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方法文章

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

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DOI：

10.3791/52893

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2015年9月24日

 ,  , 
1Department of Oncology, Faculty of Dentistry and Medicine, University of Alberta

本文内容

摘要

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。

摘要

光学分辨率的局限性以及在透射电子显微镜中识别特定蛋白质群体的挑战，一直是细胞生物学领域的障碍。许多现象无法通过 体外 简化系统中的分析需要额外的结构信息 原位，尤其是在1 nm至0.1 µm范围内，以实现充分理解。本文结合电子能谱成像技术（一种透射电子显微镜技术，可同时绘制蛋白质和核酸的分布图）与表达标签miniSOG，用于研究DNA双链断裂修复焦点的结构与空间组织。

引言

尽管近年来光学显微镜技术取得了显著进展1，细胞生物学家仍然面临分辨率上的局限，这限制了对涉及大分子复合物协同相互作用的基本细胞过程中结构与功能关系的理解例如在染色质重塑、DNA修复、RNA转录和DNA复制等过程中，染色质结构的解析至关重要。尽管透射电子显微镜（TEM）能够提供所需的分辨率，但由于无法在标记特定蛋白质的同时确定所观察结构的生物化学组成，这些过程的结构解析一直面临挑战。由于细胞核内缺乏可用于区分核结构的内膜系统，核内结构的识别尤为困难。电子光谱成像（ESI）技术在一定程度上克服了这些局限，能够同时检测并区分基于DNA、RNA和蛋白质的核结构。2-5.

电子能谱成像：

为了在电子显微镜中以高灵敏度和高分辨率绘制元素分布图，可以使用成像谱仪，该谱仪能够选择因与样品中元素的内壳层电子相互作用而发生非弹性散射的电子6。由于样品中原子电离时会损失特定于元素的能量，因此可通过连接在电子显微镜上的谱仪将这些电子分离并成像。因此，对与样品相互作用后的电子能谱进行分析，可揭示样品元素组成的定性和定量信息7。当电子穿过样品时未损失能量，它们将出现在电子能量损失谱的“零损失峰”中。这些电子的丰度与样品的质量、密度和厚度相关，其组成包括那些在穿过样品过程中未与样品发生碰撞或未损失能量的电子。该信息可用于对样品中特定元素的原子数目进行绝对定量8。

由于生物样本主要由轻元素组成，对透射电子显微镜（TEM）入射电子束的散射能力较弱，因此必须使用重金属盐染色方法以在样本中产生对比度。大多数此类对比剂缺乏特异性，且在可能实现特异性的条件下也无法同时观察多种染色，这限制了传统电子显微镜在细胞核研究中的应用价值。能量选择成像（ESI）相较于传统透射电镜具有显著优势，尤其适用于细胞核结构的研究。可以利用DNA和RNA所含大分子复合物富含磷的特性，将核蛋白复合物与纯蛋白复合物区分开，并根据核酸密度的不同来分辨不同的核蛋白复合物。其余生物物质则可根据其氮元素的丰度进行成像。仅通过磷和氮这两种元素的分布图及其在不同亚细胞结构中相对丰度的分析，即可获得大量关于细胞核的信息。例如，在磷丰度分布图中可清晰识别染色质和核糖体；而核间质区域、核孔复合体以及核内小体则在氮分布图中易于辨认。

微型单线态氧发生系统（miniSOG）

尽管ESI是一种研究的有力技术 原位 染色质结构，因为它利用了磷和氮元素组成之间的特征比例，但元素组成通常不能用于区分不同的蛋白质复合物群体。用纳米级小金颗粒标记的抗体已被广泛用于定位单个分子的位置。由于金颗粒通常连接在二抗上，因此它会出现在由一抗识别的表位周围约20 nm的范围内。在包埋后样品中，抗体只能检测暴露在切片表面的表位。尽管可以证明某种抗原的存在并将其与细胞的特定解剖结构相关联，但所获得的信息并不完整，因为大多数表位被树脂遮蔽。包埋前技术采用与荧光显微镜类似的实验流程，可使抗体在整个样品深度范围内接触抗原，但为使抗体穿透细胞而必需的通透化步骤通常需要去除脂质膜，并会移除无法被醛类固定的组分。此外，用于超微结构保存的最佳醛类固定剂——戊二醛，通常会破坏表位，因此通常需使用多聚甲醛。然而，后者在蛋白质-蛋白质交联方面效果较差。用金纳米颗粒标记抗体的另一个缺点是，金是一种电子密度极高的材料，会产生强烈的对比度，可能掩盖样品中对比度较弱但具有重要意义的结构细节。

