表面锚定的大分子DNA与荧光蛋白DNA结合肽的可视化

摘要

我们介绍了一种可视化方法，用于观察在聚乙二醇（PEG）和亲和素包被的玻璃表面固定并经微流控剪切流拉伸的、由荧光蛋白DNA结合肽（FP-DBP）染色的大分子DNA。

摘要

固定在功能化玻璃表面的大片段DNA分子已被广泛应用于聚合物物理学和生物化学领域，特别是用于研究DNA与其结合蛋白之间的相互作用。本文报道了一种利用荧光显微镜对固定在表面的大片段DNA分子进行可视化的实验方法。首先，将盖玻片进行生物素化处理，并通过包被生物素化的聚乙二醇（biotinylated polyethylene glycol）实现钝化，该涂层可通过亲和素蛋白连接子特异性结合生物素化的DNA，同时显著减少蛋白质或DNA分子在表面的非特异性吸附。其次，根据DNA末端结构的不同，采用两种不同方法对DNA分子进行生物素标记：对于平末端DNA，利用末端转移酶在其3'羟基末端掺入生物素标记的dUTP进行标记；而对于黏性末端DNA，则通过DNA连接酶将其与生物素标记的互补寡核苷酸杂交实现标记。最后，在使用荧光蛋白-DNA结合肽（FP-DBP）染色后，通过微流控剪切流使单个DNA分子充分伸展至其轮廓全长，便于观察。

引言

在玻璃或微珠表面固定大型DNA分子的可视化技术已被用于研究DNA-蛋白质相互作用、蛋白质在DNA底物上的动态行为^1,2以及聚合物物理特性^3,4。相较于其他DNA固定方法，单分子锚定的大型DNA平台具有若干显著优势⁵。首先，锚定在表面的大型DNA分子在无剪切流条件下呈现天然的无规卷曲构象，这对于DNA结合蛋白识别其结合位点至关重要。其次，在流动池中对DNA分子周围的化学环境进行多次酶促反应所需的调控极为简便。第三，微流控剪切流可使DNA分子拉伸至其完整轮廓长度的100%，而这一程度在其他DNA拉伸方法（如表面固定⁶和纳米通道限域⁷）中极难实现。完全拉伸的DNA分子还可提供位置信息，有助于在基因组图谱上监测酶的移动过程。

然而，DNA 纽结固定技术存在一个关键缺陷，即嵌入性染料（如 YOYO-1）通常会导致被固定的 DNA 分子在荧光激发光照射下容易断裂。一般而言，大分子 DNA 必须用荧光染料染色，才能在荧光显微镜下进行观察。为此，主要使用 YOYO-1 或其他 TOTO 系列染料，因为这些染料仅在嵌入双链 DNA 时才会产生荧光⁸。然而，众所周知，双嵌入染料由于荧光团的嵌入作用，会引起光诱导的 DNA 光裂解⁹。此外，固定在表面的荧光染色 DNA 分子更加脆弱，因为剪切流会对自由移动的 DNA 分子施加断裂力。因此，我们开发....

方案

1. DNA 生物素标记

1. 使用末端转移酶（TdT）对平末端DNA进行生物素标记
   注意：使用T4 DNA（166 kbp），其为平末端DNA。
   1. 向反应体系中加入5 µl 2.5 mM CoCl₂、5 µl 10×反应缓冲液、0.5 µl 10 mM biotin-11-dUTP、0.5 µl 末端转移酶（10单位）和0.5 µl T4 DNA（0.5 µg/µl）。加入38.5 µl水，使终体积为50 µl。
   2. 将反应体系在37 °C孵育1小时。
      注意：延长反应时间可能导致双端连接的DNA，i.e.，生物素可能在两端均被标记。
   3. 加入5 µl 0.5 M EDTA（pH 8）以终止反应。
   4. 将反应管置于4 °C保存。
2. 使用DNA连接酶对黏性末端DNA进行生物素标记
   注意：使用λ DNA（48.5 kbp），其为黏性末端DNA。
   1. 加入1 µl T4 DNA连接酶、5 µl 10×连接缓冲液、1 µl 25 ng/µl λ噬菌体DNA，并加入43 µl水，使终体积为50 µl。
   2. 将反应管置于4 °C保存。

