小鼠骨髓来源的GM-CSF诱导类肺泡巨噬细胞和树突状细胞的生成与鉴定

摘要

在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下培养的骨髓细胞可形成包含巨噬细胞和树突状细胞（DCs）的异质性细胞群。本方法重点利用主要组织相容性复合物II类分子（MHCII）和透明质酸（HA）结合能力来区分GM-CSF培养体系中的巨噬细胞与树突状细胞。该培养体系中的巨噬细胞在诸多特性上与肺泡巨噬细胞相似。

摘要

巨噬细胞和树突状细胞（DCs）是存在于组织和淋巴器官中的天然免疫细胞，在抵御病原体方面发挥关键作用。然而，这些细胞难以大量分离，因而难以对其进行深入研究，因此， 体外 已开发出多种模型。 体外 骨髓来源的巨噬细胞和树突状细胞培养是免疫学研究中成熟且有价值的方法。本文介绍一种利用细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）从原代小鼠骨髓细胞的单一培养体系中同时培养并鉴定树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法。该方案基于Lutz最初建立的经典实验流程。 等1999年用于骨髓来源的树突状细胞（DCs）。该培养物具有异质性，使用MHCII和荧光素标记的透明质酸（FL-HA）来区分巨噬细胞与未成熟及成熟DCs。这些由GM-CSF诱导产生的巨噬细胞提供了方便的来源 体外 在表型和功能上均与肺泡巨噬细胞高度相似的衍生巨噬细胞。

引言

若干 体外 已有文献描述了使用一种或多种生长因子培养生成骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的方法。通过在培养体系中加入巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），可由骨髓细胞诱导生成BMDMs。^1,2对于骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），在骨髓培养中添加FLT3配体可产生非黏附性的经典型和浆细胞样树突状细胞（CD11c^高/MHCII^高 和 CD11c^lo，B220⁺ 培养9天后^3,4相比之下，仅在含有GM-CSF的培养条件下培养7至10天后产生的非贴壁细胞^5,6，GM-CSF 和 IL-4⁷，或 GM-CSF 和 FLT3 配体^8,9 生成更类似于炎性树突状细胞（CD11c^高，MHCII^高 CD11b⁺)¹⁰. 尽管这些 体外 在利用培养物生成巨噬细胞或树突状细胞时，尚不明确每种培养条件是否均能产生纯细胞群体。例如，尽管GM-CSF培养物中的贴壁细胞通常被描述为巨噬细胞⁵同一培养物中的非贴壁细胞用作树突状细胞（DCs）^6,11-13，假定它们是均一的，任何观察到的变异均源于发育阶段的差异^14,....

方案

小鼠的安乐死操作严格遵循加拿大动物护理委员会（Canadian Council on Animal Care）关于伦理动物研究的指南，并经不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会批准的程序进行。

1. 从小鼠股骨和胫骨获取单细胞骨髓悬液

1. 在操作开始前15分钟开启生物安全柜（BSC），以净化柜内空气并使气流稳定，随后用70%乙醇清洁/喷洒BSC表面。在整个实验过程中尽可能保持无菌状态。不得在非无菌条件下切割骨骼。
2. 在BSC内准备好解剖工具，包括浸泡于70%乙醇中的解剖剪（1把）和镊子（2对）、含5%胎牛血清的Hank’s平衡盐溶液（HBSS-FCS）、无菌培养皿（100 mm × 15 mm）、1 ml注射器、26½号针头、锥形收集管（15 ml或50 ml）以及纸巾。
3. 按照所在机构动物研究伦理委员会批准的程序处死小鼠，将其移入BSC中，放置在一张或两张纸巾上，并用70%乙醇喷洒小鼠体表。
4. 在BSC内无菌打开一个无菌培养皿，将10 ml HBSS-FCS加入皿底，另取1–2 ml加入皿盖中。
5. 将小鼠腹部朝下放置，背部朝上，用非优势手的手指提起胸部区域的皮肤，用剪刀在提起的皮肤处做一剪口。
6. 双手分别握住切口两端，小心地从背部向腹部方向撕开皮肤，持续拉开直至切口两端在腹部相遇。
7. 将小鼠翻转为腹部朝上，一手将下半身皮肤向下拉向腿部，继续向后拉伸皮肤直至双腿暴露。
8. 握住小鼠....

