多酶筛选使用高通量基因酶的筛选系统

Summary

这项工作提出了一种使用通用遗传酶筛选系统进行高通量筛选的方法，理论上可以应用于 200 多种酶。在这里，单个筛选系统通过简单地改变所使用的底物（对硝基苯乙酸酯、对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷和磷酸苯酯）来识别三种不同的酶（脂肪酶、纤维素酶和碱性磷酸酶）。

Abstract

最近开发的高通量单细胞检测技术能够根据大规模宏基因组文库的功能活性筛选新型酶¹。我们之前提出了一种遗传酶筛选系统 （GESS），该系统使用由苯酚或对硝基苯酚激活的二甲基苯酚调节剂。由于大量的天然酶促反应从苯酚衍生底物中产生这些酚类化合物，因此理论上可以将这种单一的基因筛选系统应用于筛选 BRENDA 数据库中的 200 多种不同酶。尽管 GESS 具有普遍适用性，但应用筛选过程需要特定的程序才能达到最大的流式细胞术信号。在这里，我们详细介绍了开发的筛选过程，其中包括使用 GESS 进行宏基因组预处理和流式细胞术分选仪的作。使用三种不同的酚类底物 （对硝基苯乙酸酯、对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷和磷酸苯酯） 和 GESS 分别筛选和鉴定三种不同的酶 （脂肪酶、纤维素酶和碱性磷酸酶）。选定的宏基因组酶活性仅通过流式细胞术确认，但 DNA 测序和多种体外分析可用于进一步的基因鉴定。

Introduction

最近开发的高通量的单细胞分析技术允许新的酶从基于其功能活动¹大规模的基因库进行筛选。在单细胞水平，调节转录的蛋白质采用通过检测所生产作为目标酶活性的结果，小分子引发报告基因的表达。一种早期方法涉及从富养产碱 E2使用底物诱导的基因表达筛选（SIGEX）方法，其中基材诱导报告蛋白²的表达的酚降解操纵子的分离。 恶臭假单胞菌 NhaR用于选择苯甲醛脱氢酶^3，并从谷氨酸棒杆菌 LysG被用于从不同的突变体文库⁴新的L-赖氨酸生产菌株的高通量筛选。

先前，遗传酶screeniNG系统（GESS）提出了一个普遍适用的筛选平台^5。该系统采用酚系识别二甲调节器，DMPR，P的恶臭 。 DMPR（E135K），和DMPR的突变体，也可以在GESS（PNP-GESS）检测p硝基苯酚（PNP）的使用。在生产酚醛化合物靶酶的存在下，GESS在大肠杆菌大肠杆菌细胞发出的荧光信号，能够使用荧光激活细胞分选仪（FACS）单细胞的快速分离。但宏基因组酶的表达似乎是比传统的重组酶的弱;因此，GESS旨在通过与最佳操作条件⁵沿调查核糖体结合位点（RBS）和终止子序列的组合以检测与最大灵敏度酚类化合物。

之一的GESS的基本优点是，这种单一的方法理论上允许OV的筛选器超过200种不同类型的BRENDA数据库酶（ 表1对于http:// www.brenda-enzymes.info，2013.7）通过简单地采用不同的基板。它表明，纤维素酶，脂肪酶，和甲基对硫磷水解酶（MPH）可使用的pNP-GESS与对硝基苯基丁酸酯，对硝基苯基- cellotrioside和甲基对硫磷，分别为⁵的适当底物进行检测。最近，证明了碱性磷酸酶（AP），其是使用的pNP-GESS确定的新酶之一，是在冷适应的海洋宏基因组⁶找到的第一个不耐热的AP。

这里，筛选过程的细节呈现的pNP-GESS检测三种不同类型的enzymes-脂肪酶，纤维素酶，和碱性磷酸酶的活动-and迅速从宏基因组文库^5,6-识别新的候选酶。这些过程包括:宏基因组为PNP-GESS预处理和经营FL流式细胞仪分拣机。而获得的匹配将需要测序进一步鉴定，该协议覆盖的步骤执行到使用流式细胞仪的酶活性的确认的步骤。

