表面拴DNA大分子的可视化与荧光蛋白的DNA结合肽
2016年6月23日
我们提出了一种可视化荧光蛋白 DNA 结合肽 （FP-DBP） 染色的大 DNA 分子的方法，这些分子拴在聚乙二醇 （PEG） 和亲和素涂层的玻璃表面，并用微流体剪切流拉伸。
该程序的总体目标是为落射荧光显微镜制作一个方便的 DNA 分析系统，以纵改性玻璃表面上的单分子 DNA。这种方法可以帮助回答 DNA 可视化领域的关键问题。当检查 DNA 自身以及 DNA 结合蛋白和其他小分子时。
该技术的主要优点是能够轻松观察和分析移动的 DNA。首先，将玻璃盖玻片放在 PTFE 架上，并使用一块 PTFE 螺纹密封胶带将其固定到位。包裹盖玻片后，留下一条 5 厘米长的胶带，用于在清洁过程中处理架子。
在通风橱中，将 350 毫升硫酸和 150 毫升过氧化氢混合在一个 1 升玻璃烧杯中，制成食人鱼蚀刻溶液。然后，将盖玻片架放入溶液中。两小时后，清空烧杯并用去离子水彻底冲洗盖玻片。
继续冲洗盖玻片，直到烧杯中水的 PH 值达到中性 PH 值。然后，在装有水的烧杯中对盖玻片架进行超声处理 30 分钟，以清洁和衍生玻璃基板。在氨基硅烷化之前，从烧杯中倒空水。首先，在干净的聚丙烯容器中加入 2 毫升烷氧基硅烷和 10 毫升冰醋酸到 200 毫升甲醇中，制备氨基硅烷化溶液。
然后将干净的盖玻片放入溶液中。然后，将清洗过的盖玻片放入准备好的溶液中，在室温和 100 rpm 下摇晃 30 分钟。接下来，用衍生化的盖玻片以 75 W 的功率对容器进行 15 分钟的超声处理。
然后，在室温和 100 rpm 下再次摇晃它们至少 30 分钟。完成后，清空烧杯中的溶液，并小心地冲洗盖玻片 3 次。一次用甲醇，用乙醇两次。
最后一次冲洗后，将盖玻片储存在乙醇中，并在两周内使用。首先，制备 10 毫升 0.1 摩尔的碳酸氢钠溶液，并通过 0.22 微米的注射器过滤器过滤。然后，将 2 毫克生物素 PEG 琥珀酰亚胺碳酸酯和 80 毫克 PEG 琥珀酰亚胺戊酸酯溶解到 350 微升过滤的碳酸氢钠溶液中。
使用避光管保护溶液免受光线照射。用力涡旋试管 10 秒钟，然后以 10， 000 x g 离心 1 分钟以去除任何气泡。接下来，用丙酮冲洗载玻片，然后用乙醇冲洗。
冲洗后，让载玻片完全风干。将 50 微升 PEG 溶液滴到干净的载玻片上。将氨基硅烷化盖玻片以一个小角度缓慢地降低到液滴上，以免在盖玻片下产生任何气泡。
然后，将玻片放入水平、黑暗和加湿的室中，在室温下放置至少 3 小时至过夜。完成后，将残留的 PEG 溶液密封在避光管中，并保持在四摄氏度。孵育后，用去离子水彻底冲洗聚乙二醇化盖玻片，然后将它们存放在黑暗干燥的地方直至使用。
为了创建流动室，将双面胶带条放在亚克力支架上，使其垂直于入口和出口孔对齐，并且不会干扰任何通道孔。然后，使用移液管吸头擦拭胶带以密封通道。接下来，将聚乙二醇化盖玻片，聚乙二醇化面朝下，放在胶带顶部，以形成流动室。
为防止任何溶液泄漏，请将盖玻片的顶部压在放置双面胶带的区域上。然后，在腔室的边缘添加快干的环氧树脂胶水，以将其固定到位。接下来，将一根 2.5 厘米长的管子连接到气密注射器上，并用环氧树脂胶密封接头。
然后，将一根长软管连接到来自注射器的管子上。再次，用环氧树脂胶密封接头。用去离子水填充连接到注射器的管路，确保没有气泡。
接下来，将管子插入用环氧树脂胶密封的流通室孔中。并将 200 微升移液器吸头放在另一个孔上，用作储液器。将注射泵的流速设置为每分钟 50 微升。
然后，将 20 μL 亲和素蛋白溶液流入腔室中，并保持 10 分钟。接下来，将 20 μL 生物素化寡核苷酸装入注射器中。将其倒入腔室，并保持 10 分钟。
如果使用末端转移酶，则跳过寡核苷酸的加载。然后，将 20 μL DNA 溶液装入注射器中，以每分钟 10 μL 的速度将其流入腔室，并保持 30 分钟。孵育 30 分钟后，用 40 μL 1X TE 缓冲液以每分钟 50 μL 的速度洗涤流通室。
洗涤后，在腔室中加入 40 微升浓度为 80 纳摩尔的相同 FP-DBP，在 1X 中 TE.To 看到 DNA 分子的整个拉伸范围，根据使用的 DNA 长度应用不同的流速。使用荧光显微镜在 60 倍物镜下观察 DNA。这是一段荧光显微镜视频，显示了噬菌体 lambda DNA 分子，拴在表面，在与生物素化互补寡核苷酸连接后被流动拉伸。
在流速下，完全拉长的 DNA 分子的长度为 16.5 微米。相比之下，噬菌体 T4 DNA 软核菌在流下伸长至 56.4 微米的长度。这种延伸是可逆的，DNA 可以多次延伸和松弛。
观看本视频后，您应该对如何在大型 DNA 分析中使用 FP-DBP 以及演示 DNA 聚合物的拉伸和松弛有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种用于可视化荧光蛋白DNA结合肽（FP-DBP）染色的大型DNA分子的方法。该技术涉及将这些分子固定在聚乙二醇（PEG）和卵磷脂涂层的玻璃表面上，并使用微流控剪切流来拉伸它们。
关键研究组成部分
科学领域
- DNA可视化
- 荧光显微镜
- 单分子操作
背景
- 该研究专注于分析DNA和DNA结合蛋白。
- 旨在提高DNA分析系统的便利性。
- 该方法允许观察移动的DNA。
- 它是为使用附加荧光显微镜而设计的。
研究目的
- 开发用于操作单分子DNA的系统。
- 增强DNA和相关蛋白的可视化。
- 促进DNA动力学的分析。
使用的方法
- 在PTFE架上准备玻璃盖片。
- 用PTFE螺纹密封胶带固定盖片。
- 修改后的玻璃表面的清洁程序。
- 利用微流控剪切流来拉伸DNA。
主要结果
- 成功地在修改后的表面上固定大型DNA分子。
- 使用FP-DBP染色有效地可视化DNA动力学。
- 增强了对实时移动DNA的分析能力。
- 展示了该方法在DNA研究中的潜力。
结论
- 该技术为DNA可视化提供了一种新的方法。
- 它提供了有关DNA与结合蛋白相互作用的见解。