结果

该方法主要步骤的流程图见图1。不同培养时间下骨髓培养物的细胞密度和形态见图2。培养第1天时，细胞体积较小且分布稀疏；到第3天时，细胞数量增多，部分细胞体积增大，少数细胞已开始贴壁。至第6天，可明显区分出贴壁细胞和非贴壁细胞两个组分（图2A）。培养第7至10天可收获细胞，其中第10天CD11c⁺细胞的比例更高。图2B展示了第7天收获前的培养物，以及分离得到的贴壁和非贴壁细胞组分。贴壁组分为经过轻柔洗涤去除非贴壁细胞后残留的细胞；非贴壁组分中富含具有树突状形态的细胞，这一点在图2B插图的数字放大图像中更为清晰。在去除非贴壁组分（第7天或第10天）后，按照前述方法，用针对关键细胞表面标志物的荧光标记抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。图3展示了培养第7天和第10天非贴壁细胞组分的代表性流式细胞术图谱。

讨论

在本文中，我们提供了一种改进自Lutz方法的实验方案，可通过单只小鼠骨髓培养同时获得GM-CSF诱导的巨噬细胞和树突状细胞。 等.⁶MHCII  表达和FL-HA结合能力可区分该培养体系中的未成熟树突状细胞与巨噬细胞（参见 图3C），这在以前一直难以实现。这一点，连同Helft的另一份报告 等.¹⁹，证明了此前被认为仅含有树突状细胞的GM-CSF诱导的骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养物中存在异质性。Helft 等.¹⁹ 使用了截然不同的培养条件来生成骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），但也同样发现了显著的巨噬细胞群体。GM-CSF诱导产生的巨噬细胞类似于肺泡巨噬细胞，而GM-CSF诱导的树突状细胞则类似于炎性树突状细胞；相比之下，添加FLT3配体的BMDC培养体系则产生经典的树突状细胞和浆细胞样树突状细胞^3,4也观察到不同的树突状细胞和巨噬细胞群体 体内 在稳态和炎症条件下，以及关于如何界定树突状细胞（DC）和巨噬细胞，该领域存在广泛.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
流式细胞仪	BD	LSR-II
全自动倒置显微镜	Leica	DMI4000 B
离心机	Thermo Fisher	ST-40R
生物安全柜	Nuaire	NU-425-600
1 ml 注射器	BD	309659
26½ 号针头	BD	305111
50 ml 锥形管	Corning	357070	*Falcon 品牌
Eppendorf 管（1.5 ml）	Corning	MCT-150-C
5 ml 聚苯乙烯圆底管	Corning	352052
解剖工具	Fine Science Tools	*多种	*解剖剪、Dumont 镊子和标准镊子
血细胞计数板	Reichert	1490
无菌 100 mm × 15 mm 培养皿	Corning	351029	*Falcon 品牌
2-巯基乙醇	Thermo Fisher	21985-023
氯化铵	BDH	BDH0208-500G
牛血清白蛋白	Fisher Bioreagents	BP1600-1
布雷菲德菌素 A	Sigma	B7651-5MG
EDTA	Sigma	E5134-1KG	乙二胺四乙酸
胎牛血清	Thermo Fisher	16000-044
汉克平衡盐溶液	Thermo Fisher	14175-095
HEPES	Thermo Fisher	15630-080	4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
L-谷氨酰胺	Sigma	G8540-100G
超纯 LPS	Invivogen	tlrl-3pelps
MEM 非必需氨基酸溶液	Thermo Fisher	11140-050
青霉素/链霉素 100 倍浓缩液	Thermo Fisher	15140-122
磷酸二氢钾	BDH	BDH0268-500G
氯化钾	BDH	BDH9258-500G
重组 GM-CSF	Peprotech	315-03-A
鸡冠来源透明质酸钠	Sigma	H5388-1G	*用于制备荧光标记的透明质酸
RPMI-1640	Thermo Fisher	21870-076	不含丙酮酸钠和谷氨酰胺。使用前将培养基预热至 37 °C。
氯化钠	Fisher	5271-10
磷酸氢二钠	Sigma	50876-1Kg
丙酮酸钠	Sigma	P5290-100G
三羟甲基氨基甲烷	Fisher Bioreagents	BP152-5
台盼蓝	Sigma	T8154
抗 Fc 受体抗体（未标记），组织培养上清液	N/A	N/A	克隆株：2.4G2
抗 CD11c PeCy7	eBioscience	25-0114-82	克隆株：N418
抗 Gr-1 efluor450	eBioscience	48-5931-82	克隆株：RB6-8C5
抗 MHCII APC	eBioscience	17-5321-82	克隆株：M5/114.15.2
生物素标记抗 MerTK 抗体	Abcam	BAF591	山羊多克隆 IgG
链霉亲和素 PE	eBioscience	12-4317-87
碘化丙啶	Sigma	P4170-25MG
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）	Sigma	D9542-5MG