用于培育初孵斑马鱼的完整且更新的“轮虫共培养法”

摘要

幼年斑马鱼适应于以浮游动物为食。在实验室中，可以利用这一自然特性，将初次摄食的鱼苗与活的海水轮虫在同一系统中共同培养。这种“多物种共养”策略可促进鱼苗的高生长率和高存活率，同时将人工投入和对幼鱼的干扰降至最低。

摘要

斑马鱼（Danio rerio）是多个科学领域中日益重要的模式生物。在实验室条件下养殖该物种时，最具挑战性的技术环节之一是将开始摄食的仔鱼高效培育至幼鱼阶段，同时实现较高的生长率和存活率。这一发育阶段的核心管理难题在于：如何在几乎持续不断地向鱼类提供高营养饵料的同时，不损害水质。由于斑马鱼仔鱼在自然环境中已适应于摄食水体中的小型动物浮游生物，因此活体饵料（如臂尾轮虫、Artemia 和 Paramecium）被广泛认为是首选饲料，至少在鱼类达到幼鱼阶段并能够有效摄食人工加工饲料之前均是如此。本实验方案描述了一种将新孵化的斑马鱼仔鱼与海水轮虫（Brachionus plicatilis）在同一系统中共同培养的方法。这种共培养模式为鱼类提供了“按需供应”的营养丰富的活饵来源，且不会产生足以限制其生长表现的化学废物。尤为重要的是，该系统充分利用了轮虫自身天然的高繁殖能力以及鱼类的摄食行为偏好，因而日常维护所需的人工投入较低。以下方案详细阐述了一种经过优化的、逐步操作的流程，其中包含轮虫的生产培养（可根据需求进行规模放大），用于斑马鱼仔鱼与轮虫的共培养体系，以促进外源性摄食开始后前5天内的最佳生长表现。

引言

斑马鱼（Danio rerio）是一种重要的模式生物，被广泛应用于越来越多的科学研究领域，包括但不限于发育遗传学、毒理学、行为学、水产养殖、再生生物学以及多种人类疾病的建模^1-5。尽管该物种在实验室中相对容易维持，但其养殖过程中仍存在诸多管理难题⁶。其中最突出的问题是幼体培育，尤其是在鱼苗首次开始摄食、且鳔已充气之后的阶段⁷。在正常且受控的条件下，这一发育事件通常发生在受精后约5天（dpf），随后的3至5天生长阶段尤为关键⁷。此阶段最主要的技术难点在于充分满足初孵幼鱼的营养需求——饲料必须大小适宜、易于消化、具有吸引力，并且几乎持续供应，同时又不能在养殖水体中产生过多废物。传统上，这一目标通常通过向养殖缸中的鱼体多次投喂少量饲料并结合常规换水来实现^8,9。尽管这些方法在一定程度上有效，但效率较低，需要大量人力投入，且生长率和存活率往往不稳定且有限¹⁰。

在自然环境中，斑马鱼幼鱼可能以水体中大量存在的小型浮游动物为食¹¹因此，幼体培养方案中需包含活体饵料，例如 草履虫，轮虫，和 卤虫 通常效率最高⁷2010年，Best及其同事证明，可以在静置的半咸水中饲养幼年斑马鱼，并在开始外源性摄食的前5天内同时提供海水轮虫。¹²该方法利用轮虫培养物天然的高生产力，提供充足且营养丰富的饵料，同时不会污染水体，因而能在投入较少人力的情况下，实现幼体的高生长率和高存活率。^12,13近年来，全球越来越多的实验室采用了该方案的各种改良版本，目前已有许多实验室以连续培养的方式培育轮虫，以支持育苗系统。¹⁴.

