多酶筛选使用高通量基因酶的筛选系统
August 8th, 2016
这项工作提出了一种使用通用遗传酶筛选系统进行高通量筛选的方法，理论上可以应用于 200 多种酶。在这里，单个筛选系统通过简单地改变所使用的底物（对硝基苯乙酸酯、对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷和磷酸苯酯）来识别三种不同的酶（脂肪酶、纤维素酶和碱性磷酸酶）。
该方法的总体目标是使用单个高通量筛选系统评估多种酶。该方法可以帮助回答微生物和生物工程领域关于宏基因组筛选和酶工程的关键问题。我们开发了一种遗传酶筛选系统，该系统由 MPL 突变体响应苯化合物及其下游 GFP 报告基因组成。
一旦任何宏基因组基因通过与提供的底物反应显示我们感兴趣的酶活性，反应产物的苯基化合物就会激活 Dmp 突变体并触发 GFP 报告基因表达，该表达可以很容易地被荧光计捕获。该技术的主要优点是，与传统的筛选技术不同，这种单一方法适用于通过使用适当的底物筛选多种类型的不同酶。演示该程序的是我们实验室的研究生 Kil Koang Kwon。
使用 fosmid 文库生产试剂盒用 fosmid 载体在 E.Coli 中构建宏基因组文库后，将 pGESS（E135K）DNA 转运到宏基因组文库细胞中。然后将转化的文库细胞储存在零下 70 摄氏度和 20 微升等分试样中。要去除假阳性，首先在冰上解冻宏基因组文库细胞等分试样。
然后将 10 微升解冻的细胞接种在 2 毫升含有氨苄青霉素和氯霉素的溶原肉汤中，在 37 摄氏度和 200 RPM 的 14 毫升圆底管中接种 4 小时。同时，在 FACS 机器上设置适当的参数，以便在默认的 FACS 软件中读取宏基因组文库细胞。孵育结束时，将 5 μL 细胞转移到 5 mL 圆底管中的 1 mL PBS 中。
然后，加载稀释的库样品并将事件速率调整为每秒 1000 到 1500 个事件。要在全局工作表上生成对数缩放的前向散射区域与对数缩放的侧向散射区域散点图，请创建一个点图并在包含细菌种群的单重态事件周围绘制一个多边形门。要绘制细胞计数与对数缩放的 FITC 面积直方图，请打开直方图并调整 FITC 电压，使钟形分布的峰值小于 10 到 FITC 面积的 2
。接下来，打开另一个点图，创建一个对数缩放的前向散射面积与对数 FITC 面积图，并将 R2 排序门设置在距分布中心的单元格的正 5% 和负 5% 之间。设置完所有门后，将含有 1.2 毫升补充抗生素的溶原肉汤的收集管放在 FACS 仪器出口处，并将 1 次 10 到 6 个门控细胞分选到肉汤中。在分选结束时，盖上收集管并轻轻涡旋细胞。
为了筛选感兴趣的宏基因组酶，将分选的细胞在 37 摄氏度和 200 RPM 下孵育，直到 OD 600 达到 0.5，然后加入 1 微升拷贝诱导溶液以扩增细胞内 fosmid 拷贝数。在 37 摄氏度和 250 RPM 下 3 小时后，将 0.5 毫升细胞与适当的底物混合在 14 毫升圆底管中，达到 100 微摩尔的最终浓度。然后将对照和实验样品在 37 摄氏度和 200 RPM 下再孵育 3 小时。
当样品摇晃时，按照刚才演示的设置 FACS 机器参数。然后，将每个样品中的 5 微升细胞加入含有 1 毫升 PBS 的 5 毫升圆底管中。接下来，加载示例单元格并将事件速率设置为每秒 1000 到 3000 个事件。
创建对数缩放的前向散射区域与对数缩放的侧向散射区域散点图，并调整 R1 散射门以包含单重态事件细菌细胞。然后创建一个对数缩放的前向散点图与对数缩放的 FITC 面积散点图，并设置 R2 排序门，以便检测到少于 0.1% 的阴性细胞。现在，加载样品管并根据需要将事件速率重新调整为每秒 1000 到 3000 个事件。
然后将含有 0.5 毫升溶原肉汤的收集管放在 FACS 仪器出口处，并在 R1 和 R2 门内收集 1 乘以 10 到 4 个细胞。当所有细胞都被分离出来后，盖上收集管并轻轻涡旋细胞。然后将 0.5 毫升收集的样品涂在两个 90 毫米琼脂平板上，该琼脂平板上装有补充抗生素的溶原肉汤，然后在 37 摄氏度下孵育平板过夜。
在该图中，说明了演示的筛选方案，包括通过负排序去除假阳性，以及使用 R1 和 R2 排序门选择阳性命中。然后可以通过比较有和没有底物的样品荧光来评估命中。在这个代表性的对硝基乙酸酯介导的筛选中，底物处理的细胞的荧光高于对照细胞的荧光，证实了该实验中的五种脂肪酶候选者。
尽管这三种候选纤维素分布广泛，但观察到种群的平均 FITC 强度存在明显差异。与对照细胞相比，这四种磷酸酶候选物也表现出较高的荧光水平。此外，可以通过流式细胞术来确认 orf 插入载体的碱性磷酸酶活性，观察到的酶命中信号比携带空质粒的细胞更强。
重要的是要记住，通过选择合适的底物和日粮浓度，该技术可以应用于多种酶的筛选。在此程序之后，可以执行其他方法（如下一代测序），以高通量方式回答有关候选酶的鉴定和表征的其他问题。开发后，这种高通量酶筛选技术为酶工程领域的研究人员在不需要酶特异性的情况下探索各种宏基因组酶铺平了道路。
看完这个视频，您应该对如何使用基于减裂回路的高通量筛选系统与广泛的酶靶点有一个很好的了解。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究介绍了一种高通量筛选方法，利用一个通用的遗传酶筛选系统，能够评估200多种酶。该系统通过改变所用的底物来识别各种酶，包括脂肪酶、纤维素酶和碱性磷酸酶。
关键研究组成部分
科学领域
- 酶工程
- 微生物生物技术
- 宏基因组筛选
背景
- 高通量筛选对于评估酶活性至关重要。
- 传统方法通常需要不同酶的不同系统。
- 本研究旨在简化筛选过程。
- 利用单一系统可以提高酶研究的效率。
研究目的
- 开发一种同时筛选多种酶的方法。
- 促进酶工程和宏基因组学的研究。
- 提供比传统筛选技术更有效的替代方案。
所用方法
- 开发遗传酶筛选系统。
- 利用苯并二苯乙烯化合物和GFP报告基进行检测。
- 通过改变所提供的底物筛选酶。
- 测量荧光以评估酶活性。
主要结果
- 成功识别了脂肪酶、纤维素酶和碱性磷酸酶。
- 证明了筛选系统的多功能性。
- 显示该方法可应用于各种酶。
- 验证了使用单一系统对多种酶进行筛选的有效性。
结论
- 所开发的方法显著提高了酶筛选的效率。
- 这种方法可以推进酶工程研究。
