我们介绍了一种可视化方法，用于观察在聚乙二醇（PEG）和亲和素包被的玻璃表面固定并经微流控剪切流拉伸的、由荧光蛋白DNA结合肽（FP-DBP）染色的大分子DNA。
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本文内容
摘要
摘要
固定在功能化玻璃表面的大片段DNA分子已被广泛应用于聚合物物理学和生物化学领域，特别是用于研究DNA与其结合蛋白之间的相互作用。本文报道了一种利用荧光显微镜对固定在表面的大片段DNA分子进行可视化的实验方法。首先，将盖玻片进行生物素化处理，并通过包被生物素化的聚乙二醇（biotinylated polyethylene glycol）实现钝化，该涂层可通过亲和素蛋白连接子特异性结合生物素化的DNA，同时显著减少蛋白质或DNA分子在表面的非特异性吸附。其次，根据DNA末端结构的不同，采用两种不同方法对DNA分子进行生物素标记：对于平末端DNA，利用末端转移酶在其3'羟基末端掺入生物素标记的dUTP进行标记；而对于黏性末端DNA，则通过DNA连接酶将其与生物素标记的互补寡核苷酸杂交实现标记。最后，在使用荧光蛋白-DNA结合肽（FP-DBP）染色后，通过微流控剪切流使单个DNA分子充分伸展至其轮廓全长，便于观察。
引言
在玻璃或微珠表面固定大型DNA分子的可视化技术已被用于研究DNA-蛋白质相互作用、蛋白质在DNA底物上的动态行为1,2以及聚合物物理特性3,4。相较于其他DNA固定方法，单分子锚定的大型DNA平台具有若干显著优势5。首先，锚定在表面的大型DNA分子在无剪切流条件下呈现天然的无规卷曲构象，这对于DNA结合蛋白识别其结合位点至关重要。其次，在流动池中对DNA分子周围的化学环境进行多次酶促反应所需的调控极为简便。第三，微流控剪切流可使DNA分子拉伸至其完整轮廓长度的100%，而这一程度在其他DNA拉伸方法（如表面固定6和纳米通道限域7）中极难实现。完全拉伸的DNA分子还可提供位置信息，有助于在基因组图谱上监测酶的移动过程。
然而，DNA 纽结固定技术存在一个关键缺陷，即嵌入性染料（如 YOYO-1）通常会导致被固定的 DNA 分子在荧光激发光照射下容易断裂。一般而言，大分子 DNA 必须用荧光染料染色，才能在荧光显微镜下进行观察。为此，主要使用 YOYO-1 或其他 TOTO 系列染料，因为这些染料仅在嵌入双链 DNA 时才会产生荧光8。然而，众所周知，双嵌入染料由于荧光团的嵌入作用，会引起光诱导的 DNA 光裂解9。此外，固定在表面的荧光染色 DNA 分子更加脆弱，因为剪切流会对自由移动的 DNA 分子施加断裂力。因此，我们开发了 FP-DBP 作为一种新型的表面固定大分子 DNA 成像用 DNA 染色蛋白染料。使用 FP-DBP 的优势在于，它不会导致其所结合的 DNA 分子发生光裂解10。此外，FP-DBP 不会增加 DNA 的轮廓长度，而双嵌入染料则会使轮廓长度增加约 33%。
本视频方法介绍了将大片段DNA分子固定在PEG-生物素表面的实验方法。图1展示了使用平末端和黏性末端固定DNA的不同方法。因此，该染色方法可适用于任何类型的DNA分子。图2描绘了流动腔室组装的示意图，可通过注射泵控制以产生剪切流，从而拉伸DNA分子，并用于加载化学试剂和酶溶液。图3展示了在聚乙二醇修饰的表面上完全拉伸并用FP-DBP染色的DNA分子的显微图像11。
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方案
1. DNA 生物素标记
- 使用末端转移酶（TdT）对平末端DNA进行生物素标记
注意：使用T4 DNA（166 kbp），其为平末端DNA。- 向反应体系中加入5 µl 2.5 mM CoCl2、5 µl 10×反应缓冲液、0.5 µl 10 mM biotin-11-dUTP、0.5 µl 末端转移酶（10单位）和0.5 µl T4 DNA（0.5 µg/µl）。加入38.5 µl水，使终体积为50 µl。
- 将反应体系在37 °C孵育1小时。
注意：延长反应时间可能导致双端连接的DNA，i.e.，生物素可能在两端均被标记。 - 加入5 µl 0.5 M EDTA（pH 8）以终止反应。
- 将反应管置于4 °C保存。
- 使用DNA连接酶对黏性末端DNA进行生物素标记