绿色荧光蛋白（GFP）作为一种可表达的蛋白标签的出现，彻底改变了荧光显微镜在细胞生物学问题研究中的应用。通过将一种小的荧光结构域标记到目标蛋白上，可实现对该蛋白分布的定位与追踪 体内 无需进行可能改变结构的透化处理。为了将利用蛋白质标签来绘制细胞内蛋白质分布的精巧原理应用于透射电子显微镜（TEM），需要一种能够在目标结构附近产生信号并在TEM中生成对比度的系统。聚合的二氨基联苯胺（diaminobenzidine）是一种常用于组织学中检测抗体结合的染色剂。这种染色剂通常通过与二抗偶联的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）沉积而成。尽管该反应能够产生可靠的结果，但HRP在细胞质中不具备催化活性。9HRP 的反应产物也可能从生成位点扩散，导致其分辨率低于纳米金法。10为了解决这些问题，开发了FlAsH/ReAsH系统11它由带有四半胱氨酸基序的重组融合蛋白组成。该基序可结合双砷荧光团。当被激发时，结合的FlAsH或ReAsH能够产生活性极高的单线态氧，从而将二氨基联苯胺（DAB）光转化为聚合物，该聚合物立即在标记蛋白所在位置沉淀。DAB聚合物可用四氧化锇染色，后者具有高电子密度，因此可用于在透射电子显微镜（TEM）下描绘重组融合蛋白的分布。

2011年，Shu 等10 介绍了miniSOG系统，该系统包含一个来源于黄素蛋白的106个氨基酸的小型融合标签 拟南芥 在448 nm蓝光激发下可发出荧光，并能产生大量单线态氧自由基。这些单线态氧自由基可用于光氧化二氨基联苯胺，使其在标记蛋白表面及附近形成聚合物，其标记精度显著高于免疫金标记抗体11尽管FlAsH/ReAsH系统需要引入荧光团 和 在进行光转化之前，将二氨基联苯胺引入细胞，miniSOG系统仅需二氨基联苯胺和光照，且其聚合二氨基联苯胺的效率约为传统方法的两倍。此处，miniSOG与ESI结合使用，以绘制DNA修复焦点的超微结构图谱。

DNA修复灶（DRF）

未修复的DNA双链断裂对细胞构成严重威胁，因为它们可能导致染色体易位和遗传信息丢失。这继而可引发细胞衰老、癌症以及细胞死亡。许多参与DNA双链断裂修复的蛋白质会聚集在围绕DNA双链断裂位点形成的焦点结构中12-14。尽管这些焦点结构的具体功能尚不明确，但它们代表了细胞核中存在DNA双链断裂的位点，也是DNA双链断裂修复的发生位置。

DNA修复灶（DRF）已通过荧光显微镜进行表征，可作为DNA损伤的生物标志物12,15。相较于双链断裂的尺寸，这些修复灶体积较大，过去被认为具有相对均一的结构，直到近期的超分辨率显微镜研究揭示了每个修复灶内部分子存在一定程度的亚区室化分布16。为了理解这些位点的组织方式，有必要对所有潜在的生物结构进行相互间的相对可视化。这一目标无法通过荧光显微镜实现，但可通过电子显微镜达成17,18。本文描述了一种将电子光谱成像与miniSOG方法相结合的技术，以展示该联合方法在探索DNA双链断裂修复超微结构方面的潜力。

