通过升高眼内压建立小鼠视网膜缺血-再灌注损伤模型

摘要

本文介绍了一种通过升高眼内压在小鼠中诱导视网膜缺血-再灌注损伤的方法。通过升高眼内压造成视网膜缺血-再灌注损伤，可模拟人类视网膜因氧气和营养供应受损所导致的病理状态，使研究人员能够探究视网膜神经血管单元相关人类疾病的潜在细胞机制及治疗方法。

摘要

视网膜缺血-再灌注（I/R）是一种病理生理过程，参与多种眼部疾病中的细胞损伤，包括青光眼、糖尿病性视网膜病变以及视网膜血管阻塞。啮齿类动物的I/R损伤模型为人类I/R损伤的机制及治疗策略提供了重要见解，尤其在视网膜神经血管单元的神经退行性损伤方面。本文介绍一种通过升高眼内压（IOP）在小鼠中诱导视网膜I/R损伤的实验方案。该方案通过针头穿刺眼球前房，并连接一个抬高的生理盐水储液装置进行滴注。利用此滴注系统将IOP升高至超过动脉收缩压水平，操作者可暂时阻断视网膜内层的血流（缺血）。当拔除穿刺针恢复血液循环（再灌注）时，将引发严重的细胞损伤，最终导致视网膜神经退行性变。近期研究表明，炎症反应、血管通透性增加以及毛细血管退化也是该模型的附加特征。与视网膜动脉结扎等其他视网膜I/R建模方法相比，通过升高IOP诱导视网膜I/R损伤具有以下优势： 解剖特异性、实验可操作性和技术可及性，使其成为研究视网膜神经血管单元中神经病理发生机制及治疗的重要工具。

引言

视网膜缺血-再灌注（I/R）是多种人类视网膜疾病的重要特征，包括青光眼、糖尿病性视网膜病变以及视网膜血管阻塞¹。在视网膜I/R过程中，视网膜血管系统血流减少（缺血）会导致视网膜对氧气及其他营养物质出现超敏状态，当血流随后恢复（再灌注）时，会引发严重的氧化应激和炎症损伤²。神经视网膜对这些变化尤为敏感，其中视网膜神经变性可能是I/R所致损伤中最显著的特征。本文介绍一种在小鼠中建立视网膜I/R损伤模型的实验方案。该技术可帮助研究人员探究人类视网膜神经血管单元疾病的潜在机制及治疗策略。

1952年，外科医生为研究手术性贫血的神经退行性后果，首次建立了通过升高眼内压（IOP）诱导啮齿类动物视网膜缺血/再灌注（I/R）的模型³。1991年，该模型被重新确立，旨在标准化缺血损伤后的神经退行性终点指标⁴。这些研究利用生理盐水储液器滴注以升高IOP至超过收缩压，证明加压性眼部灌注足以中断视网膜血液循环，从而引发神经元退变。近年来，利用升高IOP诱导视网膜I/R的研究进一步阐明了I/R所致视网膜神经退行性变的潜在机制^5-12。多个研究团队已报道了其他病理变化，包括炎症反应^13,14、血管通透性增加^15,16以及毛细血管退变^14,17。综上所述，这些研究确立了通过升高IOP诱导的视网膜I/R损伤作为更广泛意义上的视网膜神经....

方案

伦理声明：所有操作均严格遵循约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）制定的指南进行。

注意：拍摄过程中使用的小鼠为杰克逊实验室提供的 C57BL/6 小鼠，但也可使用其他品系或种类的啮齿动物。当使用其他品系或种类时，需注意麻醉剂量和损伤时间进程可能存在差异。应根据品系、物种及实验条件的变化，对缺血/再灌注（I/R）条件进行相应调整。

1. 准备麻醉混合液

1. 在50 ml离心管中加入1.25 ml氯胺酮、0.625 ml赛拉嗪、0.375 ml乙酰丙嗪和22.75 ml磷酸盐缓冲液。
   注意：在本论文其余部分中，该溶液将被称为麻醉混合液。
2. 使用60 ml注射器和0.20 µm滤器将混合液过滤至新的无菌50 ml离心管中。标记并注明此新管的日期。
3. 用铝箔完全包裹混合液管，以防止麻醉剂因光照而降解。 
   注意：该混合液可在室温下保存，并可重复使用，直至其最早过期成分的有效期为止。

2. 准备麻醉增强剂

1. 在50 ml离心管中，加入4 ml氯胺酮和16 ml磷酸盐缓冲液。
   注意：此溶液后续将称为加强剂。
2. 使用60 ml....

