Visualisering af miniSOG Tagged DNA-reparation Proteiner i Kombination med Electron Spektroskopiske Imaging (ESI)

Summary

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Abstract

Grænserne for optisk opløsning og udfordringen med at identificere specifikke protein befolkninger i transmission elektronmikroskopi har været forhindringer i cellebiologi. Mange fænomener kan ikke forklares ved in vitro analyse forenklede systemer og har brug for yderligere strukturel information på stedet, især i området mellem 1 nm og 0,1 um, for at blive fuldt forstået. Her elektron spektroskopisk imaging, en transmissionselektronmikroskopi teknik, der tillader samtidig kortlægning af fordelingen af ​​proteiner og nukleinsyrer, og et udtryk tag, miniSOG, kombineres for at studere strukturen og organiseringen af ​​DNA dobbelt-strenget pause reparation foci.

Introduction

På trods af de betydelige fremskridt i lysmikroskopi i de seneste ^år 1, celle-biologer stadig lider et hul i opløsning. Dette begrænser forståelsen af struktur og funktion i de grundlæggende cellulære processer, der involverer den koordinerede samspil mellem makromolekylære komplekser (fx i kromatin remodeling, DNA-reparation, transskription RNA og DNA-replikation). Selv om transmission elektronmikroskoper (TEM) s tilvejebringe den krævede opløsning, har det været en udfordring at definere disse processer strukturelt grund af manglende evne til at mærke specifikke proteiner samtidig være i stand til at bestemme den biokemiske sammensætning af det visualiserede strukturer. I mangel af interne membraner til at hjælpe differentiere nukleare strukturer, har kernen været særligt udfordrende. Electron spektroskopisk imaging (ESI) løser nogle af disse begrænsninger ved at tillade samtidig påvisning og differentiering af DNA, RNA og protEin-baserede nukleare strukturer ^2-5.

Electron spektroskopisk imaging:

For at kortlægge elementært distributioner ved høj følsomhed og opløsning i elektron mikroskop, kan man bruge en billeddannende spektrometer, der udvælger elektroner, der er blevet uelastisk spredt gennem interaktioner med indre skalelektroner af et element i prøven ^6. Fordi element-specifikke mængder af energi går tabt som følge af ionisering af atomer i prøven, kan disse elektroner adskilles og visualiseres under anvendelse af et spektrometer, der er knyttet til elektronmikroskop. Således analyse af spektret af de elektroner, der har interageret med modellen afslører kvalitative og kvantitative oplysninger om grundstofsammensætningen af prøven ^7. Elektroner, der ikke mister energi, når de passerer gennem prøven findes i "nul-tab peak" af elektronenergi tabspektrum. Forekomsten af ​​disse elektroner er relateret til massen, densitet og tykkelse af prøven og består af elektroner, der passerer gennem prøven uden at støde ind i prøven eller miste energi under passagen gennem prøven. Disse oplysninger kan være nyttige for absolut kvantificering af antallet af atomer af et specifikt element til stede i prøven ^8.

Da biologiske prøver består hovedsageligt af lette elementer, der dårligt afbøjer elektronerne i den indfaldende stråle af TEM, farvningsmetoder hjælp tungmetaller salte har skal anvendes for at skabe kontrast i prøven. Manglende specificitet af de fleste af disse kontrastmidler og den manglende evne til at visualisere mere end én plet, hvor specificitet er muligt har begrænset værdien af ​​konventionelle elektronmikroskopi i studiet af kernen. ESI har betydelige fordele i forhold til konventionelle TEM, især til undersøgelse af strukturer i cellekernen.Det er muligt at udnytte fosfor-rige natur DNA- og RNA-holdige makromolekylære komplekser at skelne nukleoprotein komplekser fra proteinkomplekser og løse forskellige nukleoprotein komplekser baseret på deres tæthed af nukleinsyrer. De resterende biologiske materiale kan afbildes baseret på dens overflod af nitrogen. Kortlægning netop disse to elementer og analyser af deres fordeling og relative forekomst inden for forskellige anatomiske strukturer giver os en masse oplysninger om kernen. For eksempel er det let at identificere kromatin og ribosomerne i kortet repræsenterer fosfor overflod. Den interchromatin plads, nukleare pore komplekser, og nukleare organer, på den anden side, kan let påvises i nitrogen kortbilledet.