Protocol

1.准备使用的PNP-GESS的宏基因组文库

1. 在构造一个E.宏基因组文库大肠杆菌用F粘粒载体使用根据制造商的方案⁵的fosmid文库生产套件。
2. 等分试样在-70℃，这是宏基因组文库细胞源100微升用于存储的库。
   注意:在这个库的库存为600nm（OD _600）的波长的测定的样品的光密度为约100。
3. 在冰上解冻100微升股票宏基因组文库，并在含有50毫升的Luria-BERTANI（LB）和12.5微克/毫升氯霉素接着37℃温育2小时的500毫升烧瓶中接种。
4. 收获在通过离心50ml锥形管中的细胞以1000 xg离心在4℃下20分钟。
5. 再次快速重悬沉淀在50ml冰冷却的蒸馏水（DW）和离心机在1000×g离心20分钟，在4℃下。
6. RESuspend在50μl冰冷DW沉淀，用10％（V / V）甘油。使用50微升这种细胞等分的电。
7. 放置电感受态细胞50微升和^{pGESS（E135K）5}的DNA（为100ng）的混合物在冰冷电穿孔管和电穿孔（1.8千伏/厘米，25μF）的混合物。
8. 迅速加入1毫升代谢产物抑制（SOC）中的超级最佳肉汤，轻轻悬浮细胞。
9. 转移细胞成14毫升的圆底管中，使用移液管，在37℃下孵育1小时。
10. 涂布在含有12.5微克/毫升氯霉素和50μg/ ml氨苄青霉素的LB一个20×20厘米的正方形板500微升回收的细胞。在30℃下孵育板12小时。
11. 刮使用细胞刮菌落并收集细胞进入用冰冷元存储介质的50ml锥形管中。
12. 离心机在1000×g离心在4℃下20分钟。重悬在10毫升冰冷的细胞存储介质颗粒达成OD 100 _600。
13. 等分试样20微升细胞贮存在-70℃。

2.从宏基因组文库删除误报

1. 解冻含冰宏基因组DNA和粘粒pGESS（E135K）股票宏基因组文库细胞（从步骤1.13）。
2. 接种于2ml的LB 10微升细胞含有50μg/ ml氨苄青霉素和12.5微克/毫升氯霉素的14毫升圆底管中。在37℃下孵育以200rpm摇动4小时。
3. 同时，打开FACS机器上打开默认FACS软件。使用以下设置:喷嘴尖端直径，70微米;前向散射面积（FSC-A）的灵敏度，300 V-数放大;侧散射面积（SSC-A）的灵敏度，350 V-数放大;异硫氰酸荧光区（FITC-A）的灵敏度，450 V-数放大;阈值参数，FSC-A值5。
   注:给出的典型设置在材料的表中提到FACS设备。调整为其他的FACS设备的设置。
4. 通过加入5微升样品加入到含有1ml的PBS 5毫升圆底管稀释来自步骤2.2的宏基因组文库的细胞。
5. 稀释样品库放置到FACS仪器的装货港和点击的FACS软件的收购仪表盘Load按钮。
6. 通过点击和控制仪表盘上的流量按钮1500次/秒 - 调整事件的发生率到1000。
7. 创建日志缩放FSC-A 与对数比例SSC-A散点图在全球工作表通过单击工具栏上的点图按钮。调整散射门R1到包括使用工具栏上的多边形门按钮单事件（细菌种群）。
8. 绘制与细胞计数直方图与对数比例FITC-A在工作表上通过点击直方图按钮。然后，调整从细胞组的电压FITC检查员控制窗口之三设置标签，使得钟形分布的峰值小于10 ² FITC-A的。
9. 创建日志缩放FSC-A 对 。日志FITC-A通过点击全球工作表上点图按钮的情节。有关使用该工具栏上的多边形门按钮的情节设置分配门R2使得栅极距离发行总量的10％细胞中心（周围的钟峰+ 5％和-5％之间的细胞形曲线）。
10. 放置装有含1.2毫升的LB 50微克/毫升氨苄青霉素和12.5微克/毫升氯霉素的FACS仪器的出口与梳理10 ^6个细胞同时满足R1和R2栅极的收集管。
11. 取下收集管中，帽，并轻轻涡旋。

