基于高通量基因酶筛选系统的多酶筛选

摘要

本研究提出了一种高通量筛选方法，采用一种通用的遗传性酶筛选系统，理论上可应用于200多种酶。在此，通过更换所用底物，该单一筛选系统即可识别三种不同的酶（脂肪酶、纤维素酶和碱性磷酸酶）p对硝基苯乙酸酯，p-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷，以及苯基磷酸盐。

摘要

高通量单细胞检测技术的最新发展使得能够从大规模宏基因组文库中基于功能活性筛选新型酶¹我们先前提出了一种遗传酶筛选系统（GESS），该系统利用苯酚或其衍生物激活的二甲基苯酚调节因子 p-硝基苯酚。由于大量天然酶促反应能够从酚类底物生成这些酚类化合物，该单一遗传筛选系统理论上可应用于筛选BRENDA数据库中超过200种不同的酶。尽管遗传酶筛选系统（GESS）具有广泛的适用性，但应用该筛选过程需要特定的操作步骤以获得最强的流式细胞术信号。本文详细描述了所开发的筛选流程，包括利用GESS进行宏基因组预处理以及流式细胞分选仪的操作。三种不同的酚类底物（p对硝基苯乙酸酯，p硝基苯基-β-D-纤维二糖苷和苯基磷酸盐）与GESS联用，分别用于筛选和鉴定三种不同的酶（脂肪酶、纤维素酶和碱性磷酸酶）。所选的宏基因组酶活性仅通过流式细胞术确认，但未进行DNA测序及多样性分析。 体外 分析可用于进一步的基因鉴定。

引言

一种近期开发的高通量单细胞检测技术能够基于功能活性，从大规模基因文库中筛选出新型酶¹。在单细胞水平上，利用调控转录的蛋白质来感知由目标酶活性产生的小分子，从而触发报告基因的表达。早期的一种方法是通过底物诱导基因表达筛选（SIGEX）技术，从Ralstonia eutropha E2中分离出降解酚的操纵子，其中底物可诱导报告蛋白的表达²。铜绿假单胞菌（Pseudomonas putida）的NhaR被用于筛选苯甲醛脱氢酶³，而谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）的LysG则被应用于从多种突变文库中高通量筛选新的L-赖氨酸生产菌株⁴。

此前，一种遗传酶筛选系统（GESS）被提出作为通用的筛选平台⁵。该系统利用恶臭假单胞菌（P. putida）中识别酚类物质的二甲基苯酚调控蛋白 DmpR。DmpR(E135K) 是 DmpR 的一种突变体，也可用于 GESS（pNP-GESS）以检测对硝基苯酚（p-nitrophenol, pNP）。当存在能够产生酚类化合物的目标酶时，大肠杆菌（E. coli）细胞中的 GESS 会发出荧光信号，从而可通过荧光激活细胞分选仪（FACS）快速分离单个细胞。然而，宏基因组来源的酶表达水平似乎低于传统重组酶；因此，为实现对酚类化合物的最高检测灵敏度，GESS 通过研究核糖体结合位点（RBS）与终止子序列的组合，并结合最优操作条件进行了设计⁵。

GESS 的一个基本优势在于，该单一方法理论上可实现对 BRENDA 数据库中超过 200 种不同酶的筛选。表1，http://www.brenda-enzymes.info，2013.7）通过使用不同的底物实现。研究表明，使用pNP-GESS并配合适当的底物，可检测纤维素酶、脂肪酶和对甲基对氧磷水解酶（MPH）。 p对硝基苯基丁酸酯，p-硝基苯基-纤维三糖苷和对硫磷甲酯⁵最近，通过使用pNP-GESS鉴定出的一种新型酶——碱性磷酸酶（AP），被证实是首次在嗜冷海洋宏基因组中发现的热不稳定碱性磷酸酶。⁶.