近年来，轮虫/斑马鱼多营养级共养体系及轮虫生产方法不断优化，日趋标准化并更易于规模化。本文提供了以下两部分内容的逐步操作指南：1）轮虫的持续稳定生产；2）建立轮虫/斑马鱼多营养级共养系统，以支持斑马鱼在开始外源摄食的前5天内实现良好生长。

方案

1. 轮虫培养

1. 使用100 L培养容器的培养系统基本组成
   1. 收集轮虫培养系统所需的所有组件。轮虫培养系统包括用于培养轮虫的培养容器（CV）；用于维持投喂量轮虫的类似容器（投喂培养容器，FCV）；用于储存藻类饲料混合物（AFM）的圆底孵化瓶（饲料储液罐，FR）；气源（AS），用于向CV、FCV和FR供气增氧；带计量定时器的蠕动泵（PMT），用于控制向CV和FCV输送藻类饲料；以及置于CV内部的绒毛颗粒过滤器（FPF）。
      注意：完整的耗材和组件清单见于 材料清单.
2. 配置
   1. 将CV和FCV置于支架或桌面上，以便通过排水接头将培养物轻松收集到收集容器中（图1使用柔性供气管将空气供应装置（AS）连接至每个培养容器中的刚性管。确保管子足够长，能够将空气输送到培养容器（CV）或浮动培养容器（FCV）的底部。
   2. 使用小容量气管将空气源（AS）连接至一段刚性管，该管延伸至含有AFM的饲养箱（FR）底部。在每根气管上安装一个阀门以调节气流。将饲养箱（FR）通过饲料输送管连接至投喂管理装置（PMT），并将输送管从PMT引出，穿过在CV/FCV侧壁上部钻出的孔洞。 图1.
3. 初创企业
   1. 用反渗透水（RO）将培养容器填充至可用体积的90%。若无反渗透水，可使用洁净的去氯市政用水；但应进行生物安全风险评估，以确保水源中不存在潜在的致病生物。注：此类分析可由任何具备资质的水质检测实验室完成。
   2. 向培养容器的水中加入水族盐，使盐度达到15 g/L。调节通入容器的气流，以维持 "微沸"，然后将称量好的盐缓慢加入培养容器中，直至通过曝气完全溶解。继续对水体进行曝气处理，持续时间为 >1 小时，以确保其充分氧合。
   3. 配制藻类饲料混合液。向3 L干净的、去氯的淡水（0 ppm）中加入100 g NaHCO₃。₃ 以及100 g氨中和剂（羟甲基磺酸钠）。该试剂还可有效中和自来水中残留的氯或消毒培养设备后残留的漂白剂中的氯。必须确保这些化合物完全溶解。然后加入1 L藻类浓缩液（生物量干重约15%）。将饲料混合物加入FR中，并于4 °C保存。
   4. 添加500万至1000万的起始培养物 褶皱臂尾轮虫 将轮虫加入含有充气的15 g/L盐度水的培养容器中。如果轮虫在运输或储存过程中被冷藏，应将其在30分钟或更长时间内逐步适应培养容器中的水温（25 - 27 °C）。
   5. 打开PMT，开始将藻类饲料泵入轮虫培养容器中。利用PMT的定时功能，设定藻类饲料混合物的输送速率，使每百万只轮虫每天输送约1.6 ml藻类饲料混合物。在24小时周期内，以相等时间间隔分多次少量投喂；投喂频率越高，效果越好。
   6. 通过手动开启光电倍增管（PMT）并持续设定时间来校准泵的输送速率（例如， 1 分钟）并在此期间将泵出的藻类收集到量筒或烧杯中。例如，如果 PMT 在 1 分钟内输送了 5 ml 藻液，则给药速率为 5 ml 藻液/分钟。
   7. 通过将轮虫数量（以百万计）乘以1.6 ml，计算所需的每日投喂量。例如，一个轮虫数量为1亿的轮虫培养体系，每天大约需要160 ml的饵料（100 × 1.6 ml）。
   8. 将 PMT 设置为在 24 小时内以固定时间间隔分次投加全天所需的总饲喂量。例如，全天总饲喂量为 160 ml 时，可使用 PMT 以每次 5 ml/min 的泵送速率运行 4 分钟，每 3 小时投加一次，每日共投加 8 次（5 ml/min × 4 min = 20 ml × 8 次 = 160 ml）。
