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小鼠骨髓来源的GM-CSF诱导类肺泡巨噬细胞和树突状细胞的生成与鉴定

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DOI：

10.3791/54194

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2016年6月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Microbiology and Immunology, University of British Columbia

本文内容

摘要

在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下培养的骨髓细胞可形成包含巨噬细胞和树突状细胞（DCs）的异质性细胞群。本方法重点利用主要组织相容性复合物II类分子（MHCII）和透明质酸（HA）结合能力来区分GM-CSF培养体系中的巨噬细胞与树突状细胞。该培养体系中的巨噬细胞在诸多特性上与肺泡巨噬细胞相似。

摘要

巨噬细胞和树突状细胞（DCs）是存在于组织和淋巴器官中的天然免疫细胞，在抵御病原体方面发挥关键作用。然而，这些细胞难以大量分离，因而难以对其进行深入研究，因此， 体外 已开发出多种模型。 体外 骨髓来源的巨噬细胞和树突状细胞培养是免疫学研究中成熟且有价值的方法。本文介绍一种利用细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）从原代小鼠骨髓细胞的单一培养体系中同时培养并鉴定树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法。该方案基于Lutz最初建立的经典实验流程。 等1999年用于骨髓来源的树突状细胞（DCs）。该培养物具有异质性，使用MHCII和荧光素标记的透明质酸（FL-HA）来区分巨噬细胞与未成熟及成熟DCs。这些由GM-CSF诱导产生的巨噬细胞提供了方便的来源 体外 在表型和功能上均与肺泡巨噬细胞高度相似的衍生巨噬细胞。

引言

若干 体外 已有文献描述了使用一种或多种生长因子培养生成骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的方法。通过在培养体系中加入巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），可由骨髓细胞诱导生成BMDMs。1,2对于骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），在骨髓培养中添加FLT3配体可产生非黏附性的经典型和浆细胞样树突状细胞（CD11c高/MHCII高 和 CD11clo，B220+ 培养9天后3,4相比之下，仅在含有GM-CSF的培养条件下培养7至10天后产生的非贴壁细胞5,6，GM-CSF 和 IL-47，或 GM-CSF 和 FLT3 配体8,9 生成更类似于炎性树突状细胞（CD11c高，MHCII高 CD11b+)10. 尽管这些 体外 在利用培养物生成巨噬细胞或树突状细胞时，尚不明确每种培养条件是否均能产生纯细胞群体。例如，尽管GM-CSF培养物中的贴壁细胞通常被描述为巨噬细胞5同一培养物中的非贴壁细胞用作树突状细胞（DCs）6,11-13，假定它们是均一的，任何观察到的变异均源于发育阶段的差异14,15此外，研究发现粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是肺泡巨噬细胞发育所必需的生长因子 体内16,17，且可用于 体外 生成类肺泡巨噬细胞16,17,18.

除了贴壁性之外，使用GM-CSF处理骨髓培养以生成巨噬细胞和树突状细胞（DCs）的操作流程非常相似，这提示在GM-CSF诱导的骨髓培养物中可能存在异质性。事实上已有两篇论文报道，在骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养物的非贴壁组分中存在骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），支持了这一推测。其中一篇论文鉴定出一类细胞群体，其表型为CD11c+、CD11b+、MHCIImid、MerTK+和CD115+，基因表达谱最接近肺泡巨噬细胞，且激活T细胞的能力较弱19。另一篇论文则利用MHCII和FL-HA鉴定出一类表型和功能上均不同于未成熟树突状细胞（CD11c+、MHCIImid、FL-HAlow）和成熟树突状细胞（CD11c+、MHCIIhigh）的肺泡巨噬细胞样细胞群体（CD11c+、MHCIImid/low、FL-HAhigh）18。这两项研究均表明，GM-CSF诱导的BMDC培养物具有异质性，其中同时包含巨噬细胞和树突状细胞群体，因此在解读BMDC培养实验数据时应格外谨慎。

本方案描述了如何分离骨髓，用GM-CSF培养骨髓细胞，并通过FL-HA结合与MHCII表达，利用流式细胞术在骨髓培养物中鉴定出类似肺泡巨噬细胞的群体，从而区分未成熟和成熟树突状细胞。该方法基于Lutz建立的实验流程。 等.6 并能够产生 5 - 10 x 106 第7天10 ml培养体系中的非贴壁细胞。该培养体系在第7至10天可用，第7天可获得包括巨噬细胞、未成熟和成熟树突状细胞以及少量前体细胞在内的异质性细胞群体。该方法为培养和分离提供了简便途径 体外 大量肺泡样巨噬细胞