本文介绍了利用pNP-GESS对宏基因组文库中三种不同类型酶——脂肪酶、纤维素酶和碱性磷酸酶的活性进行检测，并快速筛选出新型候选酶的筛选流程细节^5,6。该流程包括使用pNP-GESS对宏基因组进行预处理以及操作流式细胞分选仪。尽管所获得的阳性结果需通过测序进一步鉴定，但本实验方案涵盖至利用流式细胞术确认酶活性的全部步骤。

方案

1. 使用 pNP-GESS 准备宏基因组文库

1. 根据制造商的说明书⁵，使用fosmid文库构建试剂盒，在E. coli中构建宏基因组文库。
2. 将100 µl文库分装后于−70 °C保存，作为宏基因组文库细胞的来源。
   注意：该文库储备液在600 nm波长处测得的光密度（OD₆₀₀）约为100。
3. 将100 µl宏基因组文库储备液在冰上解冻，并接种至含有50 ml LB（Luria-Bertani）培养基和12.5 µg/ml氯霉素的500 ml三角瓶中，于37 °C培养2小时。
4. 在4 °C条件下，以1,000 × g离心20分钟，用50 ml锥形管收集细胞。
5. 用50 ml预冷的蒸馏水（DW）迅速重悬沉淀，再次在4 °C条件下以1,000 × g离心20分钟。
6. 将沉淀重悬于含10%（v/v）甘油的50 µl预冷蒸馏水中。取50 µl该细胞分装液用于电转化。
7. 将50 µl电感受态细胞与pGESS(E135K)⁵ DNA（100 ng）混合后加入预冷的电转化比色杯中，进行电穿孔（1.8 kV/cm，25 µF）。
8. 迅速加入1 ml SOC（含分解代谢抑制的超级优化肉汤）培养基，轻轻重悬细胞。
9. 用移液器将细胞转移至14 ml圆底管中，在37 °C孵育1小时。
10. 取500 µl复苏后的细胞涂布于含12.5 µg/ml氯霉素和50 µg/ml氨苄青霉素的20 × 20 cm LB方形平板上，于30 °C培养12小时。
11. 用细胞刮刀刮下菌落，并用预冷的细胞保存液将细胞收集至50 ml锥形管中。
12. 在4 °C条件下以1,000 × g离心20分钟，将沉淀重悬于10 ml预冷的细胞保存液中，调节OD₆₀₀至100。
13. 将细胞分装为每份20 µl，于−70 °C保存。

2. 从宏基因组文库中去除假阳性结果

1. 将含有宏基因组DNAfosmid和pGESS(E135K)的宏基因组文库菌株（来自步骤1.13）冰上解冻。
2. 在14 ml圆底试管中，将10 µl细胞接种于2 ml含有50 µg/ml氨苄青霉素和12.5 µg/ml氯霉素的LB培养基中。37 °C、200 rpm振荡培养4小时。
3. 同时，打开流式细胞仪并启动默认的FACS软件。使用以下设置：喷嘴孔径70 µm；前向散射面积（FSC-A）灵敏度300 V-对数放大；侧向散射面积（SSC-A）灵敏度350 V-对数放大；异硫氰酸荧光素面积（FITC-A）灵敏度450 V-对数放大；阈值参数为FSC-A值5。
   注意：此处提供了针对文中提及的FACS设备的典型设置参数 材料表调整其他流式细胞仪设备的设置。
4. 将2.2步骤中的宏基因组文库细胞进行稀释，取5 µl样品加入含有1 ml PBS的5 ml圆底试管中。
5. 将稀释后的文库样品置于流式细胞仪的上样口，然后点击流式软件采集控制面板上的“加载”按钮。
6. 通过点击并调节仪表板上的流速按钮，将事件速率调整至1,000 - 1,500 个事件/秒。
7. 创建对数缩放的FSC-A 与 在工具栏中点击“点图”按钮，在全局工作表上创建对数缩放的SSC-A散点图。使用工具栏中的“多边形门”按钮调整散射门R1，使其包含单一群体事件（细菌群体）。
8. 绘制细胞计数直方图 与 在工作表上单击直方图按钮，将 FITC-A 设为对数刻度。然后，在检查器控制窗口的细胞仪设置选项卡中调节 FITC 电压，使钟形分布的峰值低于 10² FITC-A的
9. 创建对数缩放的FSC-A 与在全局工作表上点击点图按钮，生成对数FITC-A图。使用工具栏上的多边形门控按钮，在图上设置分选门R2，使该门控位于分布中心上下5%细胞范围内（即钟形曲线峰值周围共10%的细胞）。
10. 在FACS仪器的出口处放置一个收集管，管内含有1.2 ml LB培养基，其中添加50 µg/ml氨苄青霉素和12.5 µg/ml氯霉素，分选10⁶ 同时满足R1和R2门控的细胞
11. 取下收集管，盖上盖子，轻轻涡旋震荡。

