一种在Drosophila中诱导闭合性头部创伤性脑损伤的方法

摘要

本文介绍了一种在果蝇（Drosophila）中诱导闭合性头部创伤性脑损伤（TBI）的方法。该方法可利用果蝇丰富的实验工具和技术，为研究TBI病理过程中所涉及的细胞与分子机制提供途径。

摘要

每年，创伤性脑损伤（TBI）影响数百万人，导致身体、认知和行为功能障碍，并可致死。利用果蝇（Drosophila）开展的研究在理解神经系统过程方面取得了重要突破。因此，为了揭示人类TBI病理的细胞与分子基础，我们开发了高冲击创伤（HIT）装置，用于在果蝇中诱导闭合性头部TBI。经HIT装置处理的果蝇表现出与人类TBI一致的表型，例如短暂性功能丧失和进行性神经退行性变。HIT装置采用基于弹簧的机制，将果蝇弹射至离心管管壁，从而对果蝇脑组织造成机械性损伤。该装置成本低廉、易于制作，操作简便快速，且可产生可重复的结果。因此，HIT装置可与现有的果蝇实验工具和技术相结合，用于探讨TBI的基本科学问题，进而推动TBI诊断方法与治疗手段的开发。特别是，HIT装置可用于开展大规模遗传筛选，以解析TBI病理的遗传基础。

引言

创伤性脑损伤（TBI）是指由外部机械力导致的脑部损伤。最常见的TBI是由闭合性头部受力引起，例如钝力以及惯性加速和减速力，这些力量会导致脑组织撞击颅骨内壁。在美国，估计每年有5万人死于TBI，另有250万至650万人在遭受TBI后长期承受其后果，包括严重的身体、认知和行为障碍^1,2。TBI的后果不仅源于脑部的原发性机械性损伤，还涉及随着时间推移发生的继发性细胞和分子水平的脑损伤，以及其他组织的损伤^3-5。由于TBI是一种复杂的疾病过程，开发有效的诊断和治疗方法一直面临巨大挑战。原发性损伤的多样性、人体生理差异以及环境因素共同导致了继发性损伤和病理表现的高度异质性。影响这些变化的关键变量因素包括原发性损伤的严重程度、重复性原发性损伤之间的时间间隔，以及个体的年龄和基因型。深入理解每个变量因素如何影响TBI的后果，将有助于推动TBI诊断与治疗策略的发展^6,7。

本文介绍一种在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中诱导闭合性头部创伤性脑损伤（TBI）的方法，可用于阐明各种因素对TBI后果的影响。该方法基于最初的观察：用力将果蝇培养管侧面撞击手掌时，野生型果蝇会暂时丧失活动能力，这很可能是TBI所致。因此，我们设计了高冲击创伤（HIT）装置，以重现手部撞击所产生的加速度和减速度力。高速摄像显示，HIT装置的一次撞击会导致果蝇头部和身体多次撞击培养管壁⁸。在一定程度上，这些撞击均可能导致果蝇脑组织在头囊内发生反弹和形变，类似于人类在跌倒或车祸中发生的脑损伤⁹。相应地，经HIT装置处理的果蝇表现出与脑损伤一致的表型，包括暂时性失能、随后出现共济失调、运动能力逐渐恢复、头部基因表达改变以及脑内进行性神经退行性变¹⁰。因此，HIT装置使得研究人员能够利用果蝇研究领域已建立的大量实验工具和技术来开展TBI研究。

方案

1. HIT 设备的构建 

1. 使用两个夹子和四颗螺丝将弹簧固定在木板上（图1A）。夹子应相对于木板的宽度居中放置，并彼此紧贴，外侧夹子与木板边缘对齐。在安装夹子之前，需使用钳子将其弯曲，使其紧密贴合弹簧。
   注意：构建HIT装置所需材料的说明见表1。 弹簧被夹住的一端应距离木板边缘1/8英寸（3.2 mm），自由端应超出木板3/4英寸（19 mm）。调整弹簧位置，使其与木板的长度方向平行。
2. 将维可牢（Velcro）毛面粘胶带在弹簧的自由端缠绕一圈。维可牢的外边缘应与弹簧末端对齐。维可牢非常重要，因为它可通过形成紧密的压合连接来固定小瓶。此外，维可牢还允许快速连接和取下小瓶，从而可在短时间内处理多个小瓶。
3. 将冰桶盖倒置，居中紧贴在木板上。调整冰桶盖的凸起部分，使其长边与木板的宽度方向平行。注意，冰桶盖的凸起部分比木板高1/2英寸（13 mm ），因此当小瓶连接到弹簧上时，弹簧不会完全平贴在木板上。
4. 将整个装置推至墙壁等固定物体前，使冰桶盖被楔入木板与固定物体之间，确保装置不会移动。
5. 将纸质量角器用胶带固定在纸板果蝇小瓶托盘的底部，并将托盘竖立在木板长度方向的一侧，使得当弹簧向后拉至完全垂直位置时，量角器的90°刻度与弹簧对齐。