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方案

小鼠的安乐死操作严格遵循加拿大动物护理委员会（Canadian Council on Animal Care）关于伦理动物研究的指南，并经不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会批准的程序进行。

1. 从小鼠股骨和胫骨获取单细胞骨髓悬液

  1. 在操作开始前15分钟开启生物安全柜（BSC），以净化柜内空气并使气流稳定，随后用70%乙醇清洁/喷洒BSC表面。在整个实验过程中尽可能保持无菌状态。不得在非无菌条件下切割骨骼。
  2. 在BSC内准备好解剖工具，包括浸泡于70%乙醇中的解剖剪（1把）和镊子（2对）、含5%胎牛血清的Hank’s平衡盐溶液（HBSS-FCS）、无菌培养皿（100 mm × 15 mm）、1 ml注射器、26½号针头、锥形收集管（15 ml或50 ml）以及纸巾。
  3. 按照所在机构动物研究伦理委员会批准的程序处死小鼠，将其移入BSC中，放置在一张或两张纸巾上，并用70%乙醇喷洒小鼠体表。
  4. 在BSC内无菌打开一个无菌培养皿，将10 ml HBSS-FCS加入皿底，另取1–2 ml加入皿盖中。
  5. 将小鼠腹部朝下放置，背部朝上，用非优势手的手指提起胸部区域的皮肤，用剪刀在提起的皮肤处做一剪口。
  6. 双手分别握住切口两端，小心地从背部向腹部方向撕开皮肤，持续拉开直至切口两端在腹部相遇。
  7. 将小鼠翻转为腹部朝上，一手将下半身皮肤向下拉向腿部，继续向后拉伸皮肤直至双腿暴露。
  8. 握住小鼠足部，用剪刀在踝关节上方切断跟腱，并在胫骨下端切断连接肌肉与足部的韧带，从而使足部与腿骨分离。
  9. 一手握住腿部足端，用剪刀在股骨下端的膝关节周围剪断肌肉和韧带，以分离大腿肌肉与小腿。使用镊子轻轻将松脱的肌肉从腓骨和股骨表面移除。注意避免切断股动脉，以防大量出血。
  10. 一手握住足部，将打开的剪刀压在股骨上端的髋关节处，旋转腿部并轻轻拉出，同时用剪刀完成最后的切割，使腿部完全脱离身体。
  11. 从此步骤起，仅使用无菌镊子操作组织。一手握住腿部一端，另一手将足部拉下。
    注意：此操作不应使用过大力量，因为在步骤1.9中已切断连接韧带。也可选择在踝关节上方骨骼融合处剪断胫骨。
  12. 用一对镊子夹住股骨远端，另一对镊子夹住胫骨和腓骨近端，小心地将胫骨和腓骨向膝关节相反方向弯曲，使其与股骨和髌骨分离。
  13. 用镊子向下拉除仍附着在小腿骨上的残余韧带和肌肉。在此过程中，用镊子将细小的腓骨及其结缔组织一并去除，因其过小无法用于骨髓细胞冲洗。将清理后的胫骨置于倒置的培养皿盖上。
  14. 用一对镊子夹住股骨下端，另一对镊子夹住髌骨，将髌骨及其周围组织向关节反方向弯曲以去除。随后用镊子清除股骨上残留的结缔组织，并将其放置于倒置的培养皿盖上。丢弃髌骨。
  15. 如有需要，对另一条腿重复步骤1.7–1.13。如需运输，可将骨骼转移至含有1 ml无菌HBSS-FCS的1.6 ml微量离心管中。
  16. 将骨骼置于倒置的培养皿盖上，加入1–2 ml HBSS-FCS，用镊子清除仍附着在胫骨和股骨上的任何残留组织，然后将骨骼转移至含有10 ml HBSS-FCS的培养皿底部。或者，也可使用浸有70%乙醇的擦拭纸清洁骨骼并去除附着的肌肉组织。
  17. 用剪刀将每根骨骼剪成两半。剪切时用无菌皿盖部分遮挡培养皿，以确保骨骼保留在皿内。或者，也可仅剪去每根骨骼的末端，以便下一步进行冲洗。
  18. 将26½ G针头连接至1 ml注射器，从培养皿中吸取1 ml HBSS-FCS。将针头插入骨段的一端，冲洗出骨髓细胞（骨骼内部柔软的红色组织）。将针头插入骨头部及开放端，直至所有红色骨髓被完全冲出。观察骨骼变为白色。
  19. 将任何可见的骨髓团块通过注射器反复吹打数次，以形成单细胞悬液。
  20. 丢弃已冲洗过的骨骼。使用10 ml移液器充分混匀细胞悬液，并转移至收集管中。用5 ml HBSS-FCS冲洗培养皿一次，以收集皿内残留的细胞。将细胞置于冰上。
    注意：骨髓细胞悬液若在4 °C保存2–3小时，仍保持活性。