Mini singlet oxygen generator-system (miniSOG)

Mens ESI er en kraftfuld teknik til at studere på stedet kromatin struktur, fordi det tagers fordel af de karakteristiske forhold i grundstofsammensætning mellem phosphor og nitrogen, grundstofsammensætningen kan normalt ikke anvendes til at skelne mellem forskellige populationer af protein-komplekser. Antistoffer mærket med små guldpartikler i nanometerområdet er ofte blevet anvendt til at kortlægge placeringen af ​​enkelte molekyler. Da guldpartikler normalt er knyttet til et sekundært antistof, vises den inden for en omkreds på ca. 20 nm omkring epitop detekteres af det primære antistof. I post-embedding prøver kan antistoffer kun afsløre epitoperne, der udsættes på overfladen af ​​sektionerne. Selv om det er muligt at bevise tilstedeværelsen af ​​et antigen og relatere den til en vis anatomisk struktur af cellen, de oplysninger, der opnås, er ufuldstændig, idet de fleste af epitoperne er tilsløret af harpiks. Pre-embedding teknikker, der bruger lignende protokoller til dem, der anvendes til fluorescens mikroskopi, give adgang til antigener i helehele dybden af ​​prøven, men de permeabilisering trin, der er nødvendige for at gøre det muligt for antistoffet at trænge ind i cellen kræver typisk fjernelse af lipidmembraner og fjerne komponenter, der ikke kan fastsættes af aldehyder. Desuden er den foretrukne aldehyd fiksativ for ultrastruktur præservering, glutaraldehyd, almindeligvis ødelægger epitoper og følgelig er paraformaldehyd typisk kræves. Dette er mindre effektive til protein-protein tværbinding. En anden ulempe ved antistoffer, der er mærket med en guld nanopartikel er, at guld er en meget elektron-tætte materiale, der skaber en stærk kontrast, der kan tilsløre interessante strukturelle detaljer af prøven, som har svagere kontrast.

Fremkomsten af ​​grønt fluorescerende protein (GFP) som et udtrykt protein tag har forvandlet anvendelse af fluorescensmikroskopi for at besvare spørgsmål i cellebiologi. Mærkning af et protein med en lille fluorescerende domæne tillader kortlægning af dens fordeling in vivo </em> uden behov for permeabilisering procedurer, der kan ændre strukturen. For at omsætte den elegante princippet om anvendelse af protein tags til at kortlægge proteindomæner distributioner i en celle til elektronmikroskopi blev nødvendigt med et system, der er i stand til at frembringe et signal tæt på strukturen af ​​interesse og generere kontrast i TEM. Polymeriseret diaminobenzidin er en plet, der ofte bruges i histologi at detektere antistofbinding. Denne plet er normalt deponeret under anvendelse af peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret til et sekundært antistof. Selvom reaktionen frembringer et pålideligt resultat, HRP ikke er katalytisk aktivt i cytosolen af celler ^9. Reaktionsprodukter af HRP kan også diffundere væk fra det sted, generation, så at deres opløsning er værre end nanogold metode ^10. For at omgå disse problemer blev Flash / ReAsH system udviklet ^11. Den består af rekombinante fusionsproteiner, som har en tetracysteine ​​motiv. Dette motiv tillader binding afen biarsenic fluorophor. Når den exciteres, den bundne flash eller ReAsH er i stand til at generere meget reaktive singlet oxygen og dermed photoconvert diaminobenzidin (DAB) i en polymer, der præcipiterer straks ved stedet for de mærkede proteiner. DAB polymer kan farves med osmiumtetroxid, som er elektron tæt og kan således anvendes til at kortlægge fordelingen af ​​det rekombinante fusionsprotein i TEM.

I 2011, Shu et al. ¹⁰ præsenterede miniSOG, som består af en lille 106 aminosyrer fusion tag afledt af en flavoprotein af Arabidopsis, der er fluorescerende og i stand til at skabe mange singlet oxygenradikaler når den exciteres med 448 nm blå lys. Disse singlet oxygenradikaler kan bruges til foto-oxidere diaminobenzidin til dannelse af polymerer på og nær overfladen af den kodede protein, hvilket er betydeligt tættere end immunoguld mærkede antistoffer ^11. Mens flashen / ReAsH system kræver at bringe fluorkrom og diaminobenzidin i cellerne inden man fotoomdannelse, det miniSOG systemet kræver kun diaminobenzidin og lys og derudover er omkring dobbelt så effektiv til polymerisering diaminobenzidin. Her er miniSOG anvendes i kombination med ESI med henblik på at kortlægge ultrastruktur DNA-reparation foci.

