内部阳性对照，请根据是否需要新的阈值，通过键入 Y 或 N 来选择阈值的默认值或新值。最后，选择将用于构建标准曲线的所有电子表格文件。
然后，该脚本将自动导入和分析所有数据。对包含不同拷贝数的 HIV 1D NA 的重复样本进行实时 QRPA。DNA 拷贝数较高的样品比拷贝数较低的样品更早出现荧光增加所表明的可检测扩增开始。原始荧光数据用于从已知浓度的 HIV 1D NA 的扩增中生成标准曲线。这些数据拟合到指数曲线，R 平方值表示拟合优度高。
标准曲线用于预测已知浓度的其他 DNA 样品的浓度。将 Z 值调整为 1 可以准确预测低 DNA 浓度。相比之下，Z 值为 5 时，高 DNA 浓度的预测效果更好。
在尝试此程序时，重要的是要记住 RPA 缺乏限制 DNA 扩增速率的真实循环。因此，必须精确控制扩增速率。实验之间的一致性至关重要，因此请确保对所有实验使用相同的引物等分试样。
保护反应组分免受热和光的影响。在数据收集开始前立即添加乙酸镁，并将反应保持在冷模块中直到开始。实验。
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概览
本文介绍了一种用于定量样本中DNA浓度的实时重组酶聚合酶扩增检测协议。该方法利用热循环仪或带有舞台加热器的显微镜，并包括内部阳性控制的开发。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物技术
- 分子生物学
- 基因组学
背景
- DNA的定量分析在各种生物学研究领域至关重要。
- 传统方法如实时定量PCR需要昂贵的热循环仪。
- 重组酶聚合酶扩增（RPA）提供了一种等温替代方案。
- 内部阳性控制增强了定量检测的可靠性。
研究目的
- 开发使用RPA定量DNA浓度的协议。
- 创建内部阳性控制以改善检测验证。
- 提供分析实时荧光数据的脚本。
使用的方法
- 准备含有目标DNA、引物和荧光探针的反应混合物。
- 使用实时PCR机监测扩增过程中的荧光。
- 分析荧光数据以生成标准曲线。
- 通过定量HIV目标DNA的实验验证检测。
主要结果
- 该检测准确定量了一个数量级内的DNA浓度。
- 验证实验确认了内部阳性控制的有效性。
- RPA展示了相对于传统PCR方法的优势。
- 该协议对没有昂贵设备的研究人员来说是可行的。
结论
- 开发的RPA检测是一种可靠的DNA定量方法。
- 内部阳性控制对于检测验证至关重要。
- 这种方法可以促进更广泛的DNA定量技术访问。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative DNA measurement is a foundational capability in target validation and assay development, where accurate concentration data supports lead identification and predictive confidence. The described qRPA method provides an isothermal alternative to qPCR, reducing equipment dependency and enabling deployment in resource-variable settings. This positions the assay as a scalable tool for early discovery workflows requiring reliable nucleic acid quantification without thermal cycling infrastructure.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise DNA target quantification in complex samples.
- Operational Value: Supports functional target validation by delivering concentration data within one order of magnitude accuracy using internal positive controls.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by generating standard curves that allow cross-experiment comparison and assay performance assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements essential for dose-response modeling and compound screening readiness.
- Operational Value: Enables assay standardization through internal positive controls that monitor amplification efficiency and inhibition.
- Scalability: Compatible with microscope-based detection, supporting adaptation to point-of-care or decentralized testing formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage quantification to preclinical validation through reproducible standard curve generation.
- Biomarker Alignment: Supports monitoring of DNA-based biomarkers where concentration changes indicate target engagement or pathway modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative outputs that inform go/no-go decisions by defining detectable limits and dynamic range.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where quantitative nucleic acid data informs compound prioritization and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying DNA targets to assess pathway modulation or genetic perturbation effects.
- Screening: Delivers reproducible fluorescence-based readouts suitable for high-throughput adaptation when paired with automated liquid handling.
- Analytics: Generates standard curves and Z-score thresholds that allow teams to compare conditions and validate assay sensitivity.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by providing quantifiable DNA measurements that correlate with biological activity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable quantification platform applicable across DNA targets, reducing redevelopment effort for new assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability through internal positive control normalization.
- Operational Value: Enhances reproducibility via isothermal amplification and cold-block reaction setup, minimizing temperature-dependent artifacts.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating need for thermal cyclers, lowering barrier to entry for quantitative DNA analysis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through concentration data that supports accurate dosing and target exposure modeling.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in primer/probe design and fluorescence data interpretation.
- Needs access to fluorescence detection equipment such as a real-time PCR machine or microscope with stage heater.
- Demands standardization of reagent handling, including magnesium acetate addition timing and cold-block storage.
- Involves adaptation considerations for sample types, particularly regarding inhibitor tolerance and DNA purity.
- Includes practical limitations such as the one-order-of-magnitude quantification accuracy and absence of true amplification cycles requiring precise reaction timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
Assembling the Quantitative Recombinase Polymerase Amplification (qRPA) Reactions for a Standards Curve
5:16
Constructing a Standard Curve from Multiple Experiments with Custom Scripts
6:55
Results: Construction of an HIV-1 DNA Standard Curve by qRPA
7:53
Conclusion