- 这种方法可以推进分子生物学领域的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct visualization of surface-tethered large DNA molecules using fluorescent protein DNA binding peptides (FP-DBP) enables precise interrogation of DNA-protein interactions at the single-molecule level. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma discovery pipelines. The method enhances predictive confidence for downstream assay development and screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of DNA-protein binding events for mechanistic clarification.
- Supports functional validation of DNA-binding targets in a controlled environment.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of molecular interactions relevant to disease pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for preparing validated DNA substrates for high-content assays.
- Enables quantitative measurement of DNA stretching and relaxation under defined conditions.
- Supports standardization and scalability for compound screening targeting DNA-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by modeling DNA-protein dynamics at the single-molecule level.
- Offers continuity from discovery through preclinical validation for DNA-targeting modalities.
- Reduces biological ambiguity in early-stage risk assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to assay development and preclinical research, supporting lead identification and target validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing DNA-protein interactions.
- Screening: Delivers assay-ready, surface-tethered DNA substrates with quantitative readouts.
- Analytics: Provides real-time measurement of DNA elongation and relaxation for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical model validation when DNA-protein interactions are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse DNA-binding protein studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes DNA visualization workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by clarifying early-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of DNA-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, microfluidics, and fluorescence microscopy.
- Demands access to epifluorescent microscopes and microfluidic flow control systems.
- Necessitates cross-team standardization of surface preparation and DNA labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different DNA lengths or binding protein classes.
- Surface passivation and non-specific binding reduction are critical for reliable outputs.