2. 骨髓细胞（BMCs）的铺板与培养

  1. 准备以下试剂和耗材。
    1. 通过配制含有0.84%氯化铵的溶液，并用2 mM Tris（pH 7.2）定容，制备红细胞（RBC）裂解缓冲液，然后经0.2微米滤膜过滤除菌。
    2. 在RPMI 1640培养基中加入10% FCS、20 mM HEPES、1×非必需氨基酸、55 µM 2-巯基乙醇、50 U/ml青霉素和链霉素、1 mM丙酮酸钠以及2 mM L-谷氨酰胺，制备BMC培养基。
    3. 获取市售的重组GM-CSF，或使用转染了GM-CSF基因的AG8.653骨髓瘤细胞所产生的含GM-CSF的上清液20。通过ELISA测定上清液中GM-CSF的浓度，并将其调整至相当于20 ng/ml的终浓度加入BMC培养基中。
  2. 将骨髓细胞在314 × g条件下离心5分钟。沉淀呈红色，源于红细胞。在生物安全柜中，使用连接真空泵的无菌玻璃巴斯德吸管吸除上清液，轻敲管壁使沉淀松散，然后加入10 ml RBC裂解缓冲液。涡旋振荡以重悬细胞，并在室温下裂解5分钟。
  3. 加入10 ml HBSS-FCS，然后在314 × g条件下离心5分钟，吸除上清液。观察细胞沉淀应呈白色。用所需体积的BMC培养基重悬细胞。
  4. 用0.4%台盼蓝染色死细胞后，使用血细胞计数板对重悬的细胞进行计数。
    注意：若使用单侧后肢（单根胫骨和股骨）的骨髓组织，将其重悬于5 ml BMC培养基中，取10 µl细胞悬液与70 µl 0.4%台盼蓝混合，充分混匀后取10 µl 1/8稀释的细胞悬液加入血细胞计数板计数室。计数四个象限中的活细胞数：四个象限平均细胞数 × 稀释倍数 × 104 = 每毫升细胞数。单侧股骨和胫骨经红细胞裂解后通常可获得约2–4 × 107个细胞。
  5. 根据培养结束时实验所需的总细胞数量，估算下游实验所需10 ml培养皿的数量。
    注意：每个培养皿初始接种需2 × 106个骨髓细胞，第7天可收获5–10 × 106个细胞。
    1. 将用于接种的总细胞数分装至新离心管中，在314 × g条件下离心5分钟，吸除上清液，然后用BMC培养基重悬细胞至浓度为4 × 106个细胞/ml。
  6. 准备一个新的无菌100 mm × 15 mm培养皿，加入含200 ng GM-CSF（重组蛋白或含GM-CSF的上清液）的9.5 ml BMC培养基。将500 µl浓度为4 × 106个细胞/ml的骨髓细胞悬液加至培养皿中央，使终浓度为2 × 105个细胞/ml（总体积10 ml）。
    注意：必须使用无菌培养皿而非组织培养皿。加细胞时应确保细胞集中在中央区域，并在接种后及换液过程中尽量减少对培养皿的扰动。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。此为培养第0天。
  7. 第3天，向每皿细胞中加入含200 ng GM-CSF的新鲜BMC培养基10 ml。操作时注意尽量减少对悬浮细胞团的扰动。此时细胞培养总体积为20 ml。
  8. 在100倍光学显微镜下观察细胞。可见大量非贴壁细胞（圆形）和少量贴壁细胞（扁平状）。可见三到四个细胞聚集呈花瓣状结构，提示细胞正在增殖。
  9. 第6天进行半量换液。小心移出10 ml培养基至无菌50 ml锥形管中，在314 × g条件下离心5分钟，吸除并弃去上清液。
  10. 将细胞沉淀用含20 ng/ml GM-CSF的10 ml新鲜BMC培养基重悬，轻轻涡旋混匀后加回原培养皿，使总体积恢复至20 ml。在显微镜下观察细胞状态。
    注意：第7天的培养物应达到70%或更高的融合度，表现为贴壁的扁平细胞及密集的圆形非贴壁细胞团。