   9. 让培养物生长至达到所需种群数量，通常需要 48 - 72 小时，然后进行收获。在启动培养 24 小时后，将牙线颗粒过滤器添加到培养容器中，并开始常规维护。
4. 维护
   注意：该培养体系需持续运行，且需要进行日常维护，理想情况下应每天在同一时间按以下顺序操作。
   1. 将清洁的无氯淡水注入FCV，至可用体积的90%，并加入10 g/L的水族盐。确保充分混匀，使所有盐完全溶解。调节通入容器的气流，以维持 "剧烈沸腾"使用折射仪测量盐度，确保盐度为10 g/L。必须达到此目标值，且不得超出。
   2. 在CV中取轮虫样品：确保培养物充分混匀，然后使用移液管或自动移液器从培养物的不同部位分别采集3份2–3 ml的样品。将这些样品合并至一个大小合适的试管或小瓶中例如， 10 ml。
   3. 将1-2 ml混合样品转移至培养皿中，以便在解剖显微镜下观察。检查培养物质量（轮虫的游动行为、是否存在脱落的卵、有无污染的原生动物）。
   4. 向剩余的混合样品中加入 100 µl 50% 碘-碘化钾溶液，使轮虫固定。加入碘-碘化钾溶液后数秒内，可观察到轮虫停止游动。此时可方便地对轮虫进行计数。
      注意：可使用乙醇、稀释漂白剂或醋替代卢戈氏碘液。醋（每10 ml加2滴）具有无毒、储存过程中不会像漂白剂和碘溶液那样失效、且不会引起轮虫收缩的优点，因此可清晰观察纤毛冠及轮虫的其他形态特征。 "足" 保持伸展状态，动物外观显得更加自然。
   5. 确保样品充分混匀（固定的轮虫会迅速沉降），然后迅速用塑料移液管吸取约 2 ml 的子样品，并将 1 ml 加入 Sedgewick-Rafter 计数板（20 × 50 个 1-mm 方格）中（图2）。使用解剖显微镜或复式显微镜，计数附着在这些轮虫上的完整轮虫个体及卵的总数 （图2）尽可能计数载玻片区域，直至计得约100个轮虫。计算每毫升样品中的轮虫数量，并将结果记录于电子表格或实验记录本中。
   6. 收获CV中约30%体积的轮虫：移除CV的气源和棉线过滤器，缓慢打开CV底部阀门，使水流经53 µm筛网的浮游生物收集器。将通过收集器底部流出的水收集至水桶或排入下水道。控制水流为轻柔至中等流速，避免损伤轮虫。切勿使轮虫在筛网上干燥。
   7. 出于一致性的考虑，建议每天使用固定数量的轮虫来建立FCV。  因此，根据已知的CV轮虫密度和收获体积，调整FCV的总体积，以达到一致的最终密度（例如，1,500 个轮虫/毫升。 将收集的轮虫加入FCV：使用装有洁净盐水（10–15 g/L）的洗瓶，轻轻将轮虫从收集筛网上转移。将筛网倒置于FCV上方，用温和的盐水流将轮虫冲洗入FCV中。启动PMT，向FCV输送饵料（约每天每百万轮虫1.57 ml）。
   8. 用干净、柔软的尼龙刷或清洁垫彻底刷洗CV内部。
   9. 在5加仑的桶中，通过向定量的洁净反渗透水中加入适量盐，配制15 g/L的新盐水混合液，以补充收获过程中损失的水量。将盐加入桶中的水中，充分搅拌直至完全溶解，然后加入CV系统中。
   10. 使用水槽中的高压喷水冲洗牙线过滤器，直至无残留碎屑，然后将其放回CV。
   11. 根据每日轮虫/毫升的数量，通过调整每次投喂时间来调节输送至CV的藻类流速。使用上述步骤1.3.8中提供的计算方法确定应投喂的适当饵料量。
   12. 约24小时后重复该过程。首先，以与上述相同的方法（步骤1.4.2–1.4.10）收集FCV中剩余的轮虫（即前一天未使用的轮虫）。将其浓缩于2 L新鲜、洁净的去氯水（盐浓度5 g/L）中。这些轮虫可作为备用资源在4 °C下保存，也可用于喂养本实验方案所述之外的后期鱼类幼体。
       注意：由于CV中的轮虫在未收获的情况下仍可耐受较长时间，本方案允许在正常自动喂养条件下减少培养维护时间，最长可达2 - 3天。