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方案

1. 生成 miniSOG 细胞系

  1. 在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中，将U2OS（人骨肉瘤）细胞培养于含有2 ml 低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的35 mm培养皿中，该培养基添加有10%胎牛血清（FBS）。
  2. 当细胞融合度达到80%时，按照转染试剂生产商提供的方案，通过脂质体转染法将纯度合格（A269/280比值为1.8–2.0）的质粒构建体导入细胞，该质粒含有编码miniSOG和mCherry标记的修复蛋白的序列19。miniSOG表达质粒可从Tsien实验室订购： http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
  3. 转染后两天，通过荧光激活细胞分选法筛选表达带有miniSOG和mCherry标签的重组蛋白的细胞。选择荧光强度中等的细胞，以避免过度表达的细胞20。
  4. 将阳性细胞接种于10 cm培养皿中，使用10 ml DMEM培养基进行培养，该培养基补充有10% FBS和0.6 µg/ml 筛选剂G418（遗传霉素）。
  5. 当培养皿上出现可见克隆后，使用倒置荧光显微镜筛选mCherry阳性克隆，并用永久性记号笔在培养皿底部围绕其画圈。使用低倍率空气物镜（例如，10×），采用无菌操作技术，小心刮下克隆并缓慢吸入无菌的1,000 µl 移液器吸头中进行挑取。
  6. 扩增所选克隆，并使用步骤1.1中所述的生长培养基（添加10%二甲基亚砜）将部分细胞冻存。通过将细胞培养在无菌的18 × 18 mm2盖玻片上并暴露于2 Gy辐射，检测细胞中DRF（DNA修复灶）的形成情况。稳定表达miniSOG-mCherry标记修复蛋白的细胞经照射后，在荧光显微镜下使用mCherry成像滤光片组观察时，必须显示出双链断裂（DSB）典型的灶状荧光分布模式。

2. 细胞培养

  1. 在步骤1.1所述条件下培养稳定表达miniSOG和mCherry标记修复蛋白的U2OS细胞。将细胞接种于含2 ml培养基的35 mm玻璃底培养皿中，生长至80%汇合度 DMEM。确保将盖玻片粘附到塑料材料上的胶水以及所使用的塑料材料均耐水溶液、醇溶液，并耐受所用树脂！
  2. 实验前，先勾画出约1 mm的小区域2 使用无菌钻石笔在荧光显微镜下刮取表达异位蛋白的细胞区域，以标记目标区域。或者，使用带有预刻网格系统的玻璃底培养皿，其中盖玻片内嵌有网格系统。
    注意：如果使用高质量的相关显微技术结合ESI与荧光显微图像21，确保盖玻片的厚度与油浸物镜兼容，应选用厚度为1.5号（0.16–0.18 mm）的盖玻片。选择一个区域  靠近培养皿中心区域进行透射电子显微镜（TEM）观察，以避免树脂在边缘处发生聚合的问题（参见步骤4.10–4.13）。

3. DNA损伤诱导

  1. 使用伽马辐射照射细胞，或使用模拟辐射的药物，或通过共聚焦显微镜上的激光微照射诱导损伤（例如，如文献18,22或 23中所述）。
  2. 在本示例中，使用铯-137辐射源对细胞进行2 Gy和6 Gy的伽马辐射照射，或在用0.5 µg/ml Hoechst对细胞致敏20分钟后，利用共聚焦显微镜的405 nm固态激光器进行激光微照射。