注意：使用λ DNA（48.5 kbp），其为黏性末端DNA。- 加入1 µl T4 DNA连接酶、5 µl 10×连接缓冲液、1 µl 25 ng/µl λ噬菌体DNA，并加入43 µl水，使终体积为50 µl。
- 将反应管置于4 °C保存。
2. 功能化表面衍生化
注意：为了将DNA分子的一端固定在玻璃表面，需先在盖玻片上进行伯胺基团的硅烷化处理，随后进行生物素-聚乙二醇（biotin-PEG）包被，如图1所示。该PEG化过程对于单分子DNA成像至关重要，因为它能显著降低非目标分子在表面非特异性吸附所产生的随机噪声。
- 食人鱼溶液清洗
注意：食人鱼溶液会与有机物剧烈反应，因此必须小心操作，并遵循适当的安全规范。- 将盖玻片放置在聚四氟乙烯（PTFE）支架上，并用PTFE生料带沿长度方向固定，一半在盖玻片边缘，一半在支架上。缠绕后，留出一段较长的生料带（约5 cm），以便在清洗过程中操作支架。
- 在通风橱中，向一个1 L玻璃烧杯中加入350 ml H2SO4和150 ml H2O2，配制食人鱼溶液。将支架放入食人鱼溶液中处理2小时。
- 将烧杯中的食人鱼溶液倒出，用去离子水彻底冲洗盖玻片，直至烧杯中水的pH值达到中性。使用pH试纸检测。
- 将装有盖玻片的支架在盛有水的烧杯中超声处理30分钟。在进行氨基硅烷化前，将水倒出。使用75 W的超声功率以清洁和衍生化玻璃基底。
- 玻璃表面的氨基硅烷化
- 在洁净的聚丙烯容器中，向200 ml甲醇中加入2 ml N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺和10 ml冰醋酸，配制氨基硅烷化溶液。
- 将清洗后的盖玻片放入聚丙烯容器中，在100 rpm转速下室温振荡反应30分钟。
- 将含有衍生化盖玻片的烧杯在75 W功率下超声处理15分钟，随后在100 rpm转速下室温振荡至少30分钟。
- 倒出溶液，先用甲醇小心冲洗一次，再用乙醇冲洗两次。将盖玻片保存在乙醇中，并在两周内使用。
- 盖玻片的聚乙二醇化（PEGylation）
- 配制10 ml 0.1 M碳酸氢钠（NaHCO3）溶液，并使用0.22 µm针头滤器过滤。
- 将2 mg生物素-聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯（biotin-PEG-SC）和80 mg聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（mPEG-SVG）溶解于350 µl NaHCO3溶液中。使用避光离心管。
- 剧烈涡旋振荡管子10秒，然后在10,000 × g下离心1分钟以去除气泡。
- 先用丙酮冲洗载玻片，再用乙醇冲洗。让载玻片在空气中完全干燥。
- 在洁净的载玻片上滴加一滴（50 µl）PEG溶液，轻轻覆盖经氨基硅烷化的盖玻片，避免产生气泡。
- 将载玻片置于黑暗、水平且湿度充足的密闭容器中，室温下反应3小时至过夜。可使用空的移液枪头盒作为密闭容器，并在底部放置水。将剩余的PEG溶液密封后保存于4 °C。
- 用去离子水彻底冲洗PEG化的盖玻片，保存于避光干燥处，待用。
3. 组装流室
- 制作一个带孔的亚克力支架，如图2所示。确保管路插入部分的直径为0.762 mm，并指定其中一个孔为入口，另一个孔为出口（图2）。
- 在亚克力支架上粘贴双面胶带条（宽度5–6 mm）（图2），使其垂直于入口和出口孔排列，且不遮挡任何通道孔。利用这些胶带条作为多通道的侧壁以形成腔室。使用移液器吸头擦拭胶带表面。
- 将一片PEG修饰的盖玻片置于顶部，形成流动腔室，注意将PEG修饰面朝下。
- 为防止溶液泄漏，将盖玻片顶部压紧在双面胶带所在区域，并在腔室顶部和底部边缘涂抹快干环氧树脂胶（图2中黄色部分）以密封。
- 将一段短管（2.5 cm长，外径OD为0.042"）连接至气密注射器，并用环氧树脂胶密封连接处。
- 将一段长的柔性管（外径OD：0.03"）连接至与注射器相连的管路上，并用环氧树脂胶密封连接处。
- 用去离子水填充与注射器相连的管路，确保无气泡存在。
- 将该管路插入由环氧树脂胶密封的流动腔室孔中。
- 在另一孔上安装一个黄色吸头（200 µl吸头），作为储液 reservoir。
4. 将样品载入流体腔室
注意：Neutravidin 可以替换为其他亲和素蛋白，例如链霉亲和素（streptavidin）。所有反应均可在室温下进行，除非另有说明。用黄色吸头吸取样品溶液，并将装有溶液的吸头安装到丙烯酸支架的孔中（图 2b）。