2. 混合培养

1. 准备
   1. 通过将产卵事件中产出的胚胎倒入茶筛，然后用洗瓶中的无菌鱼水（或任何其他无污染且适当调节的溶液来源；例如，胚胎培养基、E3等）轻轻冲洗，收集斑马鱼胚胎至培养皿中。
   2. 将胚胎在培养皿中于25 - 28 °C条件下孵育，每皿放置40 - 50枚胚胎，持续5天。
   3. 在受精后第5天开始共培养阶段，或当超过90%的孵化幼鱼在水体中活跃上浮游泳时开始。
2. 接种
   1. 直接从FCV取500 ml轮虫培养物加入3.5 L的育苗缸中；加入轮虫培养液可提供藻类饲料，以维持共培养期间轮虫的营养成分。
   2. 将一个培养皿中的幼鱼轻轻倒入育苗缸中，确保无幼鱼残留在皿内。
   3. 从循环系统或专用水源中加入500 ml清洁且调节过的鱼水至缸中，使最终体积达到1 L，最终盐度为5 g/L。
      注意：此盐度至关重要，因为若盐度>7 g/L，将对斑马鱼幼鱼的存活产生负面影响；而若盐度<2 g/L，则会影响轮虫的存活。
3. 共培养阶段
   注意：共培养阶段应持续至接种后最多4天（总共5天，对应受精后第5至第9天）。
   1. 在此期间每天至少观察一次共培养缸，确保轮虫和鱼类均存在并正常生长。确认轮虫在整个水体中可见，同时鱼类也在水体中清晰可见，并在轮虫群中游动。
   2. 启动通过培养缸的正常水流。在排水口处安装筛网或挡板，防止幼鱼被冲出缸外。
      注意：此阶段结束时，鱼类体型已足够大，可摄食较大的饵料，如卤虫（Artemia）无节幼体或粒径在75 - 125 µm范围内的加工饲料。
      注意：通过与步骤1.4.2 - 1.4.5中所述相同的方法对代表性共培养缸中的轮虫进行取样和计数，以测定轮虫种群动态。该操作从共培养阶段开始之日起每日进行一次，直至阶段结束。

结果

本文所述的轮虫连续培养系统具有动态特性，若每日投喂量和收获量存在波动，轮虫数量在一定范围内随时间发生小幅波动属于正常现象。在波士顿儿童医院水产养殖设施中，按照上述方法维持的一个活跃培养体系中的轮虫种群数量被连续监测了30天（图3）。在此期间，培养液中轮虫的平均密度为932个/毫升，最高达到1,330个/毫升，最低为510个/毫升。该结果代表了按照本方案进行培养的轮虫种群的典型表现。

多物种共培养水箱中轮虫种群的动态变化如图4所示。在一个3.5 L的鱼缸中接种了500 ml来自FCV的轮虫培养液、500 ml灭菌鱼水以及40条5日龄的野生型（Tübingen品系）幼鱼，以展示轮虫与斑马鱼在典型多物种共培养水箱中的表现。在共培养的第二天，轮虫种群密度达到峰值，为747个轮虫/mL（图4）。在为期5天的共培养期间，轮虫密度逐渐下降，至第5天时最低降至481个...