DNA-reparation foci (DRF)

Udbedrede DNA dobbelt strengebrud udgør en alvorlig trussel mod cellen, da de kan føre til translokationer og tab af genetisk information. Til gengæld kan det føre til ældning, cancer og celledød. Mange proteiner, som er involveret i DNA dobbeltstrengsbrud reparation ophobes i foci at samle omkring en DNA dobbeltstrengsbrud ^12-14. Selv om deres funktion ikke er kendt, de repræsenterer sitet i kernen, der indeholder DNA dobbeltstrengsbrud og er stedet for DNA dobbeltstrengsbrud reparation.

DNA-reparation focI (DRF) er blevet karakteriseret ved fluorescensmikroskopi og de ​​tjener som biomarkører for DNA-skader ^12,15. De er massiv i forhold til størrelsen af den dobbelt-strenget pause og blev anset for relativt homogene indtil de seneste mikroskopi studier super-opløsning afslørede visse tegn på sub-opdelingen af molekyler inden for hver fokus ^16. For at forstå, hvordan disse steder er organiseret, er det nødvendigt at visualisere alle de underliggende biologiske strukturer i forhold til hinanden. Dette kan ikke opnås ved fluorescens mikroskopi, men er muligt gennem elektronmikroskopi ^17,18. Her beskrives en fremgangsmåde, der kombinerer elektron spektroskopiske billeddannelse med miniSOG metode til at illustrere potentialet i denne kombinerede fremgangsmåde til at undersøge ultrastrukturen af ​​DNA dobbelt-strenget pause reparation.

Protocol

1. Generering af miniSOG Cell-linjer Grow U2OS (human osteosarkom) celler i en 35 mm skål indeholdende 2 ml lav glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), der er suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en befugtet inkubator med 5% CO2 atmosfære. Transficere cellerne, når de er 80% sammenflydende ved lipofektion med renset transfektion kvalitet (A269 / 280-forholdet 1,8-2,0) plasmidkonstruktioner indeholder sekvenser for miniSOG og mCherry mærkede reparatio…

Representative Results

ESI Sammenligning ESI billeder af kernen (figur 1) med de konventionelle TEM billeder (f.eks, figur 7-1) viser en dramatisk stigning i anatomiske strukturer, der let kan skelnes. Kromatin kamme vises i gult, og det er ganske nemt at identificere de chromocenters i muse celler. Nukleoler nemt kan skelnes fra kromatin af deres runde struktur og anden farve, idet den formonterede ribosomer indeholder allerede høje mæ…

Discussion

ESI kan tjene som et glimrende værktøj til at undersøge forskellige tilstande af kromatin og ribonucleoproteiner i kernen, fordi det er i stand til specifikt at kortlægge områder, der er rige på fosfor. Det dybt øger mængden af ​​detaljer, der kan opnås ved et elektronmikroskop og er ikke afhængig af uspecifikke kontrasterende metoder. En ulempe ved ESI er, at det kræver tyndere sektioner end konventionel TEM på samme accelerationsspænding. Dette kan overvindes ved at arbejde med serielle sektioner elle…

Materials

35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-2-14-CGRD	not made for immersion objectives
LR White: acryl resin	emsdiasum	14381
LR White accelerator	emsdiasum	14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets	Sigma	D5905
Slim Bar Grids 300 Mesh	SPI	1161123
Tungsten-Point Lab Pen	emsdiasum	41148
Osmium Tetroxide	emsdiasum	19100
Carbon Coater 208carbon	Cressington
Ultra microtome Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		might even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		might even work with older versions
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG-Constructs	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	open source		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubes	Fisherbrand	05-408-146
Diamond Knife ultra 35°	Diatome
Trimming Knife ultratrim	Diatome
Sodium cacodylate trihydrate	emsdiasum	12300	Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%	emsdiasum	16020	Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasic	emsdiasum	21180
Sodium phosphate monobasic	emsdiasum	21190
Paraformaldehyde	emsdiasum	19202
Osmium tetroxide 4% solution	emsdiasum	19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M	Zeiss
Hydrochloric Acid	Fisherbrand	A142-212
Sodium Hydroxide Solution 10M	Fluka	72068
Oxygen	Medigas
3-Amino-1,2,4-triazole	Sigma	A8056
Potassium cyanide	Sigma	207810	Caution Toxic!
Ethanol	emsdiasum	15058	Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steel	emsdiasum	71960	Caution Sharp!
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	lifetechnologies	16000-044
G418	lifetechnologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
Transmission Electron Microscope 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 Energy filter	Gatan