用于评估人工前交叉韧带移植物的无胸腺大鼠模型

摘要

动物模型是评估组织工程移植物的重要工具。本文介绍了制备用于前交叉韧带组织工程的静电纺可生物降解聚合物移植物的实验方案，以及在大鼠模型中进行移植手术的操作流程。

摘要

前交叉韧带（ACL）断裂是一种常见的韧带损伤，由于ACL在无干预情况下愈合能力差，常需手术治疗。目前的治疗策略包括使用自体移植物或同种异体移植物进行韧带重建，但两者均存在相应的局限性。因此，人们越来越关注设计一种可用于ACL重建的组织工程移植物。本文描述了一种用于ACL组织工程的静电纺丝聚合物移植物的制备方法。该聚己内酯移植物具有生物相容性、可生物降解性、多孔性，并由取向排列的纤维组成。由于评估此类移植物需要动物模型，本文介绍了一种用于ACL重建的关节内裸鼠模型，可用于评估组织工程移植物，包括接种异种细胞的移植物。文中展示了术后16周的代表性组织学和生物力学测试结果，以植入后立即检测的移植物和对侧天然ACL作为对照。本研究提供了一种可重复的动物模型，用于评估组织工程ACL移植物，并展示了再生医学方法在治疗ACL断裂中的潜力。

引言

前交叉韧带（ACL）断裂是膝关节最常见的韧带损伤之一¹。由于断裂的前交叉韧带无法在无手术干预的情况下自行愈合，患者在日常生活活动及体育运动方面的受限情况促使每年超过17.5万名患者接受手术治疗²，每年的医疗费用估计高达10亿美元³。目前，前交叉韧带重建手术通常采用自体肌腱或异体肌腱移植。尽管自体和异体移植均可取得较高的成功率，但这些重建方式均存在严重的并发症风险⁴。自体移植物存在供区并发症问题，且来源有限，尤其在再断裂或多韧带损伤的情况下更为明显。另一方面，异体移植物则与移植物整合延迟、不良炎症反应、理论上的感染风险以及供体组织来源有限等问题相关⁵。非降解性合成移植物于20世纪70年代和80年代被开发出来，但因早期移植物断裂、异物反应、骨溶解和滑膜炎等问题而受到限制⁶。由于上述严重问题，目前在美国尚无任何合成移植物可用于临床。

由于现有移植物选择存在上述局限性，以及生物学、工程学和再生医学领域的最新进展，人们对韧带组织工程解决方案在前交叉韧带（ACL）移植中的应用产生了极大兴趣。目前的组织工程技术采用可降解的生物材料和合成材料，以促进宿主组织长入，同时避免永久性合成材料植入所带来的局限性⁷。

聚己内酯（PCL）是一种可生物降解的聚合物，已获美国食品药品监督管理局（FDA....

方案

注意：所有动物手术在实验开始前均已获得当地兽医人员和动物使用委员会的批准。

1. 静电纺丝聚己内酯支架的制备

1. 称取医用级酯封端聚（ε-己内酯）颗粒，并溶于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中，配制质量分数为10%的PCL聚合物溶液。将溶液置于搅拌器上搅拌至少3小时，以确保形成均一溶液。
2. 使用电纺丝技术将PCL溶液制备成高度取向的PCL纤维套管，用于支架的构建。
   1. 在开启风机的化学通风橱中准备静电纺丝装置。该装置由一个大型丙烯酸盒构成，作为静电纺丝过程的隔离真空环境，盒体设有入口，用于引入由电压源驱动的PCL溶液、电机驱动的收集转轴以及真空接口。用乙醇彻底清洁丙烯酸盒，并用Parafilm膜覆盖所有表面，以去除可能影响静电纺丝产物质量的杂质。
   2. 将约3 ml上述溶液装入带有钝头18 G、1½英寸针头的10 ml注射器中。通过推动注射器排出所有气泡。将注射器固定在可编程注射泵中。将针头穿过亚克力箱上的小孔插入，针头末端约½英寸留在亚克力箱外，用于连接电压源导线。
   3. 使用30 mm的旋转车床芯轴作为高度取向PCL纤维的收集器；用一条薄铝箔紧密包裹芯轴。将芯轴固定在盒子另一侧距注射器针头约15 cm处的电机上。
   4. 将塑料软管插入真空接口，并连接至通风橱的真空源。打开真空源，用盖子盖住亚克力盒。
   5. 将可编程注射泵的输注速率设置为 2.5 ....