4. 样品制备

  1. 在室温避光条件下，用 1 ml 含 4% 多聚甲醛的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液或 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）固定细胞 30 分钟。
    警告：多聚甲醛和二甲胂酸钠具有毒性！请佩戴手套，并妥善处理有毒物质。
  2. 用 4 ml 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）或磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤细胞两次。
  3. 为阻断未反应的醛基并抑制血红素基团产生的活性氧物种（可增加背景信号），将固定后的细胞置于 2 ml 含 50 mM 甘氨酸、5 mM 氨基三唑和 10 mM 氰化钾的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液或 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中处理 30 分钟（请检查 pH！）。
    警告：氰化钾剧毒！请佩戴手套，在通风橱内操作，并妥善处理有毒物质。该反应对 pH 高度敏感，因此必须确认 pH 准确无误。
  4. 若需进行相关显微成像，请在倒置荧光显微镜下以二维或三维方式记录第 2.2 步中选定的区域。
  5. 通过将一片 10 mg 盐酸二氨基联苯胺片剂放入 2 ml 微量离心管中，制备 1 mg/ml 盐酸二氨基联苯胺溶液。加入 980 µl 蒸馏 H2O 和 20 µl 浓盐酸（11.65 M），混匀至溶液呈浅棕色且半透明。将此溶液用 0.1 M 磷酸盐缓冲液或 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液稀释至终浓度为 1 mg/ml ，同时用氢氧化钠调节 pH 至 7.0–7.6 之间（推荐 pH 7.4）。
    警告：二氨基联苯胺具有毒性！请佩戴手套，并妥善处理有毒物质。
  6. 进行光氧化时，将缓冲液替换为 2 ml 含 1 mg/ml 盐酸二氨基联苯胺的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。避光保存并将溶液置于冰上冷却至 4 oC，以提高氧气溶解度。通过向溶液中通入氧气（使用插入溶液并连接氧气瓶的软管）使溶液饱和。再次检查 pH，必要时进行调节。
    注意：光氧化反应的关键在于 pH 必须维持在 7.0 至 7.6 之间。
  7. 将固定后的细胞培养皿小心安装在配备 40 倍油浸物镜的倒置荧光显微镜上，并移动至目标区域。使用 GFP 或 CFP 滤光片组，以蓝光激发 miniSOG 标签。miniSOG 在 448 nm 处有激发峰，在 473 nm 处有肩峰10。
  8. 即使绿色的 miniSOG 荧光完全消失后，仍需继续照射，直至在透射光通道中观察到棕色的聚合二氨基联苯胺光氧化产物。当大多数细胞中均可观察到氧化产物时，关闭荧光照明以终止光氧化反应。
    注意：光氧化所需时间可达数分钟，具体时长取决于物镜、滤光片透射波长与效率以及照明光源。
  9. 用 1 ml 含 2% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）或磷酸盐缓冲液（pH 7.4）对细胞进行后固定 30 分钟。
  10. 用 0.1%–0.5% 四氧化锇在 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）或 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中固定细胞膜 20 分钟。
    注意：建议使用能稳定细胞膜所需的最低浓度四氧化锇。由于聚合的 DAB 沉淀物含有高密度氮元素，可直接通过 ESI 检测，因此无需强四氧化锇染色来识别 miniSOG 标记蛋白，过度染色反而可能对 ESI 产生不利影响。四氧化锇剧毒！请在通风橱内操作，并妥善处理有毒废弃物。
  11. 通过梯度乙醇（30%、50%、70%、90%、98%、100%）对细胞进行脱水（每步 5 分钟）。随后，将细胞置于 100% 乙醇与丙烯酸树脂（LR White）1:1 混合液中，将培养皿置于摇床上孵育 4 小时以促进树脂渗透，再于 100% 丙烯酸树脂（LR White）中继续孵育至少 4 小时。
  12. 为聚合树脂，用剃刀片切下标记好的 2 ml 微量离心管的管盖，并在管口涂覆丙烯酸树脂加速剂。确保加速剂仅覆盖管口边缘，不流入管内。随后，用巴氏吸管小心将 LR White 树脂注入管中约三分之二体积。注意避免树脂接触管口的加速剂！
  13. 移除培养皿中已渗透的树脂，将培养皿倒扣在直立的微量离心管上，使管的宽度几乎完全覆盖培养皿的玻璃观察窗区域。
  14. 等待 1 至 2 分钟 ，使加速剂密封管与盖玻片，然后翻转管体，使管内的树脂覆盖细胞。
  15. 将带有管的培养皿放入 60 °C 烤箱中，固化 12 小时。
  16. 树脂块固化后，从烤箱中取出附有树脂填充微量离心管的培养皿，并将微量离心管与培养皿分离。可通过液氮冷冻与热水解冻的冻融循环辅助分离。
  17. 弃去玻璃底培养皿，用剃刀片小心切开微量离心管以取出树脂块。
  18. 用永久性记号笔标记树脂块。
  19. 用剃刀片修整树脂块，仅保留含有先前用金刚石或钨笔标记区域（或含有目标细胞区域）的约 1 mm2 区域。
  20. 将树脂块安装至超薄切片机上，先用修块刀修整，再用金刚石刀切割约 50 nm 的超薄切片。
  21. 将切片捞取至高透射性 300 目载网上。此类载网栅条极细，可减少对目标区域细胞的遮挡。
  22. 使用碳镀膜仪在载网切片上镀约 0.2–0.4 nm 厚的碳层，以增强其在透射电子显微镜电子束下的稳定性。