3. 用于流式细胞术的骨髓来源树突状细胞和巨噬细胞的收集与制备

  1. 所有缓冲液均需保持在 4 °C。
  2. 在第 7 天至第 10 天收获细胞。收获细胞时，首先将 10 ml 培养上清液转移至 50 ml 锥形收集管中，然后将培养皿垂直倾斜约 30 度，用移液器将剩余的 10 ml 培养液从培养皿顶部冲洗培养皿表面。重复此冲洗步骤 5 次，每次旋转培养皿约三分之一圈。
  3. 将剩余的 10 ml 细胞悬液转移至同一收集管中，弃去培养皿及贴壁细胞。
    注意： 此冲洗步骤可去除非贴壁细胞及松散贴壁的细胞；而扁平贴壁的细胞对冲洗具有抗性。通常，在第 7 天时每块培养皿可获得 5 - 10 × 106 个非贴壁细胞，第 10 天时为 2 - 5 × 106 个细胞，尽管 Lutz et al. 报道在第 10 天可获得 10 × 106 个细胞。贴壁细胞通常不被收集。然而，若需将这些细胞与非贴壁细胞进行比较，可按以下方法收集：在去除非贴壁细胞后，向培养皿中加入 5 ml 含 0.7 mM EDTA 的 1×PBS（pH 7.4），37 °C 孵育 5 分钟，用移液器反复吹打以去除贴壁细胞，并收集至另一独立离心管中。
  4. 将收集的细胞在 314 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。用 5 ml 4 °C 的无菌 BMC 培养基重悬细胞，轻轻涡旋混匀，使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞计数。
    注意： 每个培养皿在第 7 天的培养物中可获得 5 - 10 × 106 个非贴壁细胞。此后所有操作均需在 4 °C 下进行。
  5. 进行流式细胞术分析时，将每个样本的 2 × 105 个细胞转移至 5 ml 聚苯乙烯圆底管中，向每个样本加入 300 µl 4 °C 的 FACS 缓冲液（1×磷酸盐缓冲液，2 mM EDTA，2% 牛血清白蛋白）。
  6. 在 314 × g 离心 5 分钟后吸除上清液。观察管底可见白色不透明的细胞沉淀。
  7. 用 100 µl 未标记的 Fc 受体抗体重悬细胞，以阻断 Fc 受体结合（使用 2.4G2 杂交瘤细胞系培养上清液的 1/10 稀释液），4 °C 孵育 20 分钟。然后向每个样本加入 300 µl FACS 缓冲液，轻轻涡旋混匀，再在 314 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。
  8. 用 100 µl 抗体混合液重悬细胞，其中 CD11c-PeCy7 浓度为 0.2 µg/ml，Gr1-Pacific Blue 浓度为 0.25 µg/ml，MHCII-APC 浓度为 0.05 µg/ml，FL-HA 浓度约为 2 µg/ml，用于鉴定巨噬细胞和树突状细胞（DCs）。
    注意： FL-HA 由本实验室制备，使用荧光素与鸡冠透明质酸钠盐，方法如前所述21。
  9. 4 °C 孵育 20 分钟，使抗体结合细胞表面。向每个样本加入 300 µl FACS 缓冲液，轻轻涡旋混匀，然后在 314 × g、4 °C 离心 5 分钟，吸除上清液。 注意： 若在步骤 3.8 中使用了生物素标记的抗体，则需重复步骤 3.8 - 9，并加入荧光标记的链霉亲和素。
  10. 用另外 300 µl FACS 缓冲液洗涤细胞，轻轻涡旋混匀后在 314 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将细胞重悬于 200 µl 含 0.1 - 0.2 µg/ml 碘化丙啶（propidium iodide）或 DAPI 的 FACS 缓冲液中，以标记死细胞。细胞现可进行流式细胞术分析22。
    注意： 有关细胞群体的具体信息及设门策略，请参见结果部分及图 3。

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结果

该方法主要步骤的流程图见图1。不同培养时间下骨髓培养物的细胞密度和形态见图2。培养第1天时，细胞体积较小且分布稀疏；到第3天时，细胞数量增多，部分细胞体积增大，少数细胞已开始贴壁。至第6天，可明显区分出贴壁细胞和非贴壁细胞两个组分（图2A）。培养第7至10天可收获细胞，其中第10天CD11c+细胞的比例更高。图2B展示了第7天收获前的培养物，以及分离得到的贴壁和非贴壁细胞组分。贴壁组分为经过轻柔洗涤去除非贴壁细胞后残留的细胞；非贴壁组分中富含具有树突状形态的细胞，这一点在图2B插图的数字放大图像中更为清晰。在去除非贴壁组分（第7天或第10天）后，按照前述方法，用针对关键细胞表面标志物的荧光标记抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。图3展示了培养第7天和第10天非贴壁细胞组分的代表性流式细胞术图谱。

