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方法文章

转染RAW264.7细胞以表达荧光素酶报告基因

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DOI：

10.3791/52807

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2015年6月18日

 ,  ,  , 
1Immunity and Infection Research Centre, Vancouver Costal Health Research Institute, 2Department of Surgery, University of British Columbia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

本文内容

摘要

由于巨噬细胞系RAW264.7对异源物质具有天然的防御反应，对其进行转染较为困难。本文介绍了一种温和但高效的将荧光素酶报告基因转染至RAW264.7细胞的方法。

摘要

将目标遗传物质转染入细胞是生物医学研究中不可避免的步骤。尽管已有多种转染方法被报道，但某些类型的细胞对其中许多方法具有抗性，导致转染效率低下1，可能阻碍对这些细胞类型的研究。在本实验方案中，我们介绍了一种优化的转染流程，用于将荧光素酶报告基因以质粒DNA的形式导入RAW264.7巨噬细胞系。本文描述了两种不同类型的转染试剂（基于脂质的和基于聚胺的），并在整个方案中提供了重要注意事项，以确保转染过程对RAW264.7细胞的干扰最小，所获得的实验数据能够真实反映实验处理的直接结果。尽管该方法的转染效率可能并不高于其他转染方法，但其稳定性足以在不改变细胞对刺激物生理反应的前提下，检测到RAW264.7细胞中的荧光素酶信号。

引言

将核酸转染入细胞在科学研究中具有广泛的应用。例如：（1）报告基因用于研究不同基因元件在基因表达中的作用；（2）蛋白表达质粒用于过表达目标蛋白；（3）小干扰RNA（siRNA）用于下调基因表达。通过调控特定基因的表达水平，并测量此类操作所产生的差异性效应，研究人员可推断出这些基因在选定生物系统中的功能。并非所有转染方法都能达到相同的转染效率，即使是同一种转染方法，对不同类型细胞的转染效果也不尽相同1。因此，已发展出多种转染技术，包括磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质转染法、阳离子非脂质聚合物转染法、电穿孔法以及核转染法2,3。

由于巨噬细胞是专业的吞噬细胞，对包括细菌来源（甲基化）DNA在内的外来物质极为敏感，因此向巨噬细胞转染尤为困难4。外源DNA的导入会激活Toll样受体9（TLR9）通路，导致细胞因子和一氧化氮的产生5,6。这些被激活的巨噬细胞可能因此对研究人员拟研究的处理措施反应性降低。

我们实验室常规使用萤光素酶报告基因转染RAW264.7巨噬细胞系，并已开发出一种可靠的转染方案，该方案不仅能使萤光素酶信号显著高于背景水平，同时足够温和以维持巨噬细胞处于静息状态。转染细胞的行为通过携带IκBζ启动子区域的萤火虫萤光素酶报告基因（pGL3-IκBζ）进行评估。IκBζ的表达可被细菌细胞壁组分脂多糖（LPS）上调7,8，并被抗炎细胞因子白细胞介素-10（IL-10）下调8。为校正不同孔间转染效率的差异，我们共转染一种含有海肾萤光素酶基因的对照质粒（例如，phRL-TK）用于标准化。本方案在优化过程中测试了多个参数，包括转染时间、转染试剂类型、转染试剂与质粒DNA的用量，以及转染试剂与质粒DNA的比例。本方案中包含的两种转染试剂分别为：（1）基于脂质的转染试剂；（2）基于蛋白质/聚胺的转染试剂。

