本方案描述了联合近红外荧光（NIRF）成像与微型计算机断层扫描（microCT）技术用于可视化脑血栓栓塞的应用。该技术可实现对血栓负荷及其演变过程的定量分析。NIRF成像技术可用于观察离体脑组织中荧光标记的血栓，而microCT技术则利用金纳米颗粒在活体动物体内实现血栓的可视化。
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摘要
摘要
直接血栓成像可直观显示血栓栓塞性梗死的根本原因。相较于依赖间接测量方法，直接成像血栓能够更深入地研究卒中机制，并将成为一种强大而可靠的血管研究工具。我们采用一种光学成像方法，利用分子影像血栓标志物对血栓进行标记—— 一种Cy5.5近红外荧光（NIRF）探针，该探针在血栓成熟过程中，通过活化凝血因子XIIIa对纤维蛋白的交联酶促作用，共价结合于血栓中的纤维蛋白链上。一种基于显微计算机断层扫描（microCT）的方法则利用靶向血栓主要成分——纤维蛋白的金纳米颗粒（AuNPs），该纳米颗粒经功能化修饰以特异性识别血栓。本文描述了一种联合使用的详细实验方案 体内 microCT 和 离体 小鼠栓塞性卒中模型中血栓栓塞的近红外荧光成像。我们表明 体内 microCT 和靶向纤维蛋白的甘油基壳聚糖金纳米颗粒（fib-GC-AuNPs）可用于同时可视化 原位 血栓和脑栓塞性血栓。我们还描述了以下用途 体内 基于microCT的直接血栓成像用于连续监测组织型纤溶酶原激活剂介导溶栓治疗的疗效。在最后一次成像后，我们通过 离体 近红外荧光成像技术用于检测脑内残留血栓栓塞的范围与分布。最后，我们描述了对显微CT和近红外荧光成像数据进行的定量图像分析。这种直接血栓成像的联合技术可实现两种独立的血栓可视化方法之间的比较：基于血栓相关荧光信号区域的 离体 近红外荧光成像与高密度微计算机断层扫描血栓体积的比较 体内.
引言
每6人中就有1人会在一生中的某个阶段发生中风。缺血性中风是最常见的中风类型，约占所有中风病例的80%。由于大多数缺血性中风由血栓栓塞引起，因此人们对血栓的直接成像技术日益关注。
据估计，在大脑中动脉闭塞的每分钟内约有200万个脑细胞死亡1，从而提出了这一口号 "时间就是大脑"计算机断层扫描（CT）检查可快速完成且广泛可用；因此，CT 仍是超急性期缺血性卒中初始诊断和治疗的首选影像学方法。CT 在指导关键的早期决策方面尤为有价值，包括是否给予组织型纤溶酶原激活剂（tPA）进行溶栓治疗，以及是否将患者分诊至血管内取栓治疗。2然而，目前基于CT的血栓成像技术尚无法对脑部血栓栓塞进行连续追踪 体内，因为它采用间接方法来显示血栓：通过碘化对比剂使血池显影后，血栓表现为血管内的充盈缺损。反复使用碘化对比剂存在剂量限制和相关风险，因此不宜采用此种方法进行多次血栓成像。
因此，迫切需要一种针对卒中患者脑血栓的直接成像方法，以实现更快速、更准确的治疗决策。我们建议通过使用一种靶向血栓的纳米颗粒分子成像剂，提升目前临床用于卒中一线成像的CT技术的价值，从而实现这一目标。
我们已通过微计算机断层扫描（microCT）展示了该显像剂的使用，microCT 是一种高分辨率的 CT 成像技术，可用于离体（ex....
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方案
本方案中涉及的所有动物实验操作均已通过东国大学一山医院动物护理与使用委员会的审查和批准，并依照《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》中规定的原则和程序进行。
1. 荧光标记的外源性血栓制备（图1）
- 使用3%异氟烷与30%氧气（1.5 L/min纯氧）在诱导室中麻醉小鼠。通过观察肌肉张力并确认脚趾夹捏反射消失，以确保麻醉深度足够。
- 将动物俯卧置于无菌手术巾上，通过吸入式面罩持续给予2%异氟烷与30%氧气以维持麻醉状态。所有操作均需采用无菌技术，并穿戴无菌手术衣、口罩、手套及使用无菌器械。在操作前后，使用70%酒精清洁和消毒实验区域，以维持无菌环境。
- 经心脏穿刺采集约300 ~ 1,000 µl动脉血6。取70 µl全血与30 µl C15探针5（浓度为20 µmol/L）混合，该Cy5.5荧光探针可特异性响应活化凝血因子XIII（FXIIIa）的纤维蛋白交联活性，从而对血凝块进行荧光标记（图1A）。使用3 ml注射器（23号针头）将混合血液注入一段20 cm长的聚乙烯管（PE-50，内径0.58 mm）中。 聚乙烯管必须经过灭菌处理（或由制造商提供灭菌认证），且血凝块的制备必须在组织培养罩内无菌操作完成。
- 通过观察呼吸和心跳完全停止，确认动物死亡。
- 将装有血液的管置于室温下静置2小时，随后在4 °C下保存22小时，并按先前报....