- 将注射泵的流速设置为 50 µl/min。加入 20 µl 链霉亲和素蛋白（25 µg/ml，溶于 T50 溶液，含 10 mM Tris、50 mM NaCl，pH 8），孵育 10 分钟。
- 加入 20 µl 生物素化寡脱氧核苷酸（100 µM，溶于 1× TE 缓冲液），孵育 10 分钟。若使用末端转移酶，则跳过寡脱氧核苷酸的加入步骤。
- 以 10 µl/min 的流速将第 1 步中的 20 µl DNA 溶液注入流动池，并孵育 30 分钟。
- 用 1× TE 缓冲液清洗流动池，然后加入 40 µl FP-DBP10 溶液（浓度约 80 nM）。
- 在荧光显微镜下观察 DNA，使用 60 倍物镜，并在 1× TE 缓冲液中持续引入染色分子。采用 488 nm 固态激光器激发 FP(eGFP)-DBP。为实现 DNA 分子的完全伸展，根据所用 DNA 长度调整不同的流速。例如，对于 48.5 kbp 的 λ DNA，使用 50 µl/min 的流速；对于 166 kbp 的 T4 DNA，使用 100 µl/min 的流速。
- 如需回收利用丙烯酸支架，将组装好的流动池浸泡于家用洗涤剂溶液12中。用剃刀刀片去除胶带和环氧树脂，并用手揉搓以彻底清除。用注射器针头疏通孔洞。将支架保存在去离子水中，待后续使用。
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结果
图1展示了两种不同的DNA固定方法，具体取决于DNA分子的末端结构。图1a说明了黏性末端DNA分子如何与固定在亲和素包被的PEG表面的互补生物素化寡核苷酸进行杂交。图1b展示了末端转移酶将生物素化的ddNTP或dNTP添加到平末端DNA的3'羟基上的过程。我们在DNA分子与生物素之间加入了柔性连接子，以提高连接效率和亲和素-生物素结合效率，并为反应提供足够的空间。图1c展示了DNA在亲和素包被的PEG表面上固定的总体示意图。
图2展示了流动室及其丙烯酸树脂支架的组装。与玻璃/石英载玻片相比，定制的丙烯酸树脂支架简化了用于落射荧光显微镜观察的流动室的制备过程12。该流动室可实现酶反应缓冲条件的即时更换6，以及DNA分子的拉伸。
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讨论
本文介绍了一种用于可视化表面锚定的生物素化长片段DNA分子的平台。我们此前报道过一种方法，利用生物素化的牛血清白蛋白将DNA分子固定在链霉亲和素蛋白包被的表面上6。在早期方法中，我们发现了一个关键问题：用于染色表面固定DNA分子的双插层染料会引起DNA的光切割。由于这些持续被激发的荧光基团极易攻击DNA的磷酸骨架9，因此必须尽量降低激发光功率以避免光切割。
为克服这一不便，我们开发了具有DNA结合能力的基因工程荧光蛋白（FP-DBP），用于无需光裂解的DNA染色。10 我们在链霉亲和素包被的蛋白表面观察到可靠的DNA染色效果。然而，该平台存在荧光蛋白在蛋白表面发生非特异性聚集的问题，导致背景噪声升高。为了提高单分子DNA分析中DNA与蛋白相对于背景的对比度，必须最大限度地降低此类随机噪声。因此，使用FP-DBP时需对表面进行钝化处理，以防止荧光蛋白吸附于表面。聚乙二醇（PEG）可能是实现该目的的有效候选材料。12 因此，我们采用了生物素化PEG，显著提高了对表面锚定的FP-DBP染色DNA分子成...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了201410036号Sogang大学研究基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1. DNA生物素标记 | |||
| 1.1) 使用末端转移酶（TdT）对平末端DNA进行生物素标记 | |||
| 末端转移酶 | New England Biolabs | M0315S | 附带10×反应缓冲液、2.5 mM氯化钴 |
| 生物素-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | 也可使用生物素-ddNTP |
