的 离体 直立液滴培养是现有方法的一种替代方案 体外 和 体内 实验技术。该方案易于操作，所需试剂用量较少，同时能够操控并研究胎儿的血管形成、形态发生和器官发生。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
研究器官发生 在子宫内 由于胚胎在子宫内发育，难以接触到试剂，因此在有胎盘哺乳动物中进行该过程在技术上具有挑战性。一种新开发的 离体 直立液滴培养法为相关研究提供了一种颇具吸引力的替代方案 在子宫内。该 ex 体内 液滴培养可通过使用多种阻断剂和激活剂来研究并调控细胞间相互作用及多样化的信号通路；此外，还可研究各种药理学试剂对特定器官发育的影响，同时避免全身性药物递送带来的不良副作用 在子宫内与其他方法相比 体外 系统中，液滴培养不仅能够研究在哺乳动物细胞系中无法重现的三维形态发生和细胞间相互作用，而且所需试剂显著少于其他方法 离体 和 体外 方案。本文展示了正确的小鼠胎儿器官解剖与直立液滴培养技术，随后通过全器官免疫荧光染色以验证该方法的有效性。 离体 液滴培养法可形成与所观察到的器官结构相类似的组织架构 体内 并可用于研究因胚胎致死而难以开展的其他研究过程 体内 模型。作为模型应用系统，将使用一种小分子抑制剂来探究血管化在睾丸形态发生中的作用。 离体 液滴培养法可扩展应用于其他胎儿器官系统，例如肺脏及其他潜在器官，尽管每种器官均需经过深入研究以确定其特定的实验方案改良。该器官培养体系为胎儿器官的实验研究提供了灵活性，采用此技术所获得的结果将有助于研究人员深入理解胎儿发育过程。
引言
器官再生 体内 在人类中非常有限；因此，组织工程——即利用宿主捐献的单个细胞开发组织和器官——正成为一种具有吸引力的潜在器官替代疗法。然而，要使这种治疗策略取得成功，必须对器官形态发生过程中涉及的因素和细胞间相互作用进行深入研究并充分理解。由于传统方法无法研究特定器官的发育过程，研究人员已转向替代性的全胚胎或全器官培养技术。Kalaskar 等1 已表明 离体 全胚胎培养在58%的培养胚胎中可获得与之相当的结果 在子宫内 发育，表明 离体 培养方法是进行器官发生研究的可行替代方案。
一种个性化的器官培养系统，例如本研究中的系统 离体 液滴培养系统，可在排除全身性影响的情况下实现对整个器官的分析，同时通过添加药理学试剂或抗体，调控特定的信号通路或细胞间相互作用。传统上，胎儿器官发育的研究主要依赖于转基因和基因敲除小鼠技术，以及经母体给予的药理学试剂。然而，这些技术与处理方法存在一定的技术难题 体内；大多数担忧集中在药物对多个器官的同时影响，这通常会导致胚胎致死。通过药理学手段干预胎儿发育的研究还存在另一个问题，即药物对母体的作用可能间接影响胚胎发育。 在子宫内 (例如， 药物在到达胚胎前的母体代谢情况，以及这些试剂是否能够穿过胎盘屏障。
此处....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究中使用的所有小鼠均为购自查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）的CD-1品系小鼠。此前的培养实验也曾在其他品系（如C57BL/6J，数据未显示）上进行，但任何品系均可使用。妊娠成年雌鼠年龄约为2至3个月，在胚胎取出前通过吸入CO2实施安乐死，随后进行颈椎脱位和双侧开胸术。小鼠的饲养遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，实验方案经辛辛那提儿童医院医学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 仪器、培养基和培养皿的准备
- 配制70%乙醇溶液。将去离子水高压灭菌（用于制备加湿培养皿以及配制/稀释溶液）。用70%乙醇喷洒消毒解剖工具（镊子、剪刀和27 G针头注射器）。
- 配制含钙和镁的10X磷酸盐缓冲液（PBS）（80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na2HPO4、2.4 g KH2PO4、1 M CaCl2 6.75 ml 、1 M MgCl2 3.75 ml ）。溶于1 L无菌高压灭菌水中，搅拌至完全溶解，然后用滤纸过滤。使用时以水稀释10倍，得到1X PBS。
- 将胎牛血清（FBS）在55 °C加热灭活30分钟，并用0.22 µm注射器滤器过滤除菌。
- 配....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
离体液滴培养法可用于操作整个器官（如性腺），以研究细胞间的相互作用和动态过程。图1以逐步示意图展示了如何制备E11.5胚胎的性腺液滴培养。培养方案的初始步骤包括从母鼠体内取出含有胚胎的子宫（图1A和1B）。将子宫从母鼠体内取出后，切开子宫壁，将胚胎从卵黄囊中释放至PBS中，以便进一步解剖（图1C-E）。在去除内脏器官后，胚胎体壁后侧的泌尿生殖嵴清晰可见（图1F），并可将其分离出来（图1G）。随后将性腺-中肾复合体从泌尿生殖嵴上解剖分离（图1H），并置于含有小分子抑制剂的液滴培养体系中（图1I，左侧：“T”表示处理组）以及不含小分子抑制剂的液滴中（图1I，右侧：“C”表示对照组）。含有液滴的小培养皿被放入自制的加湿培养室中（图1J），于37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究展示了一种ex vivo器官整体液滴培养法，该方法在研究胎儿发育方面具有多种潜在应用。该技术适用于多种器官，使研究者能够探究那些由于胚胎难以接近或存在胚胎致死风险而难以通过in vivo方法研究的生物学问题。相比其他in vitro方法（如哺乳动物细胞系培养），该培养方法具有额外优势：可直接使用完整的器官，从而保留了in utero状态下存在的关键细胞间相互作用；同时培养体系体积极小（约30 μl），因而仅需极少量稀有或昂贵的药物试剂。
液滴培养方案的关键要点包括：a）器官的洁净解剖。洁净解剖有助于维持组织结构的完整性，并尽量减少暴露的切割面或受损表面，这些表面可能附着于培养皿表面，从而干扰培养过程；b）将器官正确地定向置于液滴中，以利于器官的生长和形态发生；c）制备适当大小的液滴，使液滴能够通过表面张力固定器官位置，同时又不会过快干燥；d）根据器官选择合适的液滴体积。液滴体积应根据器官大小通过实验经验确定，但30 μl通常可作为合理的起始体积；e）选择与所研究生物学问题相关的发育阶段；以及 f）维持无菌.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者的研究得到了以下资助：CancerFree KIDS 研究基金、美国出生缺陷基金会 Basil O’Connor 新兴学者奖（编号：#5-FY14-32）、辛辛那提儿童医院医疗中心（CCHMC）董事会基金奖、CCHMC 研究创新与试点基金奖，以及 CCHMC 发展基金。作者还感谢 Capel 实验室在本技术初始优化过程中提供的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 盖玻片：方形（22 mm × 22 mm，1.5号） | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen 极致耐磨指甲油，透明色 | Sally Hansen | ||
| 8联排0.2 ml PCR管 &和分离的扁平帽状结构 | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L 1000 μL，200 μL，20 μL，10 μL，2 μL | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 镊子 | FST | 91150-20 | |