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结果
基线 microCT 图像，获取于 体内 在给予 fib-GC-AuNP（10 mg/ml， 300 µl)在栓塞性卒中发生后1小时，清晰地观察到大脑中动脉–大脑前动脉分叉区域的颈内动脉远端存在脑血栓图6）。随访的微CT成像显示，经生理盐水处理后，颈外动脉分叉处（COW）血栓无变化。然而，tPA处理显示出COW血栓逐渐溶解（蓝色箭头所示） 图6）。该发现表明，微计算机断层扫描（microCT）血栓成像可用于溶栓治疗的监测。血栓体积的影像学测量结果与组织学分析之间具有良好的一致性。 体内 CT密度与 离体 24小时时残余血栓的近红外荧光成像。请注意，由于纤维蛋白靶向金纳米颗粒对内源性血栓的标记作用，在微CT中呈现高密度区域，这些区域与近红外荧光信号区域高度共定位；后者是通过在栓塞性卒中发生前使用对凝血因子XIIIa介导的纤维蛋白交联活性敏感的Cy5.5荧光探针对外源性血栓进行标记而实现的，该过程反映了预形成血栓的成熟过程图6
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讨论
我们展示了两种互补的分子成像技术在栓塞性卒中实验模型中用于直接血栓成像的应用：一种靶向纤维蛋白的金纳米颗粒（fib-GC-AuNP）用于 体内 基于microCT的成像，以及FXIIIa靶向光学成像探针 离体 荧光成像
静脉注射 fib-GC-AuNPs 后，由于颗粒表面的纤维蛋白靶向肽作用，颗粒经浓度梯度依赖性扩散进入血栓多孔结构并被截留，使血栓在CT下呈现为致密的可见结构。 即， 血栓。这一过程似乎仅单向发生，迅速使血液中相对较低浓度的纳米颗粒在血栓中富集，并显著改变其CT密度，从而实现检测。最终 体内 24小时时的microCT成像与死后NIRF成像结果具有良好的相关性 离体 脑组织，显示初始血栓在被置入脑动脉前已通过识别FXIIIa纤维蛋白交联活性的光学探针进行荧光标记，经tPA治疗后仍残留。通过这种方式，两种分子成像探针利用不同的作用机制和成像方式，相互报告并交叉验证彼此的结果。
血栓的演变过程可采用相同方法进行监测；具体而言，.......
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披露
D-E.K.、J-Y.K.、C-H.A. 和 K.K. 是靶向纤维蛋白的金纳米颗粒专利持有人（10-1474063-0000，韩国知识产权局）。其余作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由韩国医疗技术研究与发展项目（Korea Healthcare Technology R&D 项目，日本厚生劳动省（HI12C1847，HI12C0066），生物 &韩国国家研究基金会（由韩国政府资助）的医疗技术开发项目（2010-0019862）和全球研究实验室（GRL）项目（NRF-2015K1A1A2028228）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| microCT | NanoFocusRay, 全州, 韩国 | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF 成像系统 | Roper-scientific, 图森, 亚利桑那州, 美国 | coolsnap-Ez | |
| 激光多普勒血流仪 | Perimed, 斯德哥尔摩, 瑞典 | PeriFlux System 5000 | |
| 手术显微镜 | Leica Microsystems, 首尔, 韩国 | EZ4HD | |
| 吸入麻醉机 | PerkinElmer, 马萨诸塞州, 美国 | XGI-8 | |
| 软件 | |||
| NFR 控制软件 | NanoFocusRay, 全州, 韩国 | NFR Polaris-G90 | microCT 控制软件 |
| Lucion | Infinitt, 首尔, 韩国 | Lucion | 三维重建成像软件 |
| Lab chart 7 | ADInstruments, 科罗拉多州, 美国 | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ 软件 | Wanye Rasband, NIH, 美国 | 1.49d | 图像分析 |
| 设备/仪器 | |||
| 输液泵 | Harvard, 马萨诸塞州, 美国 | pump 22(55-2226) | |
| 恒温毯 | Panlab, 巴塞罗那, 西班牙 | HB101 | |
| 便携式电凝器 | Daejong, 首尔, 韩国 | DJE-39 | |
| 脑切片模具 | Ted pella, 加利福尼亚州, 美国 | 15003 | 冠状切面 |
| PE-50 管 | Natsume, 东京, 日本 | SP-45(PE-50) | 内径 0.58 mm，外径 0.96 mm |
| PE-10 管 | Natsume, 东京, 日本 | SP-10(PE-10) | 内径 0.28 mm，外径 0.61 mm |
| 30 号针头 | sungshim-medical, 首尔, 韩国 | ||
| 注射器 | CPL-medical, 安山, 韩国 | 1 & 3 cc | |
| 纱布 | Panamedic, 天安, 韩国 | ||
| 胶带 | Scotch, 首尔, 韩国 | 3M-810 | |
| 显微镊子 | Fine Science Tools, 温哥华, 加拿大 | 11253-27 | Dumont #L5 |
| 显微剪刀 | Fine Science Tools, 温哥华, 加拿大 | 15000-03 | Vannas 弹簧剪 |
| 剪刀 | Fine Science Tools, 温哥华, 加拿大 | 14084-08 | 8.5 cm |
| 黑色丝线缝合线 | Ailee, 釜山, 韩国 | SK6071, SK728 | 6-0 和 7-0 |
| 试剂 | |||
| 美洛昔康 | Yuhan, 首尔, 韩国 | ||
| 兽用软膏 | Novartis, 巴塞尔, 瑞士 | ||
| 10% 聚维酮碘（贝塔碘） | Firson, 天安, 韩国 | ||
| FeCl3 | Sigma, 密苏里州, 美国 | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, 俄亥俄州, 美国 | 0765-100g | |
| 异氟烷 | Hana-Pham, 京畿道, 韩国 | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, 大邱, 韩国 | LB001-02 | 500 ml |
| 金纳米颗粒 | 合成 | ||
| C15 光学造影剂 | 合成 | ||
| 组织型纤溶酶原激活剂 | Boehringer Ingelheim, 比伯拉赫, 德国 | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| 生理盐水 | Daihan Pham, 首尔, 韩国 | 48N3AF3 | 20 ml |
参考文献
- Saver, J. L. Time is brain--quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
- Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
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重印与许可