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讨论

在本文中，我们提供了一种改进自Lutz方法的实验方案，可通过单只小鼠骨髓培养同时获得GM-CSF诱导的巨噬细胞和树突状细胞。 等.6MHCII  表达和FL-HA结合能力可区分该培养体系中的未成熟树突状细胞与巨噬细胞（参见 图3C），这在以前一直难以实现。这一点，连同Helft的另一份报告 等.19，证明了此前被认为仅含有树突状细胞的GM-CSF诱导的骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养物中存在异质性。Helft 等.19 使用了截然不同的培养条件来生成骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），但也同样发现了显著的巨噬细胞群体。GM-CSF诱导产生的巨噬细胞类似于肺泡巨噬细胞，而GM-CSF诱导的树突状细胞则类似于炎性树突状细胞；相比之下，添加FLT3配体的BMDC培养体系则产生经典的树突状细胞和浆细胞样树突状细胞3,4也观察到不同的树突状细胞和巨噬细胞群体 体内 在稳态和炎症条件下，以及关于如何界定树突状细胞（DC）和巨噬细胞，该领域存在广泛...

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披露

作者无经济利益冲突。

致谢

本工作由加拿大卫生研究院（CIHR）（资助号 MOP-119503）和加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）资助。NSERC 还为 Y.D. 和 A.A. 提供了暑期学生奖学金。YD 获得英属哥伦比亚大学（UBC）四年期博士后奖学金资助，A.A. 获得加拿大卫生研究院（CIHR）研究生硕士奖学金（CGS-M）资助。我们感谢 Calvin Roskelley 在生成图2图像所用显微镜方面提供的协助。同时感谢 UBC 动物实验中心和流式细胞仪设施提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
流式细胞仪BD LSR-II
全自动倒置显微镜 Leica DMI4000 B
离心机 Thermo FisherST-40R
生物安全柜NuaireNU-425-600
1 ml 注射器BD309659
26½ 号针头BD305111
50 ml 锥形管 Corning357070*Falcon 品牌
Eppendorf 管（1.5 ml）CorningMCT-150-C
5 ml 聚苯乙烯圆底管Corning352052
解剖工具Fine Science Tools *多种 *解剖剪、Dumont 镊子和标准镊子 
血细胞计数板 Reichert1490
无菌 100 mm × 15 mm 培养皿Corning351029*Falcon 品牌
2-巯基乙醇Thermo Fisher21985-023
氯化铵BDHBDH0208-500G
牛血清白蛋白Fisher BioreagentsBP1600-1
布雷菲德菌素 ASigmaB7651-5MG
EDTASigmaE5134-1KG乙二胺四乙酸
胎牛血清Thermo Fisher16000-044
汉克平衡盐溶液Thermo Fisher14175-095 
HEPESThermo Fisher15630-0804-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
L-谷氨酰胺SigmaG8540-100G
超纯 LPSInvivogentlrl-3pelps
MEM 非必需氨基酸溶液 Thermo Fisher11140-050
青霉素/链霉素 100 倍浓缩液Thermo Fisher15140-122
磷酸二氢钾BDHBDH0268-500G
氯化钾BDHBDH9258-500G
重组 GM-CSFPeprotech315-03-A
鸡冠来源透明质酸钠 SigmaH5388-1G*用于制备荧光标记的透明质酸
RPMI-1640 Thermo Fisher21870-076不含丙酮酸钠和谷氨酰胺。使用前将培养基预热至 37 °C。
氯化钠Fisher 5271-10  
磷酸氢二钠Sigma50876-1Kg
丙酮酸钠SigmaP5290-100G
三羟甲基氨基甲烷Fisher BioreagentsBP152-5
台盼蓝SigmaT8154
抗 Fc 受体抗体（未标记），组织培养上清液N/AN/A克隆株：2.4G2
抗 CD11c PeCy7eBioscience25-0114-82克隆株：N418
抗 Gr-1 efluor450eBioscience48-5931-82克隆株：RB6-8C5
抗 MHCII APCeBioscience17-5321-82克隆株：M5/114.15.2
生物素标记抗 MerTK 抗体AbcamBAF591山羊多克隆 IgG
链霉亲和素 PEeBioscience12-4317-87
碘化丙啶SigmaP4170-25MG
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）SigmaD9542-5MG

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