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方案

1. 质粒DNA纯化

  1. 根据试剂盒生产商的说明书，使用质粒大提试剂盒提取质粒DNA。将质粒DNA重悬于500 µl TE缓冲液中。
  2. 进行苯酚:氯仿:异戊醇抽提及异丙醇沉淀，以去除残留的细菌污染物。LPS的存在会干扰转染9。
    1. 向质粒DNA中加入500 µl苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，pH 8），剧烈振荡15秒。苯酚可导致严重的皮肤灼伤，且具有麻醉性，因此在造成严重损伤前可能无明显痛感。苯酚:氯仿:异戊醇抽提操作必须在通风橱中进行，并格外小心。
  3. 室温孵育5分钟。在室温下以13,000 x g离心10分钟。将350 µl上层水相转移至新的1.5 ml收集管中。
  4. 向含有下层有机相的管中加入350 µl TE缓冲液，剧烈振荡15秒。在室温下以13,000 x g离心5分钟。将350 µl上层水相转移至同一1.5 ml收集管中。
  5. 加入70 µl 3 M乙酸钠（pH 5.2），充分混匀。加入700 µl 100%异丙醇，充分混匀后室温孵育10分钟。在4 °C下以13,000 x g离心10分钟。弃去上清液。
  6. 向沉淀中加入500 µl 75%乙醇，涡旋混匀后在4 °C下以5,000 x g离心5分钟。弃去上清液。DNA位于沉淀中。
  7. 打开管盖，于室温下空气干燥沉淀5–10分钟，直至沉淀变为半透明。加入500 µl TE缓冲液以重悬DNA沉淀。在50–60 °C加热10分钟以溶解DNA沉淀。
  8. 使用分光光度计测定260 nm（A260）和280 nm（A280）处的吸光度。 通过将A260值乘以50 ng/µl计算DNA浓度。通过计算A260/A280比值评估DNA纯度。高质量DNA的A260/A280比值应在1.8–2.0之间。

2. 细胞培养与接种

  1. 在37 °C、5% CO2培养箱中，使用添加9%胎牛血清的DMEM培养基（DMEM/9% FCS）培养RAW264.7细胞。每次传代时，使用巴斯德吸管通过反复吹打使细胞从培养皿上脱离。每2天传代一次，并将150万至200万个细胞接种至10 cm组织培养处理过的培养皿中作为储备细胞。每5至6周复苏一次新的细胞储备。
  2. 转染当天，在24孔板中每孔接种200,000个细胞，加入500 µl DMEM/9% FCS培养基。将细胞置于37 °C培养箱中孵育4小时。
  3. 使用基于脂质的转染试剂（步骤3.1）或基于蛋白质/多胺的转染试剂（步骤3.2）对细胞进行转染。

3. 转染

  1. 基于脂质的转染：
    1. 将转染试剂在避光条件下恢复至室温（RT）。将无血清培养基和 DMEM/9% FCS 预热至 37 °C。
    2. 在 1.5 ml 离心管中，加入 0.5 µg 质粒 DNA 至 50 µl 无血清培养基中。用移液枪将 2 µl 转染试剂加至液面以下，涡旋振荡 6 秒。
    3. 将试剂/DNA 混合物在避光条件下室温静置 30 分钟。
    4. 在 30 分钟孵育期间，吸除孔中培养基，并向每孔加入 250 µl 新鲜的 DMEM/9% FCS。
    5. 30 分钟后，向试剂/DNA 混合物中加入 250 µl DMEM/9% FCS，通过上下吹打充分混匀。
    6. 向每孔中加入 300 µl 稀释后的混合液，在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 2–4 小时。
    7. 移除转染溶液，每孔加入 500 µl DMEM/9% FCS。在细胞刺激前，于 37 °C、5% CO2 培养箱中继续孵育 24–48 小时。
  2. 基于蛋白/多胺的转染：
    1. 将无血清培养基和 DMEM/9% FCS 预热至 37 °C。
    2. 将 0.75 µl 转染试剂加入 18.75 µl 无血清培养基中，短暂涡旋混匀，室温孵育 5 分钟。将 0.5 µl 浓度为 1 µg/µl 的 DNA 加入稀释后的转染试剂中，室温孵育 10 分钟。
    3. 在 10 分钟孵育期间，吸除 24 孔板每孔中的培养基，并向每孔加入 250 µl 新鲜的 DMEM/9% FCS。
    4. 10 分钟后，向试剂/DNA 混合物中加入 250 µl DMEM/9% FCS。
    5. 向孔中加入 270 µl 稀释后的混合液，在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 2–4 小时。
    6. 移除转染溶液，每孔加入 500 µl DMEM/9% FCS。在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 24–48 小时。

