基于高通量基因酶筛选系统的多酶筛选

本方法的总体目标是利用单一的高通量筛选系统评估多种酶。该方法有助于回答微生物学与生物工程领域中关于宏基因组筛选和酶工程的关键问题。我们已开发出一种基因酶筛选系统，该系统包含对苯基化合物响应的MPL突变体及其下游的GFP报告基因。

一旦任何宏基因组基因与提供的底物反应后表现出目标酶活性，反应产物中的苯酚类化合物便会激活Dmp突变体，从而启动GFP报告基因的表达，该信号可轻松通过荧光检测仪捕获。该技术的主要优势在于，与传统筛选方法不同，通过使用适当的底物，这一单一方法即可适用于多种不同类型酶的筛选。本实验操作将由本实验室的研究生Kil Koang Kwon进行演示。

使用fosmid文库构建试剂盒在大肠杆菌（E. coli）中构建宏基因组文库后，将pGESS(E135K)DNA转入宏基因组文库细胞中。随后将转化后的文库细胞以20微升分装，于零下70摄氏度保存。为去除假阳性结果，首先将一份宏基因组文库细胞分装样品置于冰上解冻。

然后将10 µL解冻的细胞接种至含有氨苄青霉素和氯霉素的2 mL溶菌肉汤中，置于14 mL圆底试管内，在37°C、200 RPM条件下培养4小时。同时，在FACS仪器上为宏基因组文库细胞的检测设置相应的参数，并使用默认的FACS软件进行读取。培养结束后，将5 µL细胞转移至5 mL圆底试管中的1 mL PBS溶液中。

然后，上样稀释后的文库样本，并将事件速率为每秒1000至1500个事件。在全局工作表上生成对数缩放的前向散射面积 versus 对数缩放的侧向散射面积散点图时，创建一个点图，并在包含细菌群体的单细胞事件周围绘制多边形门。为了绘制细胞数 versus 对数缩放的FITC-面积直方图，打开一个直方图并调整FITC电压，使钟形分布的峰值低于FITC-面积的10²。

接下来，打开另一个点图，创建一个对数缩放的前向散射面积对数 FITC 面积图，并在分布中心两侧正负 5% 的细胞范围内设置一个 R2 分选门。当所有门均设置完毕后，将含有 1.2 毫升添加抗生素的溶原性肉汤的收集管置于 FACS 仪器出口处，将 1 × 10⁶ 个门控细胞分选至该肉汤中。分选结束后，盖紧收集管并轻轻涡旋混匀细胞。

为了筛选目标宏基因组酶，将分选后的细胞在37摄氏度、200转/分钟条件下培养，直至OD600达到0.5，然后加入1微升拷贝诱导溶液，以扩增细胞内fosmid的拷贝数。在37摄氏度、250转/分钟条件下继续培养3小时后，取0.5毫升菌液与适当底物加入14毫升圆底试管中，使底物终浓度为100微摩尔。随后将对照组和实验组样品在37摄氏度、200转/分钟条件下再孵育3小时。

在样品振荡的同时，按照刚刚演示的方法设置流式细胞仪的参数。然后，从每个样品中取五微升细胞，分别加入含有1毫升PBS的5毫升圆底试管中。接下来，上样并设置事件速率为每秒1000至3000个事件。

创建一个对数缩放的前向散射面积与对数缩放的侧向散射面积的散点图，并调整R1散射门以包含单细胞事件的细菌细胞。然后创建一个对数缩放的前向散射与对数缩放的FITC面积散点图，并设置R2分选门，使少于0.1%的阴性细胞被检测到。现在，加载样品管，并根据需要将事件速率重新调整为每秒1000至3000个事件。

然后在流式细胞仪出口处放置一个含有0.5毫升溶菌肉汤的收集管，收集R1和R2门控范围内的1×10⁴个细胞。当所有细胞收集完毕后，盖上收集管盖，轻轻涡旋混匀细胞。随后将0.5毫升收集的样品分别涂布到两个含有添加抗生素的溶菌肉汤的90毫米琼脂平板上，并在37°C条件下过夜培养。

在本图中，展示了所采用的筛选流程，包括通过阴性分选去除假阳性结果，以及利用 R1 和 R2 分选门进行阳性克隆的筛选。随后可通过比较样品在有无底物条件下的荧光信号来评估筛选结果。在此典型的对硝基苯酚乙酸酯介导的筛选实验中，经底物处理的细胞荧光强度高于对照细胞，由此确认了本实验中五个脂肪酶候选克隆。

尽管这三种纤维素候选物分布广泛，但在群体的平均FITC强度上仍可观察到明显差异。与对照细胞相比，这四种磷酸酶候选物也表现出较高的荧光水平。此外，通过流式细胞术可确认插入orf的载体的碱性磷酸酶活性，酶阳性克隆的荧光信号强于携带空质粒的细胞。

需要牢记的是，通过选择合适的底物和比例浓度，该技术可应用于多种酶的筛选。在此方案基础上，还可进行下一代测序等其他方法，以高通量方式进一步回答有关酶候选物鉴定与表征的问题。该高通量酶筛选技术问世后，为酶工程领域的研究人员探索各类宏基因组来源的酶提供了新途径，且无需预先了解酶的特异性。

观看本视频后，您应能充分理解如何将基于甲硫氨酸循环的高通量筛选系统应用于多种酶靶标。