讨论

成功实施轮虫多品种共培养法以喂养早期斑马鱼幼鱼，需要有效完成两项任务的操作方案：建立并维持一个持续的轮虫培养系统以供鱼类摄食，以及在同一水体中将初摄食的斑马鱼幼鱼与轮虫共同培养。

最初由 Lawrence 及其合著者首次描述的用于斑马鱼实验室的连续海水轮虫培养系统¹⁴，已在多个方面进行了修改和优化，使其在应用上更加稳定且具有普适性。新方案在设备和方法学方面均进行了改进。

目前，藻类饲料混合物的储存系统采用鲶鱼养殖系统中使用的孵化罐¹⁵。将饲料储存在这些圆底罐中有利于充分混合藻类饲料，防止其分层或结块，从而避免输送管道堵塞——这一问题在原始方案中曾频繁出现。同样，使用一体化可编程定时/计量泵减少了组件总数，并简化了对轮虫的定量投喂过程。此外，该装置可在24小时内按小时频率向轮虫投喂饲料，相比次数较少但单次投喂量较大的方式更为理想，因为这种频繁投喂能提高饲料的同化效率。

本方案包含了一种轮虫计数方法，可实现对轮虫培养物投喂量的精细调...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>轮虫培养基础设施
100 L 培养容器	Aquaneering	自定义	聚碳酸酯培养容器，锥形底部，带排液阀
5 加仑培养桶套装	里德海水养殖	CCS 起始工具包	适用于小型设施的小体积培养容器
1/2 英寸刚性透明管" O.D., 36”	Pentair 水生生态系统	16025	用于输送空气的硬质透明管
网状管	Pentair 水生生态系统	RT444X	牙线滤器的网状管支撑
轮虫棉线	里德海洋养殖公司	轮虫牙线 12” × 42”	颗粒废物捕获器
蠕动计量定时泵，5 加仑/天	格雷格纳	38M003	带定时器的计量泵，用于向轮虫投喂饲料
蠕动计量定时泵，1-100 毫升/小时（适用于小规模培养）	珊瑚视图	SKU: IC-LQD-DSR	带定时器的计量泵，用于向轮虫投喂饲料
硅胶管	Cole Parmer		用于将藻类输送至轮虫培养容器的管路
刚性透明管 " O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	用于向藻类糊状物输送空气的刚性透明管
外径为36的硬质透明管”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	用于藻类输送的刚性透明管
<强>轮虫
活体轮虫褶皱臂尾轮虫L型	里德海洋养殖公司	L型 500万	系统启动用轮虫种群培养
<强>轮虫饲料
羟甲基磺酸钠	里德海洋养殖公司	ClorAm-X® 1磅装容器	用于藻类饲料混合物的氨还原剂
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S25533B	藻类饲料混合物用pH缓冲液
微藻浓缩物	里德海洋养殖公司	Rotigrow Plus® 1 升袋装	营养优化的轮虫饲料
RG完全培养基	里德海洋养殖公司	RG Complete 6 盎司瓶装	一种适用于小规模培养的微藻全营养饲料
<强>水的制备
Reef Crystals 海水盐	那条鱼的地方	198210	用于配制培养用水的盐（注意：此物品仅为示例，可使用任何无污染的盐制剂）。
折射仪	Pentair 水生生态系统	SR6	测量盐度
<强>轮虫培养设备
浮游生物采集器 12" Dia，53 微米	Pentair 水生生态系统	BBPC20	用于收集轮虫的网筛
清洁垫	Pentair 水生生态系统	SCR-58	用于清洁培养容器内部的擦洗垫
刷子
桶	格莱因格供应公司	43Y530	用于混合培养水的量筒桶
孵化桶	Pentair 水生生态系统	J30	藻类饲料混合物的储存
卢戈氏碘液’s 溶液，稀释	Fisher Scientific	S99481	用于固定活体轮虫以进行计数的试剂
带网格的塞奇威克-拉夫特浮游生物计数板	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	计数轮虫
<强>其他
茶漏	厨房用品	971972	用于收集斑马鱼产卵后的胚胎