3. 宏基因组酶筛选

1. 将分选后的细胞（来自步骤 2.11）在 37 °C、200 rpm 振荡条件下孵育，直至 OD₆₀₀ 达到 0.5。
2. 加入1 μl拷贝数诱导溶液以扩增细胞内fosmid的拷贝数。将细胞在37 °C、250 rpm振荡条件下继续培养3小时。
3. 为细胞分选做准备，加入0.5 ml培养的细胞及适量的底物（p对硝基苯乙酸酯，p将对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷（p-nitrophenyl-β-D-cellobioside）或苯基磷酸盐（phenyl phosphate）加入14 ml圆底试管中，终浓度为100 µM。
   1. 对照样品：取步骤 3.2 中培养的细胞 0.5 ml 加入 14 ml 圆底管中。加入与步骤 3.3 中底物体积相同的 PBS。
4. 将两个样品在37 °C、200 rpm振荡条件下孵育3小时。
5. 同时，使用与步骤 2.3 相同的配置准备 FACS 仪器。
6. 分别向两个含有1 ml PBS的5 ml圆底试管中加入5 µl待分选的细胞和对照细胞。
7. 将含有对照细胞的试管置于流式细胞仪的上样口，点击流式细胞仪软件采集控制面板上的“加载”按钮。通过控制面板上的流速调节按钮，将事件速率调整至每秒1,000 - 3,000个事件。
8. 创建对数缩放的FSC-A 与 通过点击软件全局工作表上的“点图”按钮，生成对数缩放的SSC-A散点图，并使用工具栏上的“多边形门”按钮调整散射门R1，使其包含单细胞事件（细菌群体）。
9. 创建对数缩放的FSC-A 与 通过单击工作表上的点图按钮，创建对数缩放的FITC-A散点图，并使用工具栏上的多边形门控按钮在图上设置分选门R2，使R2门内检测到的阴性细胞少于0.1%。
10. 将对照样品管更换为分选样品管，通过控制仪表盘上的流速按钮，将事件速率调整至每秒1,000 - 3,000个事件。
11. 在FACS仪器的出口处放置一个含有0.5 ml LB的收集管，并分选10⁴ 同时满足R1和R2门控的细胞
    注意：分选标准可设定为R2门中FITC-A信号最强的0.1%至5%细胞。本方案中，选取信号最强的1%细胞作为阳性细胞。
12. 取下收集管，盖上盖子，轻轻涡旋震荡。
13. 将0.5 ml收集的样品均匀涂布于两块含有LB培养基、50 µg/ml氨苄青霉素和12.5 µg/ml氯霉素的琼脂平板（90 mm培养皿）上，于37 °C过夜培养。
14. 如有必要，通过重复步骤 3.1–3.14 进行额外轮次的分选以富集 FITC-A。

4. 阳性筛选与酶活性验证

1. 流式细胞术分析
   1. 从第3.14步孵育后的平板中，在LED照明器488 nm波长观察下，使用菌落挑取仪选择无荧光的菌落。
   2. 将选定的菌落接种于含有2 ml LB培养基的14 ml圆底管中，LB培养基中添加50 µg/ml氨苄青霉素和12.5 µg/ml氯霉素，在37 °C、200 rpm振荡条件下培养至其OD₆₀₀ 达到 0.5。
   3. 加入2 μl拷贝数诱导溶液以扩增细胞内fosmid的拷贝数。将细胞在37 °C、250 rpm振荡条件下继续培养3小时。
   4. 准备一个14 ml的圆底试管，加入1 ml培养的细胞（步骤4.1.3）。加入适量的底物（p-硝基苯乙酸酯， p-硝基苯基-β100 µM 终浓度的 -D-纤维二糖苷或苯基磷酸盐。
      1. 作为对照，将4.1.3步骤中的1 ml培养细胞加入14 ml圆底管中，并加入与4.1.4步骤中底物体积相同的PBS。
   5. 将两个样品在37 °C、200 rpm振荡条件下孵育3小时。
   6. 同时，使用与步骤 2.3 相同的配置准备 FACS 仪器。
   7. 将5 µl对照组和底物处理的细胞分别加入含有1 ml PBS的5 ml圆底试管中。
   8. 将含有对照细胞的试管置于流式细胞仪的上样口，点击流式细胞术软件采集控制面板上的“加载”按钮。使用控制面板上的流速调节按钮，将事件速率调整至每秒1,000 - 3,000个事件。
   9. 单击采集按钮以测量 FITC-A。
   10. 将对照样品管更换为底物处理的样品管。在仪表盘上使用流速调节按钮，将事件速率调整至1,000 - 3,000 事件/秒。
   11. 单击采集按钮以测量 FITC-A。
   12. 通过绘制细胞数量的直方图，比较两组细胞的荧光强度 与 对数缩放的 FITC-A。
2. 确认酶活性的其他检测方法
   1. 为进一步鉴定所选的酶候选物，使用商用提取试剂盒的标准提取程序提取fosmid DNA，并分析其核苷酸序列，或进行测试 体外 酶活性^6,7.