3.宏基因组酶的筛选

1. 孵育在37℃的分选的细胞（来自步骤2.11）以200rpm振荡培养直至OD ₆₀₀达到0.5。
2. 加入1μl复制感应解决方案，以扩增细胞内的fosmid套数。孵育所述细胞在37℃下另外的3小时，以250rpm摇动。
3. 为了制备细胞分选，加入0.5毫升的培养细胞和合适的底物（ 对硝基苯酯，对硝基苯基- β-D-纤维二糖苷，或苯基磷酸酯）成一个14毫升的圆底管中，在终浓度为100μM。
   1. 对于对照样品，加入0.5毫升来自步骤3.2的培养细胞的成一个14毫升的圆底管中。添加的PBS的体积相同步骤3.3衬底卷。
4. 孵育在37℃的两个样品以200rpm摇动3小时。
5. 同时，用相同的配置，步骤2.3制备FACS机器。
6. 添加5微升细胞（分选）和对照细胞的含有1ml的PBS，分别两个5毫升的圆底管中。
7. 将含有控制细胞到T中的管他装载FACS的端口，然后点击Load按钮在FACS软件采集仪表盘。通过仪表盘上的控制流量按钮3000次/秒 - 调整事件的发生率到1000。
8. 创建日志缩放FSC-A 与对数比例SSC-A散点图使用的多边形门按钮，点击点图按钮，软件的全球工作表上，并调整散射门R1以包含单事件（细菌种群）工具栏。
9. 创建日志缩放FSC-A 与对数比例FITC-A散点图通过单击点图按钮在工作表上并设置分配门R2使用工具栏上的多边形门按钮的情节，这样的不到0.1％ R2的栅极内检测到阴性细胞。
10. 与分选样品管更换控制样品管，并调整事件发生率1000 - 通过控制仪表盘上的流量按钮3000次/秒。
11. 放置装有0.5的收集管LB毫升的FACS仪器的出口，并整理出10 ^4个细胞满足R1和R2门两者。
    注意:分类标准可以在R2的栅极范围的FITC-A的从顶部0.1％至5％。在这个协议中，顶部1％的细胞被收集为阳性。
12. 取下收集管中，帽，并轻轻涡旋。
13. 散布0.5毫升收集的样品在含有LB，50微克/毫升氨苄青霉素，12.5微克/毫升氯霉素的2琼脂板（90 25mm培养皿），在37℃下孵育该板过夜。
14. 如果有必要，重复步骤3.1-3.14进行了FITC-A富集排序额外回合。

4.命中选型和​​酶活性的确认

1. 流式细胞分析
   1. 从步骤3.14培养板中，选择出了使用LED照明灯的488纳米波长下观察的殖民地选择器无荧光的殖民地。
   2. 接种所选择的菌落在14毫升ROUND底含有含2ml LB 50微克/毫升氨苄青霉素和12.5微克/ ml氯霉素，在37℃以200rpm摇动，直到它的外径₆₀₀达到0.5管。
   3. 加入2微升复制感应解决方案，以扩增细胞内的fosmid套数。孵育所述细胞在37℃下另外的3小时，以250rpm摇动。
   4. 准备了14毫升的圆底管中，加入1毫升培养的细胞（步骤4.1.3）的。在100μM的终浓度添加适当的底物（ 对硝基苯基乙酸， 对 -nitrophenyl-β-D-纤维二糖苷，或苯基磷酸酯）。
      1. 为对照，将来自步骤4.1.3添加1ml的培养细胞成一个14毫升的圆底管中，加的PBS的体积相同步骤4.1.4基板体积。
   5. 孵育在37℃的两个样品以200rpm摇动3小时。
   6. 同时，用相同的配置，步骤2.3制备FACS机器。
   7. 加入5微升控制和基板处理的细胞，以含1毫升的PBS，分别为5毫升的圆底管中。
   8. 放置FACS装置的装载端口上的含管对照细胞​​，然后点击Load按钮在FACS软件采集仪表盘。调整事件发生率1000 - 使用仪表盘上的流量按钮3000次/秒。
   9. 点击获取按钮来衡量FITC-A。
   10. 替换与基板处理的样品管中的对照样品管。调整事件发生率1000 - 使用仪表盘上的流量按钮3000次/秒。
   11. 点击获取按钮来衡量FITC-A。
   12. 通过对日志缩放的FITC-A绘制细胞计数的直方图比较两组细胞的荧光。
2. 其他试验证实酶的活性
   1. 对于选定的酶考生进一步鉴定，采用标准提取亲提取DNA粘粒从商用提取试剂盒cedures和分析的核苷酸序列，或测试体外酶活^6,7。