- 未来的应用可能包括更广泛的宏基因组学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput genetic enzyme screening enables rapid functional interrogation of metagenomic libraries, supporting early-stage discovery and target validation in enzyme engineering. The universal applicability of the GESS platform streamlines the identification of diverse enzymatic activities, reducing biological ambiguity and accelerating portfolio triage. This approach enhances predictive confidence at the inflection point between discovery and lead identification for biocatalyst development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional screening of metagenomic libraries for novel enzyme activities.
- Supports biological de-risking by linking substrate conversion to quantifiable fluorescence signals.
- Facilitates rapid triage of candidate enzymes for downstream validation.
- Improves predictive confidence in target selection by isolating active clones based on substrate specificity.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-throughput workflow for multi-enzyme screening using flow cytometry.
- Delivers reproducible, quantitative readouts via GFP fluorescence linked to enzymatic activity.
- Enables scalable screening of large metagenomic libraries with minimal assay redesign.
- Prepares validated enzyme candidates for further biochemical and genetic characterization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns enzyme discovery with translational workflows by enabling rapid identification of biocatalysts for industrial or therapeutic applications.
- Supports continuity from functional screening to gene identification and in vitro validation.
- Reduces risk of late-stage failure by confirming activity in relevant biological systems early.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput screening system integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling seamless progression from metagenomic library construction to candidate selection and downstream validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening by linking substrate turnover to fluorescence-based detection.
- Screening: Delivers robust, quantitative outputs suitable for comparative analysis across enzyme classes.
- Analytics: Provides flow cytometry-based statistical outputs for confident hit selection and false positive exclusion.
- Translational Research: Facilitates rapid transition from discovery to preclinical enzyme characterization when relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to a wide range of enzyme targets by substrate selection.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in enzyme target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales enzyme screening workflows for reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation in enzyme discovery portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of enzyme candidates for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in metagenomic library construction and flow cytometry operation.
- Demands access to FACS instrumentation and fluorescence detection infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and substrate selection.
- Adaptable to diverse enzyme classes by modifying substrate inputs and detection thresholds.
- Dependent on robust negative and positive control design to minimize false positives.