结果

通过采用所提出的实验方案，对三种酚类底物进行了检测，旨在从韩国泰安海洋潮滩沉积物的宏基因组文库中鉴定出新的宏基因组酶。在文库构建过程中，将平均长度为30–40 kb的宏基因组序列插入到fosmid载体中，该载体基于大肠杆菌（E. coli）F因子复制子，并在细胞中以单拷贝形式存在。需要注意的是，由于fosmid载体具有稳定的遗传特性，已被广泛用于构建复杂的基因组文库⁸。

图1展示了一个简要的筛选流程图，包括通过阴性分选去除假阳性结果（图1 A），随后通过R1和R2分选门进行阳性命中筛选（图1 B）。通过比较样品在有无底物条件下的荧光信号来评估命中结果（图1 C）。在以对硝基苯基乙酸酯（p-nitrophenyl acetate）介导的筛选中，确认了五个脂肪酶候选...

讨论

提高生物催化剂的生产效率是生化工业成功的关键⁹ 宏基因组被认为是最佳的天然酶来源之一。因此，从大多数遗传资源尚未被开发的宏基因组中筛选新型酶显得尤为重要。¹⁰已开发出多种筛选方法，这些方法利用转录激活因子直接检测酶的产物^{11, 12} 但这些技术需要特定的代谢物响应型转录系统。相比之下，GESS 的适用范围更广，其应用取决于使用苯酚或对硝基苯酚（pNP）标记的底物。尽管在 BRENDA 数据库中报道的大多数能够产生苯酚或 pNP 化合物的酶表1），（包括本研究中的三个示例）属于水解酶类（EC编号3），探索更多样化的酚类底物，甚至设计针对目标酶活性的人工底物以替代天然底物，可显著拓展该筛选系统的适用范围。需注意，选择合适的酚类或对硝基苯酚（pNP）标记的底物是pNP-GESS应用中的关键步骤之一，因为底物的膜通透性及其对细胞的影响会显著影响筛选流程。本文展示了利用单一筛选系统以高通量方式鉴定三种具有工业重要性的不同酶类。

除了用于宏基因组酶的高通量筛选外，FACS 方法还可应用于改造转录...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	噬菌粒文库构建试剂盒
CopyControl 诱导溶液	Epicentre	CCIS125	噬菌粒拷贝数诱导溶液
EPI300	Epicentre	EC300110	电转感受态细胞
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	噬菌粒载体
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		电穿孔比色皿及电穿孔系统
FACSAria III	Becton Dickinson		流式细胞仪（FACS 仪器）
AZ100M	Nikon		显微镜
UltraSlim	Maestrogen		LED 照明器
50 ml 锥形管	BD Falcon
14 ml 圆底管	BD Falcon
5 ml 圆底管	BD Falcon
p-硝基苯基磷酸盐	Sigma-Aldrich	N7653	底物
p-硝基苯基 β-D-纤维二糖苷	Sigma-Aldrich	N5759	底物
p-硝基苯基丁酸酯	Sigma-Aldrich	N9876	底物
LB 培养基（Luria-Bertani）	BD Difco	244620	胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 10 g/L
SOB 培养基（Super Optimal broth）	BD Difco	244310	胰蛋白胨 20 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 0.5 g/L，硫酸镁 2.4 g/L，氯化钾 186 mg/L
含分解代谢抑制的 SOB 培养基（SOC）		SOB，0.4% 葡萄糖
2xYT 培养基（2x Yeast Extract Tryptone）	BD Difco	244020	酪蛋白胰酶消化物 16 g/L，酵母提取物 10 g/L，酵母提取物 5 g/L
细胞保存培养基			2xYT 培养基，15% 甘油，2% 葡萄糖
pGESS(E135K)			含有 dmpR 和 egfp 基因及其相应启动子、核糖体结合位点（RBS）和终止子的 DNA 载体。 更多细节请参见论文中的参考文献 5。
氯霉素	Sigma	C0378
氨苄青霉素	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		流式细胞术软件版本 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl，0.02% KCl，0.0144% Na2HPO4，0.024% KH2OP4, pH 7.4