5. 电子显微镜

  1. 将载网装入配备能量过滤器的透射电子显微镜（TEM）中。根据制造商的说明对显微镜和能量过滤器进行调校后，在低倍率模式（正常透射）下检查切片中的细胞，并在适当时与荧光数据进行比较（来自步骤4.4）。
  2. 一旦发现具有显著特征的细胞核（如DNA损伤轨迹或DNA修复焦点），切换至能量过滤模式并记录厚度图。
    注意：该过程包括记录零损失图像和未过滤图像。样品厚度不超过0.3个平均自由程（入射电子束中约30%的电子被样品散射）时，足以生成高质量的元素分布图。
  3. 使用控制显微镜能量过滤器的软件，记录磷和氮元素的比值图。磷元素图的后边缘图像在175 eV能量损失处采集，狭缝宽度为20 eV；前边缘图像在120 eV能量损失处采集，狭缝宽度同样为20 eV。氮元素图的后边缘图像在447 eV处采集，狭缝宽度为35 eV；前边缘图像在358 eV处采集，狭缝宽度也为35 eV。
    注意：由于成像元素（磷和氮）的含量相对较低（约1%），为获得更高的信噪比，应选择“比值图像”（定性元素图）而非“三窗口法”（定量元素图）来生成图像。

6. 图像处理

  1. 在能够处理所获取图像文件格式的图像处理软件中（例如，Digital Micrograph）打开元素比例分布图。将氮元素分布图复制到RGB图像的红色通道，将磷元素分布图复制到绿色通道，然后叠加并对齐这些图像。
  2. 将合成图像导出为TIFF（标签图像文件格式）文件，并在支持图层功能的图像处理软件中（例如，Photoshop）打开该图像。
  3. 通过将每个通道图像的最小值和最大值重新缩放至8位数据集（0到255），调整其动态范围。
  4. 使用“图层”窗口，从氮元素分布图中减去磷元素信号，以生成显示蛋白质分布的定性图谱。
  5. 将上一步生成的核酸（磷）和蛋白质（氮）分布图 转换为“索引颜色”模式，并在CMYK色彩空间中为显示核酸分布的图像创建黄色查找表，为非核蛋白分布图创建青色查找表。颜色选择旨在使两种元素分布图之间获得最大对比度。
  6. 创建新图像，并将显示磷和蛋白质分布的图像作为不同图层导入。使用“滤色”（screen）透明度模式，使两个图层叠加显示。
  7. 打开步骤5.2中获取的零损失图像。该图像代表所记录区域的图像，外观类似于常规透射电子显微镜（TEM）图像，但仅包含穿过样品而未与样品发生碰撞的电子信号。将此图像导出为TIFF格式。
  8. 在图像编辑软件中打开导出的零损失图像，并将其复制到显示元素分布图的图像的最上层图层中。使用“滤色”透明度模式对图像进行对齐。
  9. 可选地对零损失图像进行阈值分割，以分离来自miniSOG的信号。将处理后的图像作为单独图层按上述方法添加。

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结果

ESI

比较细胞核的ESI图像（图1）与传统的透射电镜图像（例如，图7-1），可以发现可清晰分辨的解剖结构显著增多。染色质脊呈黄色，小鼠细胞中的染色中心也较易识别。核仁因其圆形结构和不同颜色而易于与染色质区分，因为预先组装的核糖体除了富含磷的RNA外，还含有大量富含氮的蛋白质。周边染色质以薄层形式位于细胞核边缘，核孔则表现为富含氮的结构，中断了周边染色质的连续性。通常，核纤层可被观察为位于周边染色质外侧的一层极薄的蓝色区域。在细胞质中，可见许多富含磷的小颗粒，根据其大小、丰度及位于细胞核外的位置，可将其鉴定为核糖体。染色质之间的间隙表现为富含蛋白质的区域，即间染色质区，其中包含核体以及富含微小黄色信号的区域，如核糖核蛋白颗粒和核糖核蛋白颗粒簇（图2）。后者被称为间染色质颗粒簇，其特征是富集了前体mRNA剪接所需的蛋白质。图1B、C和D展示了其他已知结构的形态，如有...