| T4GT7噬菌体DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) 使用DNA连接酶对黏性末端DNA进行生物素标记 | |||
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | M0202S | 附带10×反应缓冲液 |
| λ噬菌体DNA | Bioneer | D-2510 | New England Biolabs亦有供应 |
| 2. 功能化表面的衍生化 | |||
| 2.1) Piranha清洗 | |||
| 盖玻片 | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22 mm × 22 mm，No. 1厚度 |
| 聚四氟乙烯（Teflon）支架 | 定制加工 | ||
| 聚四氟乙烯密封带 | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™胶带 |
| 硫酸 | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4，95%纯度 |
| 过氧化氢 | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2，水溶液中35% |
| 超声波清洗器 | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | 台式超声清洗机 |
| 2.2) 玻璃表面的氨基硅烷化 | |||
| N-[3-(三甲氧基硅基)丙基] 乙二胺 | Sigma-Aldrich | 104884 | |
| 冰醋酸 | Duksan Chemicals | 414 | 99%纯度 |
| 甲醇 | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9%纯度 |
| 聚丙烯容器 | Qorpak | PLC-04907 | |
| 乙醇 | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9%纯度 |
| 2.3) 盖玻片的PEG修饰 | |||
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 注射器滤器 | Sartorius | 16534----------K | |
| 生物素-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| 丙酮 | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99%纯度 |
| 显微镜载玻片 | Marienfeld-Superior | 1000612 | 约76 mm × 26 mm × 1 mm |
| 3. 流动腔室的组装 | |||
| 丙烯酸支撑板 | 定制加工 | ||
| 双面胶带 | 3M | 透明型 | |
| 快干环氧树脂 | 3M | ||
| 聚乙烯管 | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| 气密式250 µl注射器 | Hamilton | 81165 | |
| 注射泵 | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 4. 样品加载至流动腔室 | |||
| 中性亲和素（Neutravidin） | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris碱 | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma碱 |
| 显微镜 | Olympus | IX70 | |
| EMCCD相机 | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
| 固态激光器（488 nm） | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox清洗剂 | Alconox Inc. |
参考文献
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