结果

图1展示了两种不同的DNA固定方法，具体取决于DNA分子的末端结构。图1a说明了黏性末端DNA分子如何与固定在亲和素包被的PEG表面的互补生物素化寡核苷酸进行杂交。图1b展示了末端转移酶将生物素化的ddNTP或dNTP添加到平末端DNA的3'羟基上的过程。我们在DNA分子与生物素之间加入了柔性连接子，以提高连接效率和亲和素-生物素结合效率，并为反应提供足够的空间。图1c展示了DNA在亲和素包被的PEG表面上固定的总体示意图。

图2展示了流动室及其丙烯酸树脂支架的组装。与玻璃/石英载玻片相比，定制的丙烯酸树脂支架简化了用于落射荧光显微镜观察的流动室的制备过程¹²。该流动室可实现酶反应缓冲条件的即时更换⁶，以及DNA分子的拉伸。

讨论

本文介绍了一种用于可视化表面锚定的生物素化长片段DNA分子的平台。我们此前报道过一种方法，利用生物素化的牛血清白蛋白将DNA分子固定在链霉亲和素蛋白包被的表面上⁶。在早期方法中，我们发现了一个关键问题：用于染色表面固定DNA分子的双插层染料会引起DNA的光切割。由于这些持续被激发的荧光基团极易攻击DNA的磷酸骨架⁹，因此必须尽量降低激发光功率以避免光切割。

为克服这一不便，我们开发了具有DNA结合能力的基因工程荧光蛋白（FP-DBP），用于无需光裂解的DNA染色。¹⁰ 我们在链霉亲和素包被的蛋白表面观察到可靠的DNA染色效果。然而，该平台存在荧光蛋白在蛋白表面发生非特异性聚集的问题，导致背景噪声升高。为了提高单分子DNA分析中DNA与蛋白相对于背景的对比度，必须最大限度地降低此类随机噪声。因此，使用FP-DBP时需对表面进行钝化处理，以防止荧光蛋白吸附于表面。聚乙二醇（PEG）可能是实现该目的的有效候选材料。¹² 因此，我们采用了生物素化PEG，显著提高了对表面锚定的FP-DBP染色DNA分子成.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1. DNA生物素标记
1.1) 使用末端转移酶（TdT）对平末端DNA进行生物素标记
末端转移酶	New England Biolabs	M0315S	附带10×反应缓冲液、2.5 mM氯化钴
生物素-11-dUTP	Invitrogen	R0081	也可使用生物素-ddNTP
T4GT7噬菌体DNA	Nippon Gene	318-03971
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) 使用DNA连接酶对黏性末端DNA进行生物素标记
T4 DNA连接酶	New England Biolabs	M0202S	附带10×反应缓冲液
λ噬菌体DNA	Bioneer	D-2510	New England Biolabs亦有供应
2. 功能化表面的衍生化
2.1) Piranha清洗
盖玻片	Marienfeld-Superior	0101050	22 mm × 22 mm，No. 1厚度
聚四氟乙烯（Teflon）支架			定制加工
聚四氟乙烯密封带	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™胶带
硫酸	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4，95%纯度
过氧化氢	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2，水溶液中35%
超声波清洗器	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	台式超声清洗机
2.2) 玻璃表面的氨基硅烷化
N-[3-(三甲氧基硅基)丙基] 乙二胺	Sigma-Aldrich	104884
冰醋酸	Duksan Chemicals	414	99%纯度
甲醇	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	99.9%纯度
聚丙烯容器	Qorpak	PLC-04907
乙醇	Jin Chemical Co. Ltd.	A300202	99.9%纯度
2.3) 盖玻片的PEG修饰
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
注射器滤器	Sartorius	16534----------K
生物素-PEG-SC	Laysan Bio	Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
丙酮	Jin Chemical Co. Ltd.	A300129	99%纯度
显微镜载玻片	Marienfeld-Superior	1000612	约76 mm × 26 mm × 1 mm
3. 流动腔室的组装
丙烯酸支撑板			定制加工
双面胶带	3M		透明型
快干环氧树脂	3M
聚乙烯管	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
气密式250 µl注射器	Hamilton	81165
注射泵	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. 样品加载至流动腔室
中性亲和素（Neutravidin）	Thermo Scientific	31000
Tris碱	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizma碱
显微镜	Olympus	IX70
EMCCD相机	Q Imaging	Rolera EM-C2
固态激光器（488 nm）	Oxxius	LBX488
Alconox清洗剂	Alconox Inc.