结果

根据单名外科医生完成的92例大鼠手术经验，从切开到伤口缝合完成的平均手术时间为16.9分钟，标准差为4.7分钟。处死时，大鼠体重为356 ± 23 g。所有大鼠均耐受手术良好，未出现任何并发症。术后即刻观察到大鼠可在手术侧肢体负重，但表现出轻微跛行。术后一周时，所有大鼠均已恢复正常行走，无明显跛行。在研究期间，所有动物体重稳步增加，摄食、排尿和排便习惯均未见异常。临床观察显示，术后未出现明显的伤口裂开、红斑、肿胀、积液或引流现象。

上述92例大鼠手术并非主要为本方法学论文的目的而进行，而是用于测试各种工程化移植物条件。尽管详细的力学测试和组织学结果不在本文讨论范围内，但更多细节可参见Leong et al.²⁶发表的论文。简而言之，在重建术后16周，对膝关节切片进行组织学分析显示，支架基质已大量被分泌嗜酸性胶原的成纤维细胞浸润，并与骨隧道实现了良好整合（图3）。此时，支架已完全被吸收，未观察到任何聚合物残留。此外，术后16周的CD68巨噬细胞标志物免疫组织化学染色显示炎症反应极轻微（图4

讨论

前交叉韧带损伤是骨科运动医学手术中常见的一种病症，目前可用于重建的治疗选择有限。为了开发一种合适的组织工程前交叉韧带替代物以促进韧带再生 体内，需要一个合适的动物模型。本研究描述了一种可生物降解的工程化移植物的制备方法及其 体内 使用无胸腺大鼠中可重复的前交叉韧带重建模型进行移植。该模型可用于评估由不同生物材料构成的组织工程前交叉韧带移植物，包括细胞移植物以及含有生长因子的移植物。

在本项研究中，我们测试了一种具有定向排列纤维的无细胞静电纺聚己内酯移植物。既往关于组织工程韧带重建的研究已植入过编织型或挤出型移植物，所用材料包括丝素蛋白、聚左旋乳酸（PLLA）和聚氨酯等多种物质。^27-29这些材料均未能同时实现移植物的成功整合以及前交叉韧带力学性能的再现⁷尽管许多聚合物具有用于韧带重建的潜力，但本研究选择了聚己内酯（PCL），因其具有生物惰性、无毒且降解缓慢的特性 体内，并可轻松制造成所需的构型³⁰PCL 还具有优异的机械强度，在机械应力下表现出很小的塑性变形

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
医用级酯端聚（ε-己内酯），颗粒状（分子量 = 110,000）	Lactel 可吸收聚合物		根据所需分子量定制合成的聚合物
1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇	Sigma-Aldrich	105228	PCL 聚合物的溶剂
18 G × 1½" 斜角针头	BD Medical	305196
远程灌注/抽取可编程注射泵	Harvard Apparatus	702101
VersaLaser VLS2.30 激光雕刻机	Microgeo USA	VLS2.30
扩展型等离子清洗机 115 V	Harrick Plasma	PDC-001	胶原蛋白包被前进行等离子刻蚀以实现表面改性
PureCol 胶原标准溶液，3 mg/ml	Advanced Biomatrix	5015-A	按 8:1:2.5 比例混合 PureCol、10× PBS 和 0.1 N NaOH，再以 1× PBS 稀释至 1:9
缝线，5-0 Vicryl	Henry Schein	1086471
缝线，4-0 Vicryl	Henry Schein	6540072
尖头解剖剪刀（直型；4.5 英寸）	Fisher Scientific	8940
盐酸布诺啡	Sigma-Aldrich	B9275	术中及术后镇痛使用剂量为 0.03 mg/kg
氨苄西林，注射用	Henry Schein	1185678	术中皮下注射 25 mg/kg
K 型钢针，1.6 mm	Spectrum Surgical	SI040062
Keith 针，直型 1½"	Delasco Dermatology Lab & Supply	KE-112
Immunocal 脱钙溶液	Fisher Scientific	NC9491030
Opticryl 丙烯酸树脂骨水泥（PMMA）（单体与聚合物）	US Dental Depot	OPTICRYL 100410
Instron Model 5564 万能材料试验机	Instron	5564	任何性能相当的拉伸测试装置均可使用