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讨论

ESI 可作为研究细胞核内不同染色质状态和核糖核蛋白的优秀工具，因为它能够特异性地定位富含磷的区域。它显著提高了透射电子显微镜所能获得的细节量，并且不依赖于非特异性的染色方法。ESI 的一个缺点是在相同加速电压下需要比常规透射电子显微镜更薄的切片。这一问题可通过连续切片或采用断层成像方法加以克服28。

尽管通过观察磷和氮的分布可以获得大量信息，但能够同时绘制特定蛋白质的分布图也具有重要意义。本文介绍的方法表明，电喷雾电离（ESI）可与基于邻苯二胺位点特异性聚合的方法相结合。虽然该方法并未为ESI增加一种全新的颜色，但在绘制蛋白质分布图方面显然具有实用价值，尤其适用于与染色质相互作用的蛋白质。如果研究需要同时可视化多种蛋白质群体，仍可采用免疫胶体金标记方法，但需在光氧化反应之前进行预包埋染色9。与稳定细胞系相比，瞬时转染的缺点在于不同细胞间的表达水平可能存在显著差异，从而难以找到多个表达标签蛋白量相近的细胞。因此，建议构建稳定细胞系。然而，在瞬时转染后，仍可通过荧光成像评估蛋白表达的相对水平，并筛选出中等表达水平的细胞进行后续分析。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Roger Tsien 博士为我们提供 miniSOG 载体。感谢 Xuejun Sun 博士在透射电子显微镜（TEM）方面的协助。感谢 Cross 癌症研究所的 Lisa Lem 和 Peter Shipple 提供氧气。Hilmar Strickfaden 获得阿尔伯塔癌症基金会的博士后奖学金，并得到巴伐利亚研究联盟的支持。本研究获得了加拿大卫生研究院和阿尔伯塔癌症基金会资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm 玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-14-C
带网格的 35 mm 玻璃底培养皿MatTekP35G-2-14-CGRD 不适用于浸没式物镜
LR White：丙烯酸树脂emsdiasum14381
LR White 加速剂emsdiasum14385
3,3′-四盐酸联苯胺二胺 10 mg 片剂SigmaD5905
细条纹格栅 300 目SPI1161123
钨尖实验室标记笔emsdiasum41148
四氧化锇emsdiasum19100
碳镀膜仪 208 碳Cressington
超薄切片机 Leica EM UC6Leica
Photoshop CS5Adobe甚至可兼容更早版本
Digital Micrograph V.2.30Gatan甚至可兼容更早版本
Hoechst 33342SigmaH-1399
EffecteneQuiagen
MiniSOG 载体Tsien-Labtsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
铯-137 辐射源 "MARK 1" (J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi开源软件http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf 管Fisherbrand05-408-146
金刚石刀片 超薄 35°Diatome
修块刀片 ultratrimDiatome
二甲胂酸钠三水合物emsdiasum12300注意：有毒！
戊二醛 EM 级 8%emsdiasum16020注意：有毒！
磷酸氢二钠emsdiasum21180
磷酸二氢钠emsdiasum21190
多聚甲醛emsdiasum19202
四氧化锇 4% 溶液emsdiasum19150
倒置荧光显微镜 Axiovert 200MZeiss
盐酸FisherbrandA142-212
氢氧化钠溶液 10 MFluka72068
氧气Medigas
3-氨基-1,2,4-三氮唑SigmaA8056
氰化钾Sigma207810注意：有毒！
乙醇emsdiasum15058注意：有毒！
单刃碳钢剃刀刀片emsdiasum71960注意：锋利！
DMEMSigmaD 5546
FBSLife Technologies16000-044
G418Life Technologies11811-023
DMSOSigmaD2650
透射电子显微镜 200 kVJEOL2100
GIF Tridiem 863 能量过滤器Gatan

参考文献

  1. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
  2. Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
  3. Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051(1999).
  4. Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
  5. Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
  6. Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
  7. Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
  8. Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
  9. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
  10. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041(2011).
  11. Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
  12. Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
  13. Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
  14. Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
  15. Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
  16. Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
  17. Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
  18. Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
  19. Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
  20. Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
  21. Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
  22. Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
  23. Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
  24. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
  25. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135(2013).
  26. Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
  27. Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
  28. Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
  29. Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
  30. Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).

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