| 精细剪刀 | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml 微量离心管 | 丹维尔 | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml 微量离心管 | 丹维尔 | C2176 | |
| 10 μl SHARP 精准屏障吸头 | 丹维尔 | P1096FR | |
| 20 μl SHARP 精准屏障吸头 | 丹维尔 | P1121 | |
| 200 μl SHARP 精准屏障吸头 | 丹维尔 | P1122 | |
| 1,000 μl SHARP 精准屏障吸头 | 丹维尔 | P1126 | |
| 1 ml 注射器配27号针头 | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml 注射器 | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES 注射器滤器 | VWR | 28145-501 | |
| 3 级定性滤纸 标准级，圆形，185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm 易握式细胞培养皿 | Falcon/Corning | 353801 | |
| 无菌培养皿（100 mm × 15 mm） | VWR | 25384-088 | |
| 中国台湾新不伦瑞克 Galaxy 14 S CO2 培养箱 | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| 生物安全柜 | Nuare | NU-425-400 | |
| 微型离心机 | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro 梯度PCR仪配备控制面板 | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 体视显微镜 | 尼康 | SMZ445 | |
| 配备 AlphaEase 软件的 MultiImage 光学成像柜 | Alpha Innotech Corporation | 已停止 | |
| 绝对纯度200 proof乙醇 | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| 磷酸钠（二碱式，分子量 142）Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| 磷酸二氢钾（一碱式，分子量 136）KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher | S671-3 | |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| 氯化镁（MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| 氯化钙（CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion 无核酸酶水 | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR 引物 | IDT | N/A | |
| 冰醋酸 | Fisher | A38-500 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% 溴化乙锭溶液 | Fisher | BP1302-10 | 有毒的 |
| 琼脂糖 | GeneMate | E-3120-500 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP混合物，100 mM溶液 | 赛默飞世尔科技 | R0182 | |
| DNA Choice Taq 聚合酶（含 10x 缓冲液） | 丹维尔 | CB-4050-3 | |
| 多聚甲醛 | Fisher | O4042-500 | 有毒的 |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| 盐酸（HCl） | Fisher | A144212 | |
| 牛血清白蛋白（BSA），粉末，第五组分，热激分离法 | Bioexpress | 0332-100g | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Life Technologies | 11965-092 | |
| 胎牛血清（FBS），三重100 nm过滤 | Fisher | 03-600-511 | 使用前加热灭活 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | Life Technologies | 15140-122 | 以1:100的比例使用 |
| 二甲基亚砜（DMSO），Hybri-max，经无菌过滤 | Sigma | D2650 | |
| VEGFR 酪氨酸激酶抑制剂 II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| 兔抗 Sox9 抗体 | Millipore | AB5535 | 使用稀释比例：1:4,000 |
| 大鼠抗小鼠 PECAM1（CD31）抗体 | BD Pharmingen | 553370 | 使用稀释比例：1:250 |
| 兔源Cleaved Caspase-3（Asp175）抗体 | 细胞信号传导 | 9661S | 使用稀释比例：1:250 |
| 大鼠 E-钙黏蛋白 / CDH1 抗体（ECCD-2） | Life Technologies | 13-1900 | 稀释使用比例：1:500 |
| Hoechst 3342，三盐酸盐，三水合物 | 英杰公司（分子探针） | H1399 | 使用浓度为 2 ug/ml |
| Cy3 AffiniPure 驴抗大鼠IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 712-165-153 | 使用稀释比例：1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure 驴抗大鼠IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 712-605-153 | 使用稀释比例：1:500 |
| 驴抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 555标记 | Life Technologies | A31572 | 稀释使用比例：1:500 |
| 驴抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记 | Life Technologies | A21206 | 使用稀释比例：1:500 |
| 驴抗大鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记 | Life Technologies | A21208 | 使用稀释比例：1:500 |
| 驴抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 647标记 | Life Technologies | A31573 | 使用稀释比例：1:500 |
参考文献
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. <....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