结果

通过升高眼内压（IOP）引起的视网膜缺血/再灌注（I/R）的神经退行性效应通常采用两种标准方法进行评估。神经元核的NeuN免疫标记显示，I/R损伤后神经元细胞显著丢失（图1）。简言之，在I/R术后7天摘除眼球，用多聚甲醛固定，以神经元细胞标志物NeuN进行标记，并制备整体装片。使用共聚焦显微镜采集图像，并通过计数¹¹对NeuN标记的细胞进行定量。神经节细胞层神经元数量的减少表明I/R诱导的细胞死亡。

视网膜神经元功能的损伤已通过视网膜电图记录得到证实（图2）。简言之，在缺血/再灌注（I/R）7天后，于不同闪光强度下记录暗适应视网膜电图。a波和b波的振幅通过图像分析软件进行量化¹²。此处，a波和b波振幅的降低表明I/R导致的视网膜神经元功能受损。在这些及其他I/R相关检测指标中，未受I/R处理的眼作为I/R诱导损伤的可靠阴性对照。

讨论

通过升高眼内压（IOP）诱导的视网膜缺血/再灌注 损伤，已被证实可用于模拟啮齿动物视网膜神经血管单元中的细胞损伤与功能障碍，尤其是神经退行性病变。该方法可提供可靠的对照组织，且在技术操作上易于实现。已有研究指出，在本模型及其他缺血/再灌注损伤模型中，增加缺血压力和持续时间可能会加重损伤程度²⁴。因此，部分研究者选择采用与本文所述不同的缺血压力和持续时间^4,6-10,12。正因如此，相较于其他视网膜缺血/再灌注技术，通过升高IOP诱导视网膜缺血/再灌注损伤的优势在于，允许研究者根据特定的实验目标调整手术参数。

尽管如此，已有其他技术被用于在啮齿类动物中诱导视网膜缺血/再灌注（I/R）损伤。通过结扎视神经束^25,26或仅结扎中央视网膜动脉²⁷，可暂时阻断视网膜血流。针对全身性条件的类似策略则需结扎脑动脉²⁸或头臂动脉²⁹，以减少血流而不完全阻断。另一种较少使用的方法是利用两端带有重物的线绳对眼球进行环形压迫³⁰。尽管这些方法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肝素钠注射液，USP	Abraxis Pharmaceutical Products		1,000 USP/ml
BSS 无菌灌注液	Alcon Laboratories, Inc.	9007754-0212	500 ml
SC-2 kg 数字便携式天平	American Weigh Scales, Inc.	SC-2 kg
托吡卡胺眼用溶液 USP 1%	Bausch + Lomb		1% (10 mg/ml)
盐酸丙帕他卡因眼用溶液 USP，0.5%	Bausch + Lomb		0.5% (5 mg/ml)
INTRAMEDIC 聚乙烯导管	Becton Dickinson and Company	427400	内径：427400
30 G 1/2 PrecisionGlide 针头	Benton Dickinson and Company	305106
BC 1 ml TB 注射器，细尖端带皮内斜面针头，26 G × 3/8	Benton Dickinson and Company	309625
BD 60 ml 注射器，鲁尔锁扣式尖端	Benton Dickinson and Company	309653
蔡司 OPMI Visu 200/S8 显微镜	Carl Zeiss AG	000000-1179-101
无菌注射器滤器	Corning Inc.	CLS431224	0.20 µm
Durasorb 吸水垫	Covidien	1038	23 × 24 英寸
酒精棉片	Covidien	6818	双层，中号
学生型 Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	91150-20
哈特曼止血钳	Fine Science Tools	13002-10
初级输液管路，大孔径，预穿刺 Y 型接口，80 英寸	Hospira	12672-28
磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 (1x)	Invitrogen	10010-049	500 ml
蒸馏水	Invitrogen	15230-204	500 ml
C57BL/6J 小鼠	The Jackson Laboratory	664
AnaSed 注射液：无菌赛拉嗪溶液	LLOYD, Inc.		20 mg/ml
润滑胶，水溶性抑菌型	MediChoice		3 克/袋
NAMIC 血管造影压力监测三通阀	Navilyst Medical, Inc.	70039355	五阀三通，带七个母端接口
Goniosoft，羟丙基甲基纤维素 2.5% 眼用润肤溶液：羟丙基甲基纤维素	OCuSOFT, Inc.		2.5% (25 mg/ml)
Ketaset CIII：盐酸氯胺酮	Pfizer, Inc.		100 mg/ml
Trans-Pal I.V. 输液架	Pryor Products	372	配备自制的 60 厘米不锈钢延长杆
乙酰丙嗪：马来酸乙酰丙嗪注射液，USP	Vet One		10 mg/ml
V-Top 手术台/液压可调式	VSSI	100-4041-21
管路接头，鲁尔公头转鲁尔公头	Warner Instruments	64-1579