2. HIT 设备的操作

1. 放置1至60个CO₂-将麻醉后的果蝇放入一个空的试管中，并用一个贴合紧密的棉塞塞住试管口。
2. 将棉塞推入小瓶，使果蝇被限制在小瓶底部1英寸（2.5 cm）范围内 从底部开始。在离心管上标记1处的刻度线会有所帮助 英寸（2.5 厘米） 标记。请注意，将果蝇限制在离心管中较大或较小的区域可能会影响表型的严重程度。
3. 等待5分钟，让果蝇从CO₂麻醉中恢复活动能力₂请注意，目前尚不清楚5 min是否足以完全消除CO的影响₂.
4. 将弹簧末端插入小瓶，直至魔术贴内侧边缘与小瓶顶部齐平（图1B）。当弹簧平放时，1英寸（2.5厘米） 小瓶的底部应与冰桶盖的凸起区域重叠。小瓶可多次重复使用。
5. 坐姿时，用左手拇指和食指捏住小瓶的魔术贴区域。用右手将板子紧压在实验台面上。或者，也可使用C型夹将板子固定在实验台面上。
6. 将弹簧完全拉直至所需角度。释放弹簧。待弹簧完全静止。
7. 从弹簧中取出小瓶，让果蝇恢复 ≥5 分钟。对果蝇进行再次撞击，或将果蝇转移至含有果蝇食物的小瓶中。
   注意：可采用多种检测方法评估 HIT 装置击打后产生的表型效应。例如，可通过分析损伤后不同时间点果蝇的存活率来确定对寿命的影响，通过头部组织学分析来确定对脑形态的影响，通过 mRNA 水平的定量分析来确定对基因表达的影响¹⁰.
8. 通过使用未受到击打但接受相同处理的对照果蝇来确定该操作中非击打因素所造成的影响。由于试管撞击冰桶盖会产生巨大噪音，操作时应佩戴听力保护装置。

结果

我们希望了解果蝇在遭受原发性损伤后为何会很快死亡。为了量化死亡情况，我们测定了24小时死亡指数（MI₂₄），即在原发性损伤后24小时内死亡的果蝇所占的百分比。将经HIT装置击打后的果蝇置于含有果蝇食物的试管中，在25 °C下培养，并在24小时后统计死亡果蝇的数量。我们采用该方法鉴定影响MI₂₄的因素，发现MI₂₄不受每管果蝇数量（测试范围为10至60只）、重复击打之间的时间间隔（测试范围为1至60分钟）或果蝇性别的影响¹⁰。相反，我们发现原发性损伤发生时的果蝇年龄和基因型会影响MI₂₄。老年果蝇的MI₂₄高于年轻果蝇，不同基因型的果蝇其MI₂₄也存在显著差异。

在 图2，我们检测了原发性损伤的严重程度是否影响心肌梗死（MI）₂₄通过将弹簧偏转至不同角度来调节原发性损伤的严重程度。对于每个角度，使用0-7天或20-27天龄的小瓶 w^1118 ...

讨论

HIT装置方法与其他在果蝇中造成创伤性损伤的方法有所不同 因为它导致的是闭合性头部损伤，而非穿透性创伤性脑损伤¹¹此外，HIT装置方法在大量果蝇中诱导创伤性脑损伤（TBI）所需的时间、劳动和操作技巧较少，因此相较于其他方法更适用于大规模遗传筛选。最后，HIT装置造成的原发性损伤不仅局限于脑部，这一特点既是局限性也是优势。其局限性在于需要额外的研究来确定表型是源于脑部创伤还是其他身体部位的损伤；另一方面，多发性创伤（多个身体部位的创伤性损伤）常伴随TBI发生，并被认为可调节TBI表型，因此HIT装置方法可用于探究多发性创伤对TBI表型的贡献。果蝇TBI模型相较于啮齿类和非人灵长类TBI模型也具有优势¹⁰由于果蝇繁殖迅速（雌性每天产卵约100枚）且生命周期短（在25℃条件下从卵发育至成虫仅需10天），可对大量个体进行检测。 °C），并保存在小型小瓶中，以廉价培养基（约20¢/月/100只果蝇）。此外，由于成年果蝇寿命相对较短（25℃下为50–100天），创伤性脑损伤（TBI）的结局可在其整个生命周期内便捷地进行评估。 °C）。最后，经过一百多年对果蝇的深入研...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镀锌压缩弹簧	The Hillman  Group	540189	9 7/8 英寸（长度，2.2 厘米），15/16 英寸（外径，2.4 厘米），0.12 英寸（线径，0.3 厘米）
木板			9 英寸（长度，22.9 厘米），6.5 英寸（宽度，16.5 厘米），0.75 英寸（高度，1.9 厘米）
夹具	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 英寸（长度，7.9 厘米），0.68 英寸（宽度，1.7 厘米），1.11 英寸（高度，2.8 厘米），EMT 双孔连接件，点击类型选择 1 英寸（2.5 厘米）钢制EMT导管
自粘魔术贴环状半片			3 英寸（长度，7.6 厘米），（3/4 英寸宽度，1.9 厘米）
聚氨酯冰桶套	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 英寸（长度，23.2 厘米），9 1/8 英寸（宽度，23.2 厘米），1 1/4 英寸（高度，3.2 厘米）
塑料果蝇小瓶	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 英寸（高度，9.4 厘米），1 1/16 英寸（内径，2.7 厘米），1 1/8 英寸（外径，2.9 厘米）
大号棉球	Fisher Scientific	22-456-883
纸质量角器			10 英寸（直径，25.4 厘米）