4. 细胞刺激与荧光素酶检测

  1. 将孔中的培养基更换为 250 µl 新鲜的 DMEM/9% FCS。
  2. 向孔中加入 50 µl 所需浓度的 LPS 或 LPS+IL-10。将培养板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中，刺激 2–6 小时。
  3. 通过抽吸去除刺激液，用预冷的 PBS 洗涤，然后加入 200 µl 1x 被动裂解缓冲液。室温下摇动 30 分钟。刮取细胞并转移裂解液至 1.5 ml 离心管中，于 4 °C 下以 20,000 × g 离心 10 分钟以去除细胞碎片。
  4. 将 40 µl 澄清裂解液（上清液）转移至白色透明底 96 孔板中，按照试剂盒说明书检测荧光素酶信号。
  5. 使用化学发光仪在整个可见光光谱范围内读取荧光素酶信号。

5. 数据分析

  1. 通过将每个孔的萤光素酶（firefly luciferase）数值除以海肾荧光素酶（Renilla luciferase）数值，计算萤光素酶与海肾荧光素酶的比值（firefly:Renilla ratio）。
  2. 通过将处理孔的萤光素酶与海肾荧光素酶比值除以未处理孔的相应比值，计算倍数变化（fold change）。

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结果

图1比较了两种转染试剂在RAW264.7细胞中的转染效率。基于脂质的转染试剂通常可达到约25%的转染率，而基于蛋白质/多胺的转染试剂效率约为5%（图1A）。在转染了pGL3-IκBζ启动子报告基因的RAW264.7细胞中，也可观察到转染效率的差异，表现为荧光素酶信号的不同（图1B）。向这些转染细胞中添加LPS后，荧光素酶信号增强，直接表明IκBζ启动子报告基因的转录活性增加。换句话说，结果提示LPS可上调IκBζ基因的表达，这与先前的报道一致7,8。图2展示了我们实验中的典型结果，以基于脂质的转染为例。在分别获得荧光素酶和海肾荧光素酶的信号值（图2A和图2B）后，将荧光素酶信号归一化至海肾荧光素酶信号（图2C）。由于不同孔之间的转染效率存在差异，建议进行归一化处理。为了确定处理条件（LPS或LPS+IL-10）是否改变了报告基因信号，将处理组的荧光素酶与海肾荧光素酶的比值（...

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讨论

本文所述方案不仅关注转染效率，更旨在平衡转染效率与细胞生理状态的保持。具体而言，我们的操作成功降低了转染试剂的细胞毒性，同时实现了荧光素酶信号的最大化。

该方案中的一个关键步骤是细胞的状态。过度生长的细胞培养物不适合转染，因为其生理状态会发生改变，而长期连续培养 RAW264.7 细胞也可能改变细胞的表型和功能10。建议使用低传代次数的新鲜复苏细胞进行转染。

另一个重要的考虑因素是转染试剂的选择。基于脂质的转染试剂由于使用简便且商品化程度高，通常在研究中被广泛使用。然而，其中一些试剂会引起转染细胞中全局基因表达的非预期（通常是不希望的）改变11,12。为解决这一问题，可将细胞与转染试剂的孵育时间缩短至数小时，而非常规的过夜（O/N），或选择非脂质类转染试剂。延长转染试剂的孵育时间虽可提高转染效率，但也可能对细胞造成伤害，导致细胞死亡或细胞活化，从而干扰实验设计。图4A 和 图4B 显示，与未转染细胞相比，基于蛋白质/...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）拨款资助。STC 获得了加拿大卫生研究院和迈克尔·史密斯基金会的博士研究奖学金。EYS 获得了加拿大卫生研究院的奖学金。CIHR 器官移植培训项目还为 STC、EYS 和 SS 提供了研究生奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PureLink HiPure 质粒大提试剂盒Life TechnologiesK210007任何品牌的质粒大提试剂盒均可使用
苯酚:氯仿:异戊醇Life Technologies15593-049分子生物学级。苯酚具有毒性，操作时应尽可能在通风橱中进行。若容器中形成两层液体，使用下层透明的有机相。
DMEMThermo ScientificSH30243.01使用前在37 °C水浴中预热。
胎牛血清Thermo ScientificSH30396.03使用前在56 °C水浴中灭活45分钟。
Opti-MEMLife Technologies31985-070使用前至少升温至室温。
XtremeGene HP DNA转染试剂Roche6366236001使用前升温至室温。
GeneJuiceEMD Millipore70967使用前升温至室温。
5×被动裂解缓冲液PromegaE1941双荧光素酶报告基因检测系统中已包含30 ml
双荧光素酶报告基因检测系统PromegaE1910

参考文献

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