Results

检查三酚基板按照该协议，以确定在泰安，韩国海洋滩涂沉积物的宏基因组文库的小说宏基因组酶。用于文库构建，平均30 - 40 kb的宏基因组序列插入到F黏粒，这是基于对大肠杆菌大肠杆菌 F因子的复制子和呈现为在细胞中的单一拷贝。注意，F黏粒已被广泛用于构造复杂的基因组文库，由于其稳定传播^8。

图1显示了筛选方案包括除去具有负分拣误报（ 图1的 ），随后加入正命中选择与R1和R2分配门（ 图1B）的简要流程图。命中被样品的荧光带和不带衬底进行比较评价（ 图1C）。在对硝基苯乙介导的筛查情况下，脂肪酶的五名候选人被确认，其中基材处理过的细胞的荧光均较对照细胞（ 图2 A）高。尽管纤维素酶在图2 B三名...

Discussion

提高生物催化剂的生产效率是生物化工为主业⁹和宏基因组成功的关键被认为是最好的天然酶源之一。在这个意义上说，它是从那里大多数遗传资源还没有被开发¹⁰的宏基因组筛选新酶是必不可少的。几种筛选方法已经开发了使用转录激活^11,12直接检测酶的产品，但这些技术需要特定代谢物应答转录系统。另一方面，GESS根据使用的苯酚或PNP标记底物是广泛适用的。虽然大多数报道酶生产苯酚或PNP化合物BRENDA数据库（ 表1），（包括在这项工作中的三个例子）的属于水解酶（EC号3）类的酶，探索更多样化的酚类底物，甚至在设计的人工基板进行目标酶的活性，作为天然底物的替代品，可以显著延长筛选系统的适用性。需要注意的是选择合适的酚或PNP标签的基材是由于基板很大影响筛查方案的膜通透性和细胞作用的PNP-GESS应用的关键步骤之一。这里，我们表明，在工业上重要的三种不同类型的酶可以以高通量的方式使用单筛选系统来识别。

使用FACS的方法中，除了宏基因组酶的高通量筛选，也可以应用到改变的TR特异性工程转录调节（TRS...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmid 文库生产套件
CopyControl 诱导解决方案	Epicentre	CCIS125	Fosmid 拷贝诱导解决方案
EPI300	Epicentre	EC300110	电转感受态细胞
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	Fosmid载体
基因脉冲发生器 Mxcell	Bio-Rad		电穿孔比色皿和电穿孔系统
FACSAria III	Becton Dickinson		流式细胞仪（FACS 机）
AZ100M	尼康		显微镜
超薄	Maestrogen		LED 照明器
50 毫升锥形管	BD Falcon
14 毫升圆底管	BD Falcon
5毫升圆底管	BD Falcon
p-硝基苯磷酸酯	Sigma-Aldrich	N7653	底物
p-硝基苯基&β;-D-纤维二糖苷	Sigma-Aldrich	N5759	底物
p-硝基苯基丁酸酯	Sigma-Aldrich	N9876	酶作用物
Luria-Bertani （LB）	BD Difco	244620	胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 10 g/L
超优肉汤 （SOB）	BD Difco	244310	胰蛋白胨 20 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 0.5 g/L，硫酸镁 2.4 g/L，氯化钾 186 mg/L
含分解代谢物抑制 （SOC） 的超优肉汤 （SOC）		SOB， 0.4% 葡萄糖
2x 酵母提取物胰蛋白胨 （2xYT）	BD Difco	244020	酪蛋白胰腺消化物 16 g/L，酵母提取物 10 g/L，酵母提取物 5 g/L
细胞储存培养基			2x YT 肉汤，15% 甘油，2% 葡萄糖
pGESS（E135K）			含有 dmpR、egfp 基因及其适当启动子、RBS 和终止子的 DNA 载体。 参见手稿中的参考文献 5更多细节。
氯霉素	Sigma	C0378
氨苄青霉素	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		流式细胞术软件版本 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl，0.02% KCl，0.0144% Na2HPO4，0.024% KH